不同途徑感染白斑綜合征病毒 (WSSV)對(duì)日本沼蝦的致病性

殷嶸，郭媛媛，韋章良，施定基，何培民，賈睿

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不同途徑感染白斑綜合征病毒 (WSSV)對(duì)日本沼蝦的致病性

殷嶸1,2，郭媛媛1,2，韋章良3，施定基4，何培民1,2，賈睿1,2

1 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306 3 中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301 4 中國科學(xué)院植物研究所，北京 100093

殷嶸, 郭媛媛, 韋章良, 等. 不同途徑感染白斑綜合征病毒 (WSSV) 對(duì)日本沼蝦的致病性. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(6): 946–956.Yin R, Guo YY, Wei ZL, et al. Pathogenicity of white-spot syndrome virus in Macrobrachium nipponensis via different infection routes. Chin J Biotech, 2017, 33(6): 946–956.

日本沼蝦肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但其對(duì)白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV) 的易感性尚不明確。采用流行病學(xué)調(diào)查、感染試驗(yàn)和熒光定量PCR (qPCR) 等方法，研究了日本沼蝦對(duì)WSSV的易感性、感染發(fā)病率以及WSSV在其體內(nèi)的增殖情況。結(jié)果表明：日本沼蝦是WSSV的自然宿主，上海市附近省份地區(qū)120個(gè)樣本的自然攜帶率為8.33%。日本沼蝦可以通過注射、攝食、浸泡途徑感染W(wǎng)SSV，10 d內(nèi)累計(jì)感染率均為100%，累計(jì)死亡率分別為100%、75%和0%。其中注射途徑感染日本沼蝦，感染后5 d肌肉病毒含量達(dá)到感染后1 d的1 000倍，8 d死亡率達(dá)100%。用注射WSSV感染日本沼蝦死亡率來測量病毒致死日本沼蝦的半數(shù)致死劑量 (LD50)，2.71×105病毒粒子/μL能使日本沼蝦死亡率達(dá)到50%以上。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，日本沼蝦可以通過攝食感染W(wǎng)SSV的病蝦或死蝦而感染W(wǎng)SSV，也能通過浸泡在含WSSV的水體中而感染，并因此成為一種傳播媒介，從而影響了WSSV的迅速傳播與致病。

日本沼蝦，河蝦，白斑綜合征病毒，增殖，半數(shù)致死劑量

日本沼蝦，俗稱河蝦、青蝦，屬于節(jié)肢動(dòng)物門 (Arthropoda)、甲殼綱 (Crustacea)、十足目 (Decapoda)、長臂蝦科 (Palaemonidae)、沼蝦屬 ()[1]，是許多亞洲國家養(yǎng)殖的主要淡水品種之一[2-4]。我國日本沼蝦養(yǎng)殖區(qū)主要集中于長江中下游一帶[5-7]，2009年產(chǎn)量已超過20萬t，日本沼蝦已經(jīng)成為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類[8]。我國蝦類養(yǎng)殖品種眾多，養(yǎng)殖效益巨大，然而近年來蝦病頻繁暴發(fā)，已報(bào)道的蝦類疾病種類有白頭病、黑鰓病和軟體病等[9-12]，以及暴發(fā)快危害大的病毒病如：對(duì)蝦白斑綜合征病毒 (White spot syndrome virus，WSSV)、桃拉綜合癥病毒 (Taura syndrome virus，TSV)、傳染性皮下造血器官壞死病毒 (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV) 等[13]，給蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大災(zāi)難，尤其是WSSV，一旦暴發(fā)對(duì)蝦幾乎100%死亡，目前尚無有效藥物應(yīng)用。

WSSV于20世紀(jì)90年代初首先在我國臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)，WSSV在全球暴發(fā)按亞洲-美洲-歐洲-非洲的順序，據(jù)報(bào)道25個(gè)國家發(fā)生WSSV感染[14]。1992年WSSV從我國臺(tái)灣北部分離到后，已經(jīng)鑒定到它可感染18種對(duì)蝦、7種螯蝦、7種龍蝦、8種長臂蝦以及39種蟹[15-17]，涉及到我們常見的大部分蝦蟹類水產(chǎn)品[18]。其中，造成經(jīng)濟(jì)損失最大的是對(duì)蝦養(yǎng)殖。WSSV感染對(duì)蝦后，3?10 d內(nèi)其死亡率可達(dá)100%[19-20]，已成為全球養(yǎng)蝦業(yè)中蔓延最廣、傳播最快、死亡率最高的病毒。它感染宿主范圍很廣，在甲殼類和昆蟲綱動(dòng)物中均有其敏感的宿主[21-22]。另外有研究者[23]在浮游生物、?？⒖肺r、白蝦、毛蝦等動(dòng)物中也檢測出WSSV[24-27]。然而關(guān)于WSSV感染沼蝦方面的研究卻很少，雖有文獻(xiàn)對(duì)比過羅氏沼蝦、擬長腕沼蝦等對(duì)白斑綜合征病毒的抗性[28]，但目前還鮮有關(guān)于日本沼蝦是否能夠感染W(wǎng)SSV以及感染途徑、發(fā)病規(guī)律及病毒在其體內(nèi)增殖的研究。

為此，本研究通過qPCR以及流行病學(xué)調(diào)查方法，初步研究了日本沼蝦對(duì)WSSV的易感性、發(fā)病規(guī)律和WSSV在日本沼蝦體內(nèi)的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步豐富了白斑綜合征病毒對(duì)不同種類蝦的感染，同時(shí)也揭示日本沼蝦在養(yǎng)殖過程中是否感染W(wǎng)SSV及其感染過程，從而在日本沼蝦感染W(wǎng)SSV時(shí)可以采取有效的預(yù)防措施，為日本沼蝦的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 野生日本沼蝦體內(nèi)WSSV攜帶率調(diào)查

實(shí)驗(yàn)所用野生日本沼蝦收集于上海市附近省份地區(qū)，40尾/次。收集時(shí)間和日本沼蝦生長階段分別為：2015年11月，成蝦階段，雌雄比例為18∶22；2016年4月，幼體與幼蝦階段，雌性比例21∶19；2016年9月，幼蝦與成蝦階段，雌雄比例為23∶17。收集后置于–40 ℃凍存，隨后采用PCR方法檢測WSSV，計(jì)算WSSV攜帶率。

1.2 材料

感染所用日本沼蝦為養(yǎng)殖日本沼蝦，購買于上海市浦東新區(qū)古棕路市場。挑選個(gè)體健壯、附肢完整的日本沼蝦 (平均體長為(5.5±0.5) cm，平均體質(zhì)量為(1.8±0.2) g/尾) 暫養(yǎng)于長寬高分別為55 cm、45 cm和20 cm的室內(nèi)養(yǎng)殖箱中。對(duì)暫養(yǎng)的日本沼蝦進(jìn)行隨機(jī)取樣，經(jīng)PCR檢測為WSSV陰性。養(yǎng)殖用水為曝氣2 d的自來水，水溫控制在 (28±0.5) ℃，光暗比為12 h∶12 h。每日投喂飼料2次 (9:00與21:00)，并及時(shí)吸除殘餌和污物，每天換水1/3，24 h持續(xù)充氣。

PCR及qPCR實(shí)驗(yàn)所用各種試劑盒均購于天根生化科技 (北京) 有限公司。病毒定量緩沖液均購于生工生物 (上海) 公司。

1.3 病毒制備與定量

1.3.1 病毒材料制備

WSSV初始懸液來自于國家海洋局第三海洋研究所，懸液由WSSV提純方法[29]得到，濃度為2×108copies/μL。將病毒懸液按1∶100進(jìn)行稀釋，然后對(duì)健康克氏原螯蝦進(jìn)行注射感染。注射劑量為100 μL/尾[30]，注射部位為第3腹節(jié)處。收集瀕死克氏原螯蝦，保存于–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取人工注射接種WSSV瀕死的淡水克氏原螯蝦3尾 (在6?7 d瀕死的最佳)，剝離頭胸甲，去除肝胰腺，將剩余的所有組織稱重；并用剪刀剪碎于預(yù)冷的緩沖液PBS (pH 7.4) 1∶10 (/) 中，然后將剪碎的組織在10 000 r/min下高速勻漿5 s，重復(fù)勻漿3次；勻漿液在4 ℃、8 000×下離心5 min，上清液先過400目篩絹，再過0.45 μm濾膜過濾除菌，濾液分裝在新離心管中，全程在4 ℃或冰上進(jìn)行操作。病毒粗懸液可立即使用或是分裝成病毒保存液，–80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取上述提取病毒粗懸液對(duì)健康克氏原螯蝦進(jìn)行注射感染，收集大量感染病蝦保存于–80 ℃作為實(shí)驗(yàn)病毒材料待用。感染實(shí)驗(yàn)前重復(fù)上述步驟，對(duì)WSSV進(jìn)行活化后再使用。

1.3.2 病毒定量

取人工注射接種WSSV瀕死的淡水克氏原螯蝦6尾 (在6?7 d瀕死的最佳) ，參照秦崇濤等[31]的病毒提純方法，對(duì)WSSV進(jìn)行純化。提取過程中嚴(yán)格進(jìn)行梯度離心，直至獲得乳白色的WSSV懸液。然后，參照秦崇濤等定量測定WSSV懸液的方法，測定懸液的600，并參照公式：=600×6.79×108病毒粒子/μL，計(jì)算懸液WSSV濃度。

1.4 感染實(shí)驗(yàn)

1.4.1 注射感染

感染實(shí)驗(yàn)分2組，肌肉注射感染組和陰性對(duì)照各1組，每組2個(gè)重復(fù)，感染周期為10 d。將暫養(yǎng)4 d且攝食穩(wěn)定后的日本沼蝦隨機(jī)分成4箱，每箱30尾。肌肉注射感染部位為腹部第3腹節(jié)處，將病毒懸液 (600=0.4) 按1∶10稀釋注射病毒液50 μL/尾，注射劑量來自預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組以相同方法注射同等劑量TM緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，pH 7.4)。

1.4.2 口服 (攝食) 感染

感染實(shí)驗(yàn)分2組，口服感染組和陰性對(duì)照各1組，每組2個(gè)重復(fù)，感染周期為10 d。將暫養(yǎng)4 d且攝食穩(wěn)定后的日本沼蝦隨機(jī)分成4箱，每箱30尾?？诜腥痉椒橥段筗SSV感染后瀕死的克氏原螯蝦尾部肌肉；陰性對(duì)照組投喂WSSV陰性健康克氏原螯蝦尾部肌肉。投喂前進(jìn)行饑餓處理12 h，投喂當(dāng)天取5尾感染克氏原螯蝦，液氮下研磨并混勻，隨機(jī)取5個(gè)樣進(jìn)行病毒含量測定，為5.6×106copies/mg，余下部分進(jìn)行投喂。投喂量為體重的5%[32]，每天2次，連續(xù)投喂2 d，后改為投喂普通飼料。

1.4.3 浸泡感染

浸泡感染實(shí)驗(yàn)分2組，浸泡感染組和陰性對(duì)照各1組，每組2個(gè)重復(fù)，感染周期為10 d。將暫養(yǎng)4 d且攝食穩(wěn)定后的日本沼蝦隨機(jī)分成4箱，每箱30尾。將人工注射感染瀕死的克氏原螯蝦參照1.3.2中方法對(duì)WSSV進(jìn)行提純和定量。使水體中病毒達(dá)105病毒粒子/L，對(duì)日本沼蝦進(jìn)行浸泡攻毒4 h，陰性對(duì)照組添加同等劑量的TM緩沖溶液，然后轉(zhuǎn)移到新鮮水體中進(jìn)行培養(yǎng)觀察。

1.5 養(yǎng)殖管理

感染后，每日投喂普通適口餌料2次，并及時(shí)吸除殘餌和污物，每天換水1/3，24 h持續(xù)充氣，光暗比12 h∶12 h；每天觀察6次，及時(shí)去除死亡沼蝦并記錄。

1.6 病毒qPCR檢測

根據(jù)質(zhì)粒制備方法[33]制備WSSV標(biāo)準(zhǔn)品并將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋為107、106、105、104、103拷貝數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外按照DNA提取試劑盒使用說明，從20 mg尾部肌肉提取DNA作為qPCR模板。qPCR使用引物[34]為VP28- 140Fw (5′-AGG-TGT-GGA-ACA-ACA-CAT-CAA- G-3′) 和VP28-140Rv (5′-TGC-CAA-CTT-CAT- CCT-CAT-CA-3′)，長度為141 bp。qPCR反應(yīng)體系為20 μL：2 μL的各DNA稀釋模板，10 μL SYBR Green，0.6 μL各引物 (300 nmol/L)，6.8 μL無酶水。RT-PCR反應(yīng)在FTC-3000儀器上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。熒光值在延伸階段進(jìn)行采集。

1.7 病毒感染日本沼蝦的半數(shù)致死劑量(LD50)

為了測定日本沼蝦體內(nèi)增殖WSSV對(duì)其本身的半數(shù)致死劑量 (LD50)，將實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)感染組，1個(gè)陰性對(duì)照組，每組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)14尾蝦，所用日本沼蝦PCR檢測為WSSV陰性。收集注射感染實(shí)驗(yàn)組中死亡的日本沼蝦，然后對(duì)WSSV進(jìn)行提純和定量方法同上述1.3.2部分；定量后將病毒液進(jìn)行連續(xù)10倍的稀釋，稀釋倍數(shù)為100?105；然后對(duì)感染組每組日本沼蝦進(jìn)行病毒注射感染，注射部位為第3腹節(jié)處，劑量為50 μL/尾，陰性對(duì)照組注射同劑量的TM緩沖液；日本沼蝦的死亡率和臨床癥狀觀察周期為10 d，養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)同1.5部分。

1.8 數(shù)據(jù)處理

記錄各組日本沼蝦死亡數(shù)量，計(jì)算其死亡率并根據(jù)對(duì)照組死亡率進(jìn)行校正：

死亡率校正公式[35]：=(–)/(1–)

其中為死亡率，為實(shí)測死亡率，為對(duì)照組死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生日本沼蝦WSSV檢測

PCR檢測結(jié)果顯示 (表1)，每批日本沼蝦都有部分?jǐn)y帶WSSV，自然攜帶率約為8.33%，這些攜帶WSSV的日本沼蝦檢測結(jié)果為陽性和弱陽性，未出現(xiàn)強(qiáng)陽性樣本 (C值在20以內(nèi)或電泳條帶很亮)。此結(jié)果說明在自然環(huán)境中的日本沼蝦能夠攜帶WSSV，并因此使其處于潛伏感染狀態(tài)。病毒攜帶率和攜帶量與該疾病的暴發(fā)密切相關(guān)。

表1 野生日本沼蝦體內(nèi)感染W(wǎng)SSV的調(diào)查

Notes: –: negative; +: weak positive; ++: positive; +++: strong positive.

2.2 日本沼蝦口服感染W(wǎng)SSV

日本沼蝦口服經(jīng)WSSV感染的螯蝦組織后，48 h后出現(xiàn)了食欲減退、活動(dòng)量降低等癥狀，72 h內(nèi)還會(huì)進(jìn)行少量攝食，之后停止攝食，并出現(xiàn)了靜臥水體、反應(yīng)遲鈍等癥狀，隨后又出現(xiàn)了頭胸部腫脹和附肢脫落等癥狀，但日本沼蝦感染后至死亡一直未出現(xiàn)白斑癥狀。在84 h時(shí)出現(xiàn)了少量死亡，隨后在96?120 h時(shí)出現(xiàn)了大量死亡，然后死亡速度迅速下降，在192 h后未出現(xiàn)死亡狀況，10 d內(nèi)總體死亡率分別為76%和80%，陰性對(duì)照組至實(shí)驗(yàn)結(jié)束分別死亡1尾和2尾 (圖1)。通過提取死亡及未死亡日本沼蝦DNA，進(jìn)行PCR及電泳實(shí)驗(yàn)后表明未死亡日本沼蝦也已經(jīng)感染W(wǎng)SSV (圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日本沼蝦可以通過攝食感染W(wǎng)SSV的病蝦或死蝦而感染W(wǎng)SSV。

圖1 口服感染W(wǎng)SSV后日本沼蝦累計(jì)死亡數(shù)

圖2 口服WSSV病蝦后日本沼蝦WSSV檢測為陽性

2.3 日本沼蝦注射感染W(wǎng)SSV

定量注射WSSV病毒液后，24 h后日本沼蝦出現(xiàn)了食欲減退狀況，48 h后幾乎不進(jìn)行攝食，并出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、頭胸部腫脹等癥狀，隨后又出現(xiàn)了部分脫落癥狀，而且日本沼蝦感染后至死亡和口服感染一樣也一直未出現(xiàn)白斑癥狀。在感染48 h后出現(xiàn)了少量死亡，72 h時(shí)出現(xiàn)大量死亡，96 h時(shí)累計(jì)死亡量超過50%，隨后死亡速度下降，192 h時(shí)累計(jì)死亡率為100%，另外兩個(gè)陰性對(duì)照組至實(shí)驗(yàn)結(jié)束分別死亡2尾和4尾 (圖3)。取日本沼蝦的肌肉組織進(jìn)行定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，感染病毒24 h后肌肉組織中的WSSV含量隨著時(shí)間增加急劇增加，96 h后增長減緩，120 h瀕死的日本沼蝦肌肉內(nèi)WSSV含量是感染12 h時(shí)肌肉含量的1 000倍。研究結(jié)果表明，日本沼蝦注射感染W(wǎng)SSV后，病毒可以在日本沼蝦體內(nèi)迅速增殖，并且當(dāng)累計(jì)到一定量后可以導(dǎo)致日本沼蝦發(fā)病甚至 死亡。

圖3 注射感染W(wǎng)SSV后日本沼蝦累計(jì)死亡數(shù)

2.4 日本沼蝦浸泡感染W(wǎng)SSV

當(dāng)用105病毒粒子/L的水體浸泡日本沼蝦后，結(jié)果顯示，日本沼蝦在10 d的觀察期中均未出現(xiàn)死亡狀況，但均出現(xiàn)了食欲減退、活力降低的癥狀，并且其中2尾出現(xiàn)了靜臥趴伏不動(dòng)癥狀。10 d后，經(jīng)PCR結(jié)果顯示 (圖4)，日本沼蝦雖未出現(xiàn)死亡，但都已感染W(wǎng)SSV；其中靜臥趴伏不動(dòng)的2尾電泳條帶明顯較亮 (圖4中9、10泳道)。

2.5 WSSV的半數(shù)致死劑量(LD50)

圖4 浸泡WSSV粒子10 d后日本沼蝦WSSV檢測為陽性

圖5 日本沼蝦注射不同WSSV稀釋液后累計(jì)死亡率

3 討論

已有研究[36]表明WSSV宿主可以通過攝食和浸泡途徑感染白斑綜合癥，其感染的宿主十分廣泛，已鑒定到它可感染40種蝦、39種蟹。本研究結(jié)果表明，日本沼蝦是WSSV的自然宿主，它可以通過攝食感染W(wǎng)SSV的病蝦或死蝦而使WSSV通過消化道進(jìn)入血液并在其體內(nèi)增殖，也能通過浸泡在含WSSV的水體中通過腮和消化道而感染。因此越來越多的宿主通過水平傳播方式參與了WSSV的感染，同時(shí)由于當(dāng)下海水蝦蟹[37-38]的淡化養(yǎng)殖日益普及，將咸淡水中WSSV的宿主都并聯(lián)起來，極大地增加了WSSV傳播的可能性。所以，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中要充分考慮存在的各種WSSV宿主。

本研究結(jié)果顯示，口服感染組日本沼蝦在攝食WSSV病蝦組織后，第4天 (84 h) 時(shí)開始死亡，并且在第8天 (192 h) 時(shí)死亡率超過75%；注射感染組在注射病毒液后，第3天 (60 h) 時(shí)開始死亡，在第8天 (192 h) 時(shí)死亡率則達(dá)100%；另外，口服與注射兩組各自對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組死亡率分別為5%和10%，說明日本沼蝦可以通過攝食WSSV感染的病蝦而感染，WSSV的感染和快速增殖是日本沼蝦發(fā)病和死亡的決定因素。用含WSSV粒子水體浸泡日本沼蝦結(jié)果顯示，浸泡方式能夠引起其感染，這與戴俊逸等[39]研究認(rèn)為當(dāng)水體WSSV濃度達(dá)到103病毒粒子/L以上時(shí)能引起對(duì)蝦感染相符，但此濃度下10 d內(nèi)未能導(dǎo)致日本沼蝦死亡，這可能與水體病毒粒子濃度和感染方式有關(guān)。注射感染能使日本沼蝦迅速進(jìn)入急性感染狀態(tài)，這也被多位研究者證明[40-41]；攝食方式感染也能使日本沼蝦進(jìn)入急性感染狀態(tài)，但進(jìn)入急性感染狀態(tài)的時(shí)間比注射感染推遲1 d且死亡率未達(dá)100%，浸泡感染 (105病毒粒子/L) 方式使日本沼蝦進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)未出現(xiàn)死亡狀況，這3種途徑引發(fā)的不同死亡率現(xiàn)象可能與不同感染途徑引發(fā)的免疫機(jī)制和不同途徑下日本沼蝦對(duì)病毒的耐受能力有關(guān)。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，口服、注射及浸泡3種感染方式都未使日本沼蝦出現(xiàn)白斑癥狀；注射組在第192 h時(shí)累計(jì)死亡率才達(dá)到100%，而口服感染組死亡率則未達(dá)100%，與其他蝦類感染W(wǎng)SSV 48 h[42]頭胸甲處可見白斑和96 h[43]累計(jì)死亡可達(dá)100%不符。這可能與沼蝦對(duì)WSSV易感性低所致。WSSV的LD50經(jīng)常用于攻毒實(shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)通過一系列病毒稀釋液來確定日本沼蝦的LD50。日本沼蝦死亡率達(dá)100%稀釋倍數(shù)可以用于攻毒實(shí)驗(yàn)[44]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)SSV的稀釋倍數(shù)從100?102時(shí)致死率為100%，而103稀釋倍數(shù)時(shí)致死率為57.1%，所以推測半數(shù)致死劑量WSSV的稀釋倍數(shù)為103(1.26×105病毒粒子/μL)。因此，本研究建議WSSV的102稀釋倍數(shù) (2.71×106病毒粒子/μL) 可以作為以后日本沼蝦攻毒試驗(yàn)的病毒劑量。

目前尚無有效的藥物應(yīng)用于生產(chǎn)，主要以預(yù)防為主[45-47]。預(yù)防工作重點(diǎn)是針對(duì)其傳播方式切斷傳染源，同時(shí)優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，增強(qiáng)體質(zhì)，提高抗病力，從而預(yù)防感染以及防止WSSV從潛伏感染轉(zhuǎn)為急性暴發(fā)。WSSV的傳播途徑主要有2種：水平傳播、垂直傳播。另外本文研究以及大量研究表明[13,48]WSSV在注射、攝食、浸泡3種感染途徑中，注射感染是使WSSV直接進(jìn)入血液，口服是通過口腔-食道-胃途徑，而浸泡感染則是通過腮-血液以及口腔-食道-胃途徑。由于在自然條件下WSSV只會(huì)發(fā)生后兩者的感染，即經(jīng)口感染[49]，因此在生產(chǎn)預(yù)防工作中要重點(diǎn)切斷水平傳播途徑，做好監(jiān)測工作。監(jiān)測不但要注重食物來源的監(jiān)控，同時(shí)要密切關(guān)注對(duì)水體中病毒粒子的監(jiān)控，尤其后者往往會(huì)被忽略。另外在防治方面，目前有學(xué)者[50-51]從WSSV囊膜蛋白方面進(jìn)行免疫防治研究，也有比較顯著的防治效果。雖然現(xiàn)在還鮮有報(bào)導(dǎo)關(guān)于日本沼蝦暴發(fā)白斑綜合征的情況，但日本沼蝦作為WSSV的天然宿主，生產(chǎn)中依然要做好對(duì)該病的防范工作。另外本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)病的日本沼蝦均未出現(xiàn)WSSV特有的白斑癥狀，所以研究結(jié)果提醒在生產(chǎn)中判斷日本沼蝦是否感染W(wǎng)SSV需以科學(xué)的手段檢測，如果單憑白斑來判斷，則可能給生產(chǎn)帶來巨大損失。

[1] Zhang QY, Cheng QQ, Guan WB. Mitochondrial COI gene sequence variation and taxonomic status of threespecies. Zool Res, 2009, 30(6): 613–619.

[2] Hong YJ, Hu CY, Guan SF. Preliminary investigation onPoyang Lake resources. Res Fish, 2003, 23(3): 38–39 (in Chinese).洪一江, 胡成鈺, 官少飛. 鄱陽湖沼蝦資源的初步調(diào)查. 水利漁業(yè), 2003, 23(3): 38–39.

[3] Huang YL. China’s shrimp aquaculture overview. Res Fish, 2003, 23(1): 1–3 (in Chinese).黃玉玲. 我國蝦類淡水養(yǎng)殖概述. 水利漁業(yè), 2003, 23(1): 1–3.

[4] Kong YQ. Japanese prawn () physiology of juveniles of copper in health[D]. Shanghai: E Chin Normal Univ, 2014 (in Chinese).孔有琴. 日本沼蝦 () 幼蝦的銅營養(yǎng)生理研究[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2014.

[5] Li CC, Li Y, Xie QM, et al. Studies on the largest sustainable yield ofand its exploitation. Jiangxi Sci, 1990, 8(4): 28–33 (in Chinese).李長春, 李云, 謝欽銘, 等. 鄱陽湖蝦類資源最大持續(xù)產(chǎn)量及其開發(fā)利用的研究. 江西科學(xué), 1990, 8(4): 28–33.

生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)是高中生物學(xué)新課標(biāo)的基本宗旨與培養(yǎng)目標(biāo)，它集中體現(xiàn)了生物學(xué)學(xué)科的育人價(jià)值和實(shí)踐取向，是學(xué)生在生物學(xué)知識(shí)的學(xué)習(xí)過程中，逐漸形成的正確價(jià)值觀念、必備品格和關(guān)鍵能力。然而，生物學(xué)知識(shí)并不是一座“符號(hào)”的孤島，它產(chǎn)生于特定的歷史背景和社會(huì)情境，與個(gè)體和種系的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)相關(guān)聯(lián)，依存于生物學(xué)學(xué)科的邏輯體系之中。這就為開展關(guān)聯(lián)性教學(xué)奠定了基礎(chǔ)，也為發(fā)展和培育生物學(xué)核心素養(yǎng)創(chuàng)造了條件。關(guān)聯(lián)性教學(xué)注重與學(xué)生的社會(huì)生活經(jīng)驗(yàn)的聯(lián)系，強(qiáng)調(diào)新舊知識(shí)間的銜接，倡導(dǎo)在生命科學(xué)史的背景中體悟科學(xué)方法和精神，在跨學(xué)科的協(xié)同探究中培養(yǎng)科學(xué)思維和探究能力。

[6] Shi WG, Yan XM, Bing XW. Studies on biology and diet of Taihu Lake prawns. J Lake Sci, 1995, 7(1): 69–76 (in Chinese).施煒鋼, 嚴(yán)小梅, 邴旭文. 太湖秀麗白蝦生物學(xué)與食性的研究. 湖泊科學(xué), 1995, 7(1): 69–76.

[7] Jiang H, Xiao KY, He YL, et al. A preliminary survey of Hunan Yuanjiang southern Dongting Lake shrimp and crab resources. Res Fish, 2006, 26(5): 72–73 (in Chinese).江輝, 肖克宇, 何燕林, 等. 湖南沅江南洞庭湖蝦蟹資源的初步調(diào)查. 水利漁業(yè), 2006, 26(5): 72–73.

[8] Fishery Bureau of Ministry of Agriculture. China fishery yearbook. Beijing: Chin Agric Press, 2010: 37 (in Chinese).農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局. 中國漁業(yè)年鑒. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2010: 37.

[9] Xu Y, Shen JY, Yao JY, et al. Studies on pathogen of main diseases ofi in the Yangtze River Delta. Freshwater Fish, 2012(5): 27–32 (in Chinese).徐洋, 沈錦玉, 姚嘉赟, 等. 長三角地區(qū)羅氏沼蝦成蝦主要疾病的病原研究. 淡水漁業(yè), 2012(5): 27–32.

[10] Deng YH, Xiong GG, Zhou ZY, et al.prevention and treatment of common diseases and technology. Jiangxi Fish Sci Technol, 2002(2): 44–45 (in Chinese).鄧勇輝, 熊國根, 周智勇, 等. 羅氏沼蝦常見病及其防治技術(shù). 江西水產(chǎn)科技, 2002(2): 44–45.

[11] Wu HX, Xue JZ, Tang LY. Pathologicalblack branchiae disease study. Bull Sci Technol, 2002(1): 73–75 (in Chinese).吳惠仙, 薛俊增, 唐柳婭. 日本沼蝦黑鰓病的組織病理學(xué)研究. 科技通報(bào), 2002(1): 73–75.

[12] Kang L.drop star disease symptoms and prevention and control measures. Chin Fish Rep, 2015-08-24B02 (in Chinese).康樂. 羅氏沼蝦滴星病癥狀及防治措施. 中國漁業(yè)報(bào), 2015-08-24B02.

[13] Dai JY. Study on the invasion routes of white spot syndrome virus (WSSV) into shrimp [D]. Xiamen: Third Inst Oceanogr, State Oceanic Adm, 2012 (in Chinese).戴俊逸. 白斑綜合癥病毒 (WSSV) 侵染對(duì)蝦途徑的研究[D]. 廈門: 國家海洋局第三海洋研究所, 2012.

[14] Lightner DV. A hand book of shrimp pathology and diagnostic procedures for disease of cultured penaeid shrimp. Baton Rouge: Louisiana State Univ Press, 1996.

[15] Corbel V, Zuprisal Z, Shi Z, et al. Experimental infection of European crustaceans with white spot syndrome virus (WSSV). J Fish Dis, 2001, 24(7): 377–382.

[16] Lo CF, Ho CH, Peng SE, et al. White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Dis Aquat Org, 1996, 27(3): 215–225.

[17] Escobedo-Bonilla CM, Alday-Sanz V, Wille M, et al. A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus. J Fish Dis, 2008, 31(1): 1–18.

[18] Lei ZW, Huang J, Shi CY, et al. White spot syndrome virus (WSSV) of the host. Oceanol Limnol Sin, 2002, 3(3): 250–258 (in Chinese).雷質(zhì)文, 黃倢, 史成銀, 等. 白斑綜合癥病毒 (WSSV) 的宿主調(diào)查. 海洋與湖沼, 2002, 33(3): 250–258.

[19] Lo CF, Ho CH, Peng SE, et al. White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Dis Aquat Organ, 1996, 27(3): 215–225.

[20] Nakano H, Koube H. Mass mortalities of cultured Kuruma shrimp,, in Japan in 1993: epizootiological survey and infection trials. Fish Pathol, 1994, 29(2): 135–139.

[21] Soowannayan C, Phanthura M. Horizontal transmission of white spot syndrome virus (WSSV) between red claw crayfish () and the giant tiger shrimp (). Aquaculture, 2011, 319(1/2): 5–10.

[22] Rajendran KV, Vijayan KK, Santiago TC, et al. Experimental host range and histopathology of white spot syndrome virus (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobsters from India. J Fish Dis, 1999, 22(3): 183–191.

[23] Huang J, Yu J, Wang XH, et al. Detection of monoclonal antibody ELISA technique for hypodermal and hematopoietic necrosis disease pathogeny. Mar Fish Res, 1995, 16(1): 40–50 (in Chinese).黃倢, 于佳, 王秀華, 等. 單克隆抗體酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測對(duì)蝦皮下及造血器官組織壞死病的病及其傳播途徑. 海洋水產(chǎn)研究, 1995, 16(1): 40–50.

[24] He JG, Zhou HM, Yao B, et al. Infection route and host species of white spot syndrome baculovirus. J Sun Yat-sen Univ: Nat Sci Ed, 1999, 38(2): 65–69 (in Chinese).何建國, 周化民, 姚伯, 等. 白斑綜合癥桿狀病毒的感染途徑和宿主種類. 中山大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 1999, 38(2): 65–69.

[25] Sahul Hameed AS, Yoganandhan K, Sathish S, et al. white spot syndrome virus (WSSV) in two species of freshwater crabs (and). Aquaculture, 2001, 201(3/4): 179–186.

[26] Wang YC, Lo CF, Chang PS, et al. Experimental infection of white spot baculovirus in some cultured and wild decapods in Taiwan. Aquaculture, 1998, 164(1/4): 221–231.

[27] Chang PS, Chen HC, Wang YC. Detection of white spot syndrome associated baculovirus in experimentally infected wild shrimp, crab and lobsters by in situ hybridization. Aquaculture, 1998, 164(1/4): 233–242.

[28] Sahul Hameed AS, Murthi BLM, Rasheed M, et al. An investigation of Artemia as a possible vector for white spot syndrome virus (WSSV) transmission to. Aquaculture, 2002, 204(1/2): 1–10.

[29] Xie XX, Li HY, Xu XM, et al. A simple and efficient method for purification of intact white spot syndrome virus syndrome virus (WSSV) viral particles. Virus Res, 2005, 108(1/2): 63–67.

[30] Sun Y, Li F, Xiang J. Analysis on the dynamic changes of the amount of WSSV in Chinese shrimpduring infection. Aquaculture, 2013, s376–379(6): 124–132.

[31] Qin CT, Yang F. A simple and rapid method for the determination of white spot syndrome virus in Chinese white shrimp. Chin Agric Sci Bull, 2014, 30(20): 30–34 (in Chinese).秦崇濤, 楊豐. 一種簡單快速測定對(duì)蝦白斑綜合癥病毒濃度方法的建立. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(20): 30–34.

[32] Brett F, Edgerton. Susceptibility of the Australian freshwater crayfish Cherax destructor albidus to white spot syndrome virus (WSSV). Dis Aquat Org, 2004, 59(3): 187–193.

[33] Cheng XY, Liu QH, Huang J. Real time fluorescence quantitative PCR detection of white spot syndrome virus. Anhui Agric Sci, 2010, 38 (26): 14265–14267 (in Chinese).程曉艷, 劉慶慧, 黃倢. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒方法的建立. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(26): 14265–14267.

[34] Mendoza-Cano F, Sanchez-Paz A. Development and validation of a quantitative real-time polymerase chain assay for universal detection of the white spot syndrome virus in marine crustaceans. Virol J, 2013, 10(1): 186.

[35] Sun RY. Quantitative Pharmacology. Beijing: People’s Med Publ House, 1987: 184–208 (in Chinese).孫瑞元. 定量藥理學(xué). 北京:人民衛(wèi)生出版社, 1987: 184–208.

[36] Chou HY, Huang CY, Kou GH, et al. Studies on transmission of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) inandvia waterborne contact and oral ingestion. Aquaculture, 1998, 16(1/4): 263–276.

[37] Zheng SJ. Study on water quality regularity ofin desalination culture[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2006 (in Chinese).鄭善堅(jiān). 凡納濱對(duì)蝦淡化養(yǎng)殖水質(zhì)規(guī)律研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2006.

[38] Liu CL, Hu F. Serrata desalination culture test. Sci Fish, 2005(7): 29 (in Chinese).劉春玲, 胡方. 鋸緣青蟹淡化養(yǎng)殖試驗(yàn). 科學(xué)養(yǎng)魚, 2005(7): 29.

[39] Dai JY, Li WT, Yang F. Studies on the invasion routes of white spot syndrome virus (WSSV) into shrimp and virus titer. J Appl Oceanogra, 2013, 32(1): 67–72 (in Chinese).戴俊逸, 李文婷, 楊豐. 白斑綜合癥病毒(WSSV) 感染對(duì)蝦的途徑及滴度研究. 應(yīng)用海洋學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 32(1): 67–72.

[40] Phuoc LH, Corteel M, Thanh NC, et al. Effect of dose and challenge routes ofspp. on coinfection with white spot syndrome virus in. Aquaculture, 2009, 290(1/2): 61–68.

[41] Zhu F, Quan HZ. A new method for quantifying white spot syndrome virus: Experimental challenge dose using TaqMan real-time PCR assay. J Virol Methods, 2012, 184(1/2): 121–124.

[42] Dai JY. White spot syndrome virus (WSSV) infection of shrimp pathway[D]. Xiamen: Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, 2012 (in Chinese).戴俊逸. 白斑綜合癥病毒 (WSSV) 侵染對(duì)蝦途徑的研究[D]. 廈門: 國家海洋局第三海洋研究所, 2012.

[43] Zhang L, Tang XQ, Sheng XZ, et al. Analysis on dynamic changes of WSSV amount inthrough Quantitative Real-time PCR. Chin Anim Health Insp, 2015(6): 69–74 (in Chinese).張玲, 唐小千, 繩秀珍, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測克氏原螯蝦體內(nèi)白斑癥病毒(WSSV) 的動(dòng)態(tài)變化. 中國動(dòng)物檢疫, 2015(6): 69–74.

[44] Prior S, Browdy CL, Shepard EF, et al. Controlled bioassay systems for determination of lethal infective doses of tissue homogenates containing Taura syndrome or white spot syndrome virus. Dis Aquat Organ, 2003, 54: 89–96.

[45] Zhang MY. The pathogenesis and prevention of white spot syndrome in shrimp. J Aquac, 2013(2): 55 (in Chinese).張忙友. 對(duì)蝦白斑綜合癥的發(fā)病規(guī)律及防治方法. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2013(2): 55.

[46] Wu JW. Study on prevention and treatment of white spot syndrome of. Agric Jilin, 2011(3): 259 (in Chinese).吳俊文. 南美白對(duì)蝦白斑綜合癥防治技術(shù)探討. 吉林農(nóng)業(yè), 2011(3): 259.

[47] Xie KL. How to control the white spot syndrome of crawfish? Fish Guide to be Rich, 2016(14): 50–51 (in Chinese).謝康樂. 怎樣防治小龍蝦白斑綜合癥? 漁業(yè)致富指南, 2016(14): 50–51.

[48] Di Leonardo VA, Bonnichon V, Roch P, et al. Comparative WSSV infection routes in the shrimp generaand. J Fish Dis, 2005, 28(9): 565–569.

[49] Deng D, Liu P, Kong J. Medium mediators in the transmission of WSSV virus disease. Prog Fish Sci, 2004, 25(5): 35–41 (in Chinese).

[50] 鄧燈, 劉萍, 孔杰. 鹵蟲在WSSV病毒病傳播中的媒介作用. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展. 2004, 25(5): 35–41.

[51] Kulkarni A, Rombout JH, Singh IS, et al. Truncated VP28 as oral vaccine candidate against WSSV infection in shrimp: an uptake and processing study in the midgut of. Fish Shellfish Immunol, 2013, 34(1): 159–166.

[52] Valdez A, Yepiz-Plascencia G, Ricca E, et al. FirstWSSV 100% oral vaccination protection using CotC: Vp26 fusion protein displayed onspores surface. J Appl Microbiol, 2014, 117(2): 347–357.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Pathogenicity of white-spot syndrome virus invia different infection routes

Rong Yin1, 2, Yuanyuan Guo1, 2, Zhangliang Wei3, Dingji Shi4, Peimin He1, 2, and Rui Jia1, 2

1,,201306,2,201306,3,,,510301,,Institute of BotanyChinese Academy of SciencesBeijingChina

is delicious and has high economic value, but its susceptibility to white-spot syndrome virus (WSSV) is unknown. Susceptibility, morbidity, and multiplication of WSSV in.were studied by epidemiological survey, infection experiment and qPCR..was the natural host of WSSV, and the natural carrying rate was about 8.33%..could be infected with WSSV via oral administration, muscle injection and immersion, and the cumulative infection rate of 10 d exposure was 100%, and the cumulative mortality rates were 100%, 75% and 0%, respectively. The infection of WSSV is fast by muscle injection. The virus content after 5 day’s injection is 1 000 times higher than that of the first day of infection, and the mortality rate reached 100% after 8 days. The median lethal dose (LD50) measured as the mortality of infected.via injection indicated the LD50in the concentration ofWSSV of 2.71×105virions/μL. In shrimp farming,.can be infected by ingesting WSSV infected shrimp or dead shrimp, and also by soaking in WSSV-containing water and thus become a vector, consequently affecting the spread and pathogenicity of WSSV.

, river prawn, white spot syndrome virus (WSSV), proliferation, median lethal dose

10.13345/j.cjb.170005

January 6, 2017; Accepted:March 23, 2017

Rui Jia. Tel: +86-21-61900449; E-mail: rjia@shou.edu.cn

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA093506), Shanghai Science and Technology Committee (No. 16391903500).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2014AA093506)，上海市科委項(xiàng)目 (No. 16391903500) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-04-18

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170418.1111.002.html