致病疫霉ATP6基因單倍型與地理因素的相關性分析

張佳峰+吳娥嬌+羅桂火++祝雯++詹家綏

摘要：致病疫霉（Phytophthora infestans）是馬鈴薯晚疫病的病原菌，對世界馬鈴薯的生產(chǎn)造成嚴重影響。ATP6編碼ATP合酶α亞基的第6個亞單位，對ATP合酶的功能及生物的生存生殖至關重要。本研究對來自我國7個群體140株馬鈴薯晚疫病菌的ATP6基因進行核苷酸序列及其遺傳結構和地理因素（海拔、經(jīng)度和年平均氣溫）的相關分析。結果表明：7個群體中只有2種單倍型Hapl-1和Hapl-2，其中Hapl-1在群體中所占比例與當?shù)氐暮０纬曙@著正相關，與年平均氣溫和經(jīng)度呈顯著負相關，而Hapl-2在群體中的比例與當?shù)氐暮０?、年平均氣溫和?jīng)度的相關正好與Hapl-1相反。群體間的遺傳分化度（FST）與群體間直線距離呈顯著正相關（r=0.659，P=0.001）。本研究表明，馬鈴薯致病疫霉ATP6基因單倍型分布和群體地理因素之間具有顯著相關關系，該結果為了解致病疫霉的進化趨勢和致病疫霉的防治提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：馬鈴薯晚疫病菌；ATP6基因；單倍型多樣性；地理因素；核苷酸序列

中圖分類號： S435.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0075-04

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans de Bary）引起的毀滅性病害，可侵染馬鈴薯和番茄等茄科植物[1-2]，每年造成直接經(jīng)濟損失高達百億美元[3-4]。21世紀以來，隨著馬鈴薯種植面積的不斷擴大，我國馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量已居世界第一，馬鈴薯已經(jīng)成為全球性食物，是水稻、小麥和玉米之后的全球第四大糧食作物[5-6]。

線粒體基因組的突變率低，單親遺傳，常被用于研究生物的進化模式[7-10]。目前為止，已有超過150個植物、動物、真菌、原生生物的線粒體基因組被測序[11]。因此，通過了解線粒體基因遺傳多樣性有助于了解致病疫霉群體結構和變異特點，進而探究不同地理區(qū)域下的群體遺傳結構。

馬鈴薯生產(chǎn)具有較強的地域性，在全國不同地區(qū)形成各具特色的栽培方式和栽培類型，從生產(chǎn)上來看，中國馬鈴薯的生產(chǎn)栽培區(qū)域為4個，分別是北方一季作區(qū)、中原二季作區(qū)、南方冬作區(qū)、西南混作區(qū)[12]，各地理區(qū)域氣候特征差異較大。胡珍珠等對我國北方馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)致病疫霉群體遺傳結構進行分析，結果表明，我國北方馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)致病疫霉群體存在較為豐富的遺傳多樣性，且其遺傳多樣性與地理來源密切相關[13]；云南馬鈴薯晚疫病群體遺傳多樣性在地理分布上也存在差異顯著[14]；氣候變暖對馬鈴薯晚疫病發(fā)生發(fā)展的影響研究表明馬鈴薯晚疫病的發(fā)生發(fā)展與流行的適應氣象條件，單因子作用并不顯著[15]；短暫的溫度起伏也會導致個體產(chǎn)生不同的表型[16]；同時，隨著地區(qū)年均溫的改變加劇會導致更多的遺傳變異[17-18]；經(jīng)緯度、海拔、年平均氣溫、降水量以及紫外強度對當?shù)伛R鈴薯晚疫病菌的發(fā)生造成很大的影響[19-21]。本研究對我國7個不同地理環(huán)境的致病疫霉菌群體的ATP6基因進行遺傳多樣性分析，以探究致病疫霉遺傳多樣性的空間分布以及遺傳結構與地理因素（海拔、經(jīng)度和年均溫）的相關性，以期為晚疫病的防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

根據(jù)SSR基因型的不同從源自我國云南曲靖（2010年）、廣西南寧（2010年）、貴州安順（2011年）、福建福州（2010年）、福建霞浦（2011年）、甘肅定西（2010年）和寧夏渭源（2010年）7個馬鈴薯栽培地區(qū)，共計815株致病疫霉菌中選取140株無性系，寄主均為馬鈴薯。

1.2方法

1.2.1樣本的采集與純化在發(fā)病區(qū)選1塊田地，病株間隔2 m以上，每個病株上選擇具有典型癥狀的單個病斑的病葉，在水瓊脂培養(yǎng)基上保濕培養(yǎng)12～24 h，用接菌針挑取單根菌絲，接種于含抗生素（利福平10 mg/L、氨芐青霉素100 mg/L）的選擇性黑麥培養(yǎng)基上[22]。

1.2.2培養(yǎng)基的制備黑麥培養(yǎng)基的配置：將50 g黑麥浸泡12 h，勻漿機粉碎，60 ℃水浴浸泡2 h，4層紗布過濾，定容至1 L并且加入12 g瓊脂糖加熱溶化，于121 ℃高壓滅菌 20 min。冷卻到60 ℃左右倒平板，接菌后在18 ℃避光培養(yǎng) 7～10 d。將純化的菌株接種到黑麥凍存管或者黑麥培養(yǎng)基斜面上，13 ℃避光長期保存菌種[23]。

1.2.3致病疫霉DNA的提取和線粒體ATP6基因的擴增收集在黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的致病疫霉菌絲，冷凍干燥并且粉碎后使用BIOMIGA試劑公司訂購的Bio MIGA Plant g DNA Kit（GD2611-02 250 poeps）試劑盒提取DNA，將提取的基因組DNA保存于-40 ℃?zhèn)溆谩＠肈NAMAN以及Primer Premier 5軟件設計并在上海鉑尚生物技術有限公司合成引物（F，5′-GAAGCTGCTGCATGGTATTGG-3′；R，5′-GCGACCTATAGCGTCACAAGC-3′），對致病疫霉7個群體的ATP6基因片段進行擴增。PCR采用Blend Taq DNA聚合酶進行擴增，PCR反應在Life Pro Themeral Cycler PCR儀上進行。反應體系為25 μL，包括1 μL模板DNA、0.25 μL Taq DNA聚合酶、2.5 μL dNTP、2.5 μL 10×buffer，加無菌水補至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用G：BOX凝膠成像系統(tǒng)進行觀察拍照。

1.2.4測序和數(shù)據(jù)處理將瓊脂糖凝膠電泳檢測結果中條帶單一的PCR擴增產(chǎn)物樣品送于上海鉑尚生物有限公司進行PCR產(chǎn)物測序。將測序所獲得的序列通過DNAMAN軟件進行拼接，使用MEGA 5.05[24]軟件中的Muscle（Codons）子程序進行多重比對。通過NCBI在線BLAST比對驗證同源性，利用DnaSP 5.10.1[25]軟件分析致病疫霉遺傳多樣性參數(shù)來評估遺傳多樣性，包括單倍型數(shù)（number of haplotypes detected，H）、核苷酸多樣性（nucleoticide diversity，π）、單倍型多樣性（haplotype diversity，Hd）、多態(tài)性位點數(shù)（number of segregeting site，S）等[26-27]。利用Arlequin v 3.4.1.3[28]軟件計算群體間FST，根據(jù)FST的值來判斷群體分化程度。采樣地點當年的年平均氣溫、海拔以及經(jīng)度則通過World Climate（http：//www.world-climate.com）以及Google Earth（http：//www.earthol.com/）來查詢[29]，同時利用經(jīng)緯度距離計算器來計算采樣點之間的直線距離。

2結果與分析

全國7個群體中只出現(xiàn)2個多態(tài)性位點（表1）。單倍型多樣性（Hd）在地區(qū)間存在差異，福州、霞浦、甘肅、寧夏、云南群體的單倍型多樣性（Hd）值均小于0.5，核苷酸多樣性（π）值均小于0.005，然而貴州、廣西群體的單倍型多樣性值大于0.5，但是核苷酸多樣性值仍然小于0.005。通過對7個群體的單倍型多樣性比較發(fā)現(xiàn)，貴州群體的單倍型多樣性平均值最高，為0.525，云南群體的單倍型多樣性平均值最低，為 0.111。貴州群體ATP6基因表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，云南群體ATP6基因表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性（表1）。

采樣地點地理因素因子（表4）以及不同地區(qū)單倍型分布比例（圖3）的相關性分析表明，Hapl-1比例與采樣地區(qū)海拔呈現(xiàn)正相關（r=0.951，P=0.001），Hapl-2比例和采樣地區(qū)海拔呈現(xiàn)負相關（r=-0.951，P=0.001），說明隨著采樣地區(qū)海拔的升高，Hapl-1比例越高，Hapl-2比例越低；Hapl-1比例和采樣地區(qū)年平均氣溫呈現(xiàn)負相關（r=-0.752，P=0.051），而Hapl-2比例和采樣地區(qū)年平均氣溫呈現(xiàn)正相關（r=0.752，P=0.051），說明Hapl-1比例隨著采樣地區(qū)年平均氣溫升高而降低，Hapl-2比例隨著年平均氣溫升高而升

高；Hapl-1比例與采樣地區(qū)經(jīng)度呈現(xiàn)負相關（r=-0.894，P=0.007），Hapl-2比例與采樣地區(qū)經(jīng)度呈現(xiàn)正相關（r=0894，P=0.007），說明隨著采樣地區(qū)采樣地區(qū)經(jīng)度的升高，

3討論與結論

對我國7個不同群體采集篩選的共計140個致病疫霉ATP6基因進行擴增和核苷酸分析，同時進行ATP6基因遺傳結構和部分地理因素之間的相關性分析。結果表明，有2種單倍型Hapl-1和Hapl-2，其中Hapl-1與海拔呈正相關，與年平均氣溫和經(jīng)度呈負相關，而Hapl-2與海拔呈負相關，與年平均氣溫和經(jīng)度呈正相關。群體間的FST與群體間水平距離成顯著相關關系。

有研究表明，地理環(huán)境因素是影響晚疫病流行的關鍵因素[30-32]，本研究結果也表明，ATP6基因單倍型比例與采樣地區(qū)海拔、經(jīng)度以及年平均氣溫具有相關性。同時ATP6基因與呼吸作用相關[33]，海拔、年均氣溫和經(jīng)度均可以影響生物的呼吸作用，本試驗間接證明這些地理因素與晚疫病發(fā)生和致病疫霉群體分布具有相關性。

從生產(chǎn)上來看，中國馬鈴薯的生產(chǎn)栽培區(qū)域有各自特有的氣象因素和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，各生態(tài)區(qū)域氣候特征差異較大。地區(qū)間致病疫霉群體遺傳結構各有不同。群體間FST和采樣點間垂直距離呈現(xiàn)正相關（r=0.659，P=0.001）。這一結果證實，進化理論中提到的地區(qū)間隔是導致種群地區(qū)間遺傳分化的重要原因，地理位置越靠近分化程度越低[34-35]。

目前我國對致病疫霉遺傳分化的原因多處于對遺傳多樣性的了解，對地區(qū)間分化原因以及形成機制很少探討。本研究利用分子生物學和群體遺傳學原理，初步分析我國不同地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性及形成的可能機制，為馬鈴薯防治提供依據(jù)。但本研究選擇單個線粒體基因，在未來研究中，采取多個基因聯(lián)合方法來對此結論進行進一步驗證，為制定長期、有效和環(huán)境友好型的致病疫霉防治方案提供科學依據(jù)。

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