強精片對雷公藤所致不育癥大鼠精液質(zhì)量的影響及機制

曲曉偉，陳帝昂，李廣森，常德貴，張培海

(1鄭州人民醫(yī)院，鄭州 450003；2 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；4成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

強精片對雷公藤所致不育癥大鼠精液質(zhì)量的影響及機制

曲曉偉1，陳帝昂2，李廣森3，常德貴4，張培海3

(1鄭州人民醫(yī)院，鄭州 450003；2 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院；3 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；4成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

目的 探討益腎活血利濕中藥強精片對雷公藤所致不育癥大鼠精液質(zhì)量的影響及其機制。方法 實驗動物為50只雄性SD大鼠，10只作為空白組，另40只以雷公藤灌胃制作不育癥模型并隨機等分為模型組及強精片低、中、高劑量組，四組均予雷公藤20 mg/(kg·d)灌胃；強精片低、中、高劑量組同時分別予強精片58、105、233 mg/(kg·d)灌胃；空白組予等量生理鹽水灌胃；均1次/d。灌胃后4周檢測各組精液質(zhì)量、血清性激素水平及睪丸組織Cx43蛋白表達。結(jié)果 各強精片組精液質(zhì)量均好于模型組，血清睪酮水平及睪丸組織Cx43蛋白表達均高于模型組，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 益腎活血利濕中藥強精片可改善不育癥大鼠的精液質(zhì)量，其作用機制可能為調(diào)節(jié)血清睪酮水平及睪丸組織Cx43蛋白表達。

不育癥；精液質(zhì)量；強精片；中藥；性激素；細胞間隙連接蛋白；大鼠

近年來不孕不育的發(fā)病率呈不斷上升趨勢。歐洲泌尿?qū)W協(xié)會(EAU)指出，截止2013年，約15%夫婦在結(jié)婚1年內(nèi)不能懷孕，需干預(yù)性治療，其中約50%的夫婦被發(fā)現(xiàn)男方精液參數(shù)存在異常[1]。目前，西醫(yī)治療不育癥的臨床效果尚不令人滿意，而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在此方面具有一定的優(yōu)勢[2,3]。強精片是在成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑增精1號、增精顆粒基礎(chǔ)上優(yōu)選而成，主要作用為益腎活血利濕。2013年1月～2014年1月，本研究觀察了強精片對不育癥模型大鼠精液質(zhì)量的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機制，旨在為該藥用于不育癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：清潔級雄性SD大鼠50只，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供(川實動管質(zhì)第114號)，2.5～3個月齡，體質(zhì)量210～230 g。實驗期間飼養(yǎng)室溫度20～30 ℃，12 h光、12 h暗，自由攝食全價大顆粒飼料及飲水，馴養(yǎng)l周后備實驗用。實驗藥物及試劑：強精片由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供(批號：000613)，規(guī)格為0.35 g/片，100片/瓶。將強精片研末，并溶于1%的羧甲基纖維素鈉溶液(CMC-Na)中，配制成實驗所需濃度混懸液備用。雷公藤多甙片(以下稱雷公藤)由上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠生產(chǎn)(批號：990219)，規(guī)格為10 mg/片。將雷公藤研末，溶于1%的CMC-Na中，配制成濃度為2 mg/mL混懸液備用。睪酮(T)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成激素(LH)放射免疫分析試劑盒(天津德普生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，考馬斯亮藍染液(PA101，北京天根生化公司)，BA200 Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)，DYY-7C型轉(zhuǎn)印電泳儀器、DYCZ-24DN型電泳儀(北京六一儀器廠)，顯影定影液(日本柯達公司)，Gel-Pro Analyzer免疫印跡分析軟件(中國上海Informax Inc.)，Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)，WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(CASA)。1.2 不育癥模型制作及干預(yù) 取10只大鼠為空白組；取40只大鼠為造模組，制作不育癥模型[4～6]：以雷公藤混懸液(濃度2 mg/mL)灌胃，1次/d，連續(xù)3周。3周后兩組各隨機抽取10只行模型評價。造模組附睪精子密度、活力及活率均降低，與空白組比較有極顯著差異，說明模型大鼠睪丸及附睪功能障礙，生殖力降低，提示造模成功。驗證模型成功后，將40只模型大鼠隨機分為模型組及強精片低、中、高劑量組，各10只。四組均繼續(xù)予雷公藤20 mg/(kg·d)灌胃，同時強精片低、中、高劑量組分別予強精片58、105、233 mg/(kg·d)灌胃；另設(shè)空白組(10只)，予等量生理鹽水灌胃。灌胃均1次/d，共4周。實驗過程中各組大鼠均自由攝食、飲水。實驗過程中模型組2只、強精片高劑量組1只死亡。

1.3 相關(guān)指標觀察 各組于末次灌胃2 h行腹主動脈取血10 mL，室溫靜置30 min后，2 500 r/min離心25 min，取血清。摘取大鼠雙側(cè)睪丸，去除白膜及大血管，液氮凍存，并留取電鏡標本。

1.3.1 精液質(zhì)量檢測 摘取大鼠雙側(cè)睪丸即刻，參考俞莉春等[7]、商學(xué)軍等[8]收集檢測精液方法稍加改進，應(yīng)用擴散法收集附睪尾部精子。取附睪尾部放入37 ℃生理鹽水(提前預(yù)熱)3 mL中，剪碎組織，放置1～2 min，取精子混懸液，加入1 mL M199中，37 ℃恒溫水浴5 min，取適量加到預(yù)溫的血細胞計數(shù)板上，應(yīng)用WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)行精子質(zhì)量分析。將經(jīng)處理的精子混懸液涂于計數(shù)載玻片上，取4個視野，于2 min內(nèi)完成檢測。檢測指標：精子密度(1×106個/mL)、精子活力(%)、精子活率(%)。1.3.2 睪丸組織病理學(xué)觀察 睪丸組織行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.3 睪丸組織Cx43蛋白表達檢測 取各組液氮冷凍睪丸組織約100 mg，放入1 mL預(yù)冷的RIPA組織裂解液中，在玻璃勻漿器中勻漿破碎細胞，操作在冰上進行，每次勻漿約1 min，間隔5 min勻漿1次，共5次。4 ℃下放置2 h。4 ℃下12 000 r/min離心約5 min，取上清液。分裝少量上清液用于總蛋白濃度的測定，其余的加入等體積2×加樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，分裝后-20 ℃保存。依照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作：配置濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準液，用于標準曲線的繪制。參考使用說明，完成樣品的上樣、轉(zhuǎn)膜、NC膜的封閉與抗體孵化、顯影。在X線片機下對曝光后的X片照相，應(yīng)用Gel-Pro Analyzer4.0圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值參數(shù)進行測量計算。采用Gel-Pro Analyzer免疫印跡分析軟件對圖像多次檢測條帶OD值，取平均值。

1.3.4 血清性激素水平測定 采用放射免疫法測定各組血清T、FSH、LH。按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。多組比較采用單因素方差分析，方差齊性用LSD、S-N-K檢驗，方差不齊采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組精液質(zhì)量比較 見表1。

表1 各組精液質(zhì)量檢測結(jié)果比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與強精片低、中劑量組比較，●P<0.05。

2.2 各組睪丸組織病理學(xué)變化 空白組睪丸生精小管圓而飽滿，生精上皮完整，管壁生精細胞、支持細胞分層排列有序， 支持細胞間緊密連接，精原細胞致密規(guī)律排列，管腔內(nèi)見大量成熟精子，生精小管間見疏松間質(zhì)組織，間質(zhì)無充血水腫，無炎細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生。模型組睪丸生精小管管徑大小不一，管壁細胞減少，排列紊亂，生精上皮變薄，部分基底膜破裂溶解，初級、次級精母細胞和精細胞銳減，細胞間隙增大，支持細胞間連接變寬，部分管腔阻塞或塌陷，成熟精子消失，間質(zhì)水腫、輪廓不清。強精片各組生精小管基膜基本完整，管壁厚而圓，可見各個發(fā)育階段的生精細胞和支持細胞，管腔中有較多成熟的精子，間質(zhì)細胞成群分布于生精小管之間的疏松結(jié)締組織內(nèi)，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。2.3 睪丸組織Cx43蛋白表達 空白組、模型組及強精片低、中、高劑量組睪丸組織Cx43蛋白相對表達量分別為0.562 7±0.029 0、0.449 9±0.035 0、0.475 1±0.048 5、0.504 0±0.023 0、0.507 6±0.047 0，模型組與空白組比較P<0.05，強精片中、高劑量組與模型組比較，P均<0.05。見圖1。

注：BG為空白組；MG為模型組；QJPL/QJPM/QJPH分別為強精片低、中、高劑量組。

2.4 各組血清性激素水平 見表2。

表2 各組血清T、FSH、LH水平比較

注：與空白組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與強精片低、中劑量組比較，●P<0.01。

3 討論

強精片為臨床經(jīng)驗方藥增精1號、增精顆粒優(yōu)選而成，主要成分為人參、鹿角、當歸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿等，具有益腎活血利濕之功。前期相關(guān)研究表明，該經(jīng)驗方可增加附睪重量和管壁厚度，促進損傷附睪上皮恢復(fù)和上皮細胞的分泌，從而改善附睪精子成熟功能，提高精子質(zhì)量[9～11]；強精片的具體作用效果及機制尚不明了。且當前傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在此領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)尚不完善和系統(tǒng)，其改善精子質(zhì)量的作用機制尚不明晰，特別是對睪丸精子發(fā)生微環(huán)境等方面的研究尚不夠深入。

本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組精子密度、活力、活率明顯降低；強精片各組在用藥4周后精子密度、活力、活率均有提高，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，其中以高劑量組對精液質(zhì)量改善效果最為顯著，低劑量組與中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示強精片能夠改善精液質(zhì)量。本研究睪丸組織病理學(xué)結(jié)果顯示，強精片各組睪丸組織病理改變程度明顯輕于模型組，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。提示強精片可促進損傷附睪上皮恢復(fù)和上皮細胞分泌。

丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控系統(tǒng)作為人體內(nèi)重要的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是睪丸生理功能正常發(fā)揮的前提條件。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素刺激垂體分泌LH和FSH。睪丸間質(zhì)細胞在LH脈沖式釋放的生理刺激下連續(xù)不斷的生成和分泌T。T經(jīng)血液循環(huán)進入精曲小管，供精子生成所需。FSH隨著血液循環(huán)到睪丸，與精曲小管的支持細胞膜受體結(jié)合，刺激性激素結(jié)合蛋白(TBG)的生成，高濃度TBG使精曲小管腔內(nèi)的T濃度維持在較高的水平，可促進生殖細胞分化為成熟的精子[12]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸中睪酮的消除可導(dǎo)致生殖細胞凋亡的增加，證實睪酮可能具有細胞存活因子的功能，可阻止生殖細胞凋亡，亦表明男性體內(nèi)的睪酮是一種關(guān)鍵的生殖細胞存活因子[13]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤對血清性激素水平影響不大，但空白組相比模型組血清睪酮值明顯降低，與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果基本一致，這可能與雷公藤的灌胃濃度、灌胃次數(shù)及時間等因素有關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤在一定濃度下能夠抑制Sertoli細胞、Leydig細胞的細胞活性，這可能是雷公藤導(dǎo)致睪酮下降的原因之一[15]。本研究強精片各組血清睪酮明顯高于模型組，但各組血清FSH、LH水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，說明強精片可調(diào)節(jié)大鼠血清睪酮水平；其機制可能是通過擬性激素樣作用直接調(diào)控丘腦及垂體、抗氧化應(yīng)激、抑制生殖細胞衰老基因表達、激活性腺軸系統(tǒng)相關(guān)酶活性及促進激素分泌等方式，最終改善和調(diào)整性腺軸系統(tǒng)的器官形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而改善睪丸生精功能，提高生殖能力。

睪丸組織內(nèi)主要包括生精細胞、間質(zhì)細胞及支持細胞三種功能細胞。其中生精細胞為產(chǎn)生精子的“原料”，間質(zhì)細胞和支持細胞則輔助生精細胞生成精子，對精子的生成和睪丸正常功能的維持具有重要作用。睪丸支持細胞構(gòu)成血睪丸屏障、維持睪丸內(nèi)正常微環(huán)境，對生殖細胞起著支持和營養(yǎng)作用；睪丸間質(zhì)細胞則分泌雄激素等活性物質(zhì)以調(diào)節(jié)生殖功能。研究表明，這兩種細胞的作用與其細胞間的縫隙連接(GJ)功能密切相關(guān)。GJ是細胞間的一種特殊通道，溝通相鄰細胞的胞質(zhì)，介導(dǎo)細胞間直接的信號傳遞。GJ由特殊的連接蛋白組成，Cx43作為睪丸中表達最豐富的連接蛋白，是睪丸內(nèi)細胞間通信的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。睪丸支持細胞表達Cx43占90%以上；睪丸間質(zhì)細胞則僅表達Cx43。由Cx43組成的GJ介導(dǎo)睪丸支持細胞對生精細胞的支持和營養(yǎng)作用，對睪丸間質(zhì)細胞的內(nèi)分泌活動也起重要調(diào)節(jié)作用[16～18]。雷公藤能夠從RNA水平干擾Cx43蛋白的合成，降低生殖細胞Cx43蛋白表達量，影響生精細胞和其周圍體細胞間的代謝交換和內(nèi)分泌、旁分泌生長因子的傳遞，從而影響睪丸生殖功能[19]。本研究模型組睪丸組織內(nèi)Cx43蛋白表達量明顯下降，提示雷公藤可能通過抑制Cx43表達，影響了睪丸內(nèi)支持細胞、間質(zhì)細胞的功能以及支持細胞對生精細胞的調(diào)節(jié)。這與其他雷公藤生殖毒性機制的相關(guān)研究結(jié)果相符。本研究強精片中、高劑量組Cx43蛋白表達量明顯高于模型組，提示強精片能提高Cx43蛋白在睪丸組織內(nèi)的表達，但其對Cx43蛋白調(diào)節(jié)的具體分子機制，尚需后續(xù)研究進一步明確。

綜上所述，強精片可明顯改善不育癥大鼠的精液質(zhì)量，提高其生殖功能。推測其機制可能與調(diào)節(jié)血清睪酮水平及促進睪丸組織Cx43蛋白表達有關(guān)，尚有待進一步深入研究。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81302983)。

張培海(E-mail： zhangpeihai@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.008

R698.2

A

1002-266X(2017)20-0028-04

2016-03-24)