CBA技術(shù)在菌陰結(jié)核病診斷中的運(yùn)用研究

劉 君，裴 豪，王 俊，戴亞萍，翟樺梓，陳玉梅

(無(wú)錫市第五人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫214005)

CBA技術(shù)在菌陰結(jié)核病診斷中的運(yùn)用研究

劉 君，裴 豪*，王 俊，戴亞萍，翟樺梓，陳玉梅

(無(wú)錫市第五人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫214005)

目的 評(píng)價(jià)CBA檢測(cè)經(jīng)特異抗原刺激后PBMC上清液中細(xì)胞因子濃度水平在菌陰結(jié)核病中的診斷價(jià)值。方法 將研究對(duì)象分為健康人群、肺炎患者、潛伏感染者和菌陰結(jié)核病患者四組，運(yùn)用CBA技術(shù)對(duì)PBMC刺激培養(yǎng)后的上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g和IL-17的濃度進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 菌陰結(jié)核病患者的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g分泌水平均高于健康人群和肺炎患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-4和IL-17無(wú)差異。 菌陰結(jié)核病患者組的IL-2低于潛伏感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TNF-a、IFN-g均高于潛伏感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-4、IL-6、IL-10、IL-17結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 CBA對(duì)PBMC刺激后上清液的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果能為菌陰結(jié)核病的診斷提供有效的依據(jù)，對(duì)于控制結(jié)核病疫情的發(fā)展，并實(shí)現(xiàn)最終消滅結(jié)核病的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)具有極其重要的意義。

菌陰肺結(jié)核；CBA技術(shù)；細(xì)胞因子檢測(cè)

(ChinJLabDiagn,2017,21:0983)

結(jié)核病是目前威脅全球公共衛(wèi)生的主要傳染病之一，全球有近三分之一人感染過(guò)結(jié)核病[1]。我國(guó)結(jié)核病的流行形勢(shì)非常嚴(yán)峻，被世界衛(wèi)生組織列為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的國(guó)家之一[2]。早發(fā)現(xiàn)早治療被認(rèn)為是控制結(jié)核病流行最好的方法，但是由于大部分菌陰肺結(jié)核患者沒有明確的細(xì)菌學(xué)證據(jù)，診斷十分困難，這將加大我國(guó)結(jié)核病流行控制的壓力。有效的菌陰肺結(jié)核診斷技術(shù)已成為當(dāng)前結(jié)核病控制的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[3]。本研究運(yùn)用CBA技術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)特異性抗原刺激后單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中多個(gè)細(xì)胞因子的變化進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)并分析結(jié)果以探討CBA技術(shù)在菌陰結(jié)核病診斷中的運(yùn)用價(jià)值，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 本實(shí)驗(yàn)將研究對(duì)象分為4組：其中菌陰肺結(jié)核患者和肺炎患者來(lái)自無(wú)錫市第五人民醫(yī)院2015年1月至12月收治的住院患者，健康人群和潛伏感染者來(lái)自本院體檢中心的體檢人群。菌陰肺結(jié)核組共57人(男30人、女27人)，平均年齡33.46±8.43歲；肺炎患者組30人(男16人、女14人)，平均年齡34.27±10.00歲；潛伏感染組40人(男18人、女22人)，平均年齡33.25±9.59歲；健康對(duì)照32人(男15人、女17人)，平均年齡32.47±11.27歲。以上所有研究對(duì)象均排除HIV感染、無(wú)糖尿病、無(wú)妊娠、無(wú)合并其他影響檢測(cè)指標(biāo)的疾病。

1.1.2 儀器和試劑 FC500型流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司、SW-CJ-2FD型凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司、ST-16型細(xì)胞離心機(jī)和HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Scientific有限公司、Th1/ Th2/ Th17細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD有限公司，CFP-10、ESAT-6抗原蛋白購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集和培養(yǎng) 于檢測(cè)當(dāng)天早上用肝素抗凝管采集患者空腹靜脈血5 ml，加入Ficoll分離液分離單個(gè)核細(xì)胞懸液(PBMC)，用細(xì)胞培養(yǎng)液配置成25萬(wàn)細(xì)胞/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取出微量板，在檢測(cè)孔中加入50 μl的CFP-10、ESAT-6抗原蛋白混合溶液，陰性孔中加入50 μl的細(xì)胞培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照孔中加入50 μl的植物血凝素，然后再每孔加入100 μl配置好的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.2 細(xì)胞因子的檢測(cè) 取出培養(yǎng)過(guò)夜后的微量板離心，取50 μl上清液放入流式檢測(cè)管，加入50 μl PE檢測(cè)試劑和50 μl細(xì)胞因子捕獲微球混合液，混勻后室溫避光保存3 h。加入1 ml洗液，200 g離心5 min，棄上清，每管加入300 μl洗液，混勻后立即上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 菌陰結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)

3次痰涂片及1次培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核患者。具備下列1-6中3項(xiàng)或7-8項(xiàng)中任何1項(xiàng)可入選。

①典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn)；

②抗結(jié)核治療有效；

③臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾患；

④PPD(5TU)強(qiáng)陽(yáng)性，血清抗結(jié)核抗體陽(yáng)性；

⑤痰結(jié)核菌PCR+探針檢測(cè)呈陽(yáng)性；

⑥肺外組織病理證實(shí)結(jié)核病變；

⑦支氣管肺泡灌洗液檢查(BALF)檢出抗酸分枝桿菌；

⑧支氣管或肺部組織病理證實(shí)結(jié)核病變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS18.0軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組人群間的數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌陰肺結(jié)核患者與健康人群的檢測(cè)結(jié)果比較

菌陰結(jié)核病患者的特異性抗原刺激后PBMC分泌的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g均高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-4和IL-17結(jié)果都為0，無(wú)差異，見表1。

表1 菌陰肺結(jié)核患者與健康人群各細(xì)胞因子的比較

2.2 菌陰肺結(jié)核患者與肺炎患者的檢測(cè)結(jié)果比較

菌陰結(jié)核病患者組的IL-2、IL-6、IL-10、TNF-a、IFN-g均高于肺炎患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-4和IL-17結(jié)果都為0，無(wú)差異，見表2。

2.3 菌陰肺結(jié)核患者與潛伏感染者的檢測(cè)結(jié)果比較

菌陰結(jié)核病患者組的IL-2低于潛伏感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TNF-a、IFN-g均高于潛伏感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-4、IL-6、IL-10、IL-17結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表2 菌陰肺結(jié)核患者與肺炎患者組各細(xì)胞因子的比較

表3 菌陰肺結(jié)核患者與潛伏感染組各細(xì)胞因子的比較

3 討論

目前，全世界已有近20億人口受到結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium ruberculosis,Mtb)的感染，結(jié)核患者約2000萬(wàn)人[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，2011年約新發(fā)結(jié)核病870萬(wàn)，死亡140萬(wàn)人[1]。目前我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130 萬(wàn)，占全球發(fā)病的14.9%，位居全球第2位，活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率459/10萬(wàn)，其中約50%-70%為菌陰肺結(jié)核[5]。菌陰肺結(jié)核是指以痰涂片和培養(yǎng)法(3次涂片一次培養(yǎng))查分枝桿菌均為陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核。但是“涂陰”并非是真正的不排菌，菌陰肺結(jié)核如不能早期診斷，近一半將發(fā)展為涂陽(yáng)患者，成為新的傳染源。目前診斷肺結(jié)核的主要方法是痰涂片染色鏡檢、X線胸片檢查(缺乏特異性)、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)，繼而以改良羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)確診。然而，針對(duì)菌陰肺結(jié)核涂片鏡檢、分離培養(yǎng)結(jié)核桿菌對(duì)臨床診斷意義不大。因此，如有一項(xiàng)針對(duì)菌陰結(jié)核病檢測(cè)的快速有效的診斷技術(shù)，將給目前治療和控制結(jié)核病的流行帶來(lái)巨大的幫助。

本研究所使用的流式液相多重蛋白定量技術(shù)(Cytometric Bead Array，CBA),是基于流式細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)的多重蛋白定量技術(shù)，其能夠?qū)蝹€(gè)樣品中的多個(gè)細(xì)胞因子指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)的可溶性蛋白檢測(cè)定量方法，CBA具有更低的檢測(cè)下限。應(yīng)用少量的樣本，即可對(duì)所檢測(cè)的樣本中的多種可溶性細(xì)胞因子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)[6,7]。通過(guò)CBA對(duì)經(jīng)ESAT-6、CFP-10抗原肽刺激的PBMC上清液中細(xì)胞因子的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)菌陰肺結(jié)核患者組的TNF-a和IFN-g這兩個(gè)細(xì)胞因子水平較其他3組都要高，且差異都具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；IL-2的濃度均比健康人群和肺炎患者組高，但低于潛伏感染者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-6和IL-10的濃度高于健康人群和肺炎患者組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與潛伏感染者組的濃度相當(dāng)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從上述數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病感染人群(包括潛伏感染組和菌陰肺結(jié)核患者組)的IL-2、TNF-a和IFN-g的濃度比其他人群高出很多，這3個(gè)細(xì)胞因子可以作為區(qū)分的主要指標(biāo)。在潛伏感染組和菌陰肺結(jié)核患者組中，前者IL-2的濃度較高，后者IFN-g和TNF-a的濃度較高，且差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以有效的區(qū)分這兩組人群。因此，我們認(rèn)為利用CBA技術(shù)同時(shí)檢測(cè)經(jīng)特異性抗原刺激后的PBMC上清液中IL-2、TNF-a和IFN-g的濃度，能為菌陰肺結(jié)核的診斷提供可靠的證據(jù)。

綜上所述，由于現(xiàn)有針對(duì)菌陰肺結(jié)核現(xiàn)有診斷技術(shù)及方法都存在一定的局限性[8]。因此對(duì)新型診斷技術(shù)的研發(fā)是現(xiàn)階段結(jié)核病研究的主要目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)特異性抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，運(yùn)用CBA技術(shù)檢測(cè)上清液中IFN-g、IL-2、TNF-a、IL-4、IL-10、IL-6、IL-17等細(xì)胞因子的分泌情況，能為菌陰結(jié)核病的診斷提供有效的依據(jù)，這對(duì)于提高我國(guó)結(jié)核病的診斷水平，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療、管理傳染源，控制其傳播流行，降低其對(duì)周圍人群的危害具有積極的推動(dòng)作用，對(duì)于控制結(jié)核病疫情的發(fā)展，并實(shí)現(xiàn)最終消滅結(jié)核病的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)具有極其重要的意義。

[1]World Health Organization.Global tuberculosis report 2012 [M].Geneva:World Health Organization,2012:8.

[2]Russell DG,Barry CE,Flynn JL.Tuberculosis:what we don't know can,and does,hurt us[J].Science,2010,328(5980):852.

[3]唐文芳,劉日輝,張亞男,等.結(jié)核性胸膜炎患者血清IFN-γ表達(dá)的meta分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014,08:1278.

[4]Jones DA,Guha K,Ho TB.Notification of tuberculosis in an area of low TB incidence[J].Clin Med，2008，8:637.

[5]高愛忠.兩種試驗(yàn)對(duì)菌陰肺結(jié)核診斷價(jià)值的比較[J].臨床肺科雜志，2015，20(3)：432.

[6]Elshal MF,McCoy JP.Multiplex bead array assays:performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA[J].Method，2006，38:317.

[7]Morgan E,Varro R,Seoulvede H,et al.Cytometric bead array:a multiplexed assay platform with application in various areas of biology[J].Clin Immunol，2004，110:252.

[8]Harari A,Rozot V,Enders FB,et al.Dominant TNF-α+ Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+ T cell responses discriminate between latent infection and active disease[J].Nat Med,2011，17(3):372.

The research of using CBA technology in the diagnosis about smear negative TB patients

LIUJun,PEIHao,WANGJun,etal.

(WuxiNo’5People’sHospital,Wuxi214005,China)

Objective To evaluate the value of CBA technology in smear negative tuberculosis diagnosis by detecting PBMC supernatants cytokine levels which stimulation by specific antigen.Methods The subjects were divided into healthy people,pneumonia patients,tuberculosis latent infection and smear-negative TB patients.To detected IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF-a,IFN-g and IL-17 in PBMC culture supernatants after specific antigen stimulation by CBA technology,then statistical analysis the test results. Results The IL-2,IL-6,IL-10,TNF-a and IFN-g secretion levels of smear-negative TB patients were higher than those of both healthy people and pneumonia patients,the difference had statistically significant.The concentration of IL-4 and IL-17 were no difference.The concentration of IL-2 of smear-negative TB patients was lower than latent infection tuberculosis,the difference had statistically significant.The concentration of TNF-a and IFN-g were higher than latent infection tuberculosis,the difference had statistically significant.The concentration of IL-4,IL-6,IL-10 and IL-17 were no difference.Conclusion The results of cytokine test in PBMC supernatants after stimulation could provide the diagnosis of smear-negative TB patients an effective basis,had great significance to control the development of TB epidemic and achieve the eventually goals of eliminate TB.

smear-negative TB patient;CBA technology;cytokines

江蘇省自然科學(xué)基金面上研究項(xiàng)目(BK20151113)；無(wú)錫市醫(yī)管中心面上項(xiàng)目(YGZXM1523)；無(wú)錫市第二輪公共衛(wèi)生“三名戰(zhàn)略”優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)經(jīng)費(fèi)資助

*通訊作者

1007-4287(2017)06-0983-04

R524

A

劉君，男，32歲，碩士，主管技師，研究方向：結(jié)核病的快速診斷。

2016-12-11)