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    22q11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術(shù)研究

    2017-06-30 08:25蔣華景陳靜林麗璇
    中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥 2017年15期
    關(guān)鍵詞:心動(dòng)圖先天性熒光

    蔣華景+陳靜+林麗璇

    [摘要]目的 探討熒光原位雜交技術(shù)(FISH)聯(lián)合超聲心動(dòng)圖對(duì)診斷22q 11.2微缺失伴先天性心臟病的臨床價(jià)值。方法 于2013年1月~2014年12月選擇62名具有高危妊娠指征的孕婦,應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)22q 11.2微缺失,并以超聲心動(dòng)圖明確診斷。結(jié)果FISH檢出5例22q 11.2微缺失,超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果3例為法洛四聯(lián)癥,2例為室間隔缺損。57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果三尖瓣輕度反流2例、肺動(dòng)脈狹窄2例、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉1例。22q 11.2微缺失組與無微缺失組胎兒超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)異常率分別為100.00%和8.77%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.28,P<0.01)。結(jié)論FISH技術(shù)檢測(cè)胎兒22q 11.2微缺失,并配合超聲心動(dòng)圖對(duì)心臟畸形進(jìn)行明確檢查,臨床應(yīng)用價(jià)值較高,值得推廣應(yīng)用。

    [關(guān)鍵詞]熒光原位雜交技術(shù);超聲心動(dòng)圖;22q 11.2微缺失;先天性心臟病

    [中圖分類號(hào)] 714.43+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721(2017)05(c)-0062-04

    [Abstract]Objective To discuss the clinical value of fluorescence in situ hybridization (FISH) combined with ultrasonic cardiogram on 22q 11.2 microdeletion accompanied with congenital heart disease (CHD).Methods A total of 62 high risk pregnant women from January 2013 to December 2014 were chosen.The FISH technique was applied to detect 22q 11.2 microdeletion,and ultrasonic cardiogram was used to diagnose clearly.Results Five fetuses with 22q 11.2 microdeletion were detected,from whom 3 fetuses were diagnosed as tetralogy of Fallot,and 2 fetuses were diagnosed as ventricular septal defect.The ultrasonic cardiogram showed that 2 fetuses with tricuspid regurgitation slightly,2 fetuses with pulmonary stenosis and 1 fetus with patent ductus arteriosus were detected in 57 fetuses without 22q 11.2 microdeletion.Abnormality rate in group with 22q 11.2 microdeletion and group without 22q 11.2 microdeletion was 100.00% and 8.77% respectively,and difference was statistically significant (χ2=28.28,P<0.01).Conclusion Detecting 22q 11.2 microdeletion with FISH technique and diagnosing clearly CHD with ultrasonic cardiogram has high clinical application value and it is worthy of clinical promotion and application.

    [Key words]Fluorescence in situ hybridization;Ultrasonic cardiogram;22q 11.2 microdeletion;Congenital heart disease

    先天性心臟?。╟ongenital heart disease,CHD)是臨床常見的胎兒先天性畸形,發(fā)病率為活產(chǎn)嬰兒的3‰~8‰[1],也是目前嬰幼兒死亡的主要病因之一。CHD的發(fā)病受遺傳和環(huán)境等多種因素影響,目前研究表明,染色體22q 11.2微缺失與CHD關(guān)系密切,22q 11.2微缺失可以引發(fā)心臟缺陷,同時(shí)伴有唇裂/腭裂、胸腺發(fā)育不良、面容異常等先天畸形,因此被稱為22q 11.2微缺失綜合征。22q 11.2微缺失綜合征作為人類最常見的染色體缺失綜合征之一,發(fā)病率為1/4 000~1/6 000[2],且75%~80%的22q 11.2微缺失微缺失病例可合并各種類型的CHD[3-5]。本研究采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)技術(shù),對(duì)臨床疑似妊娠22q 11.2微缺失綜合征胎兒的高危孕婦進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)22q 11.2基因微缺失,并以彩色超聲心動(dòng)圖明確診斷,旨在對(duì)胎兒進(jìn)行早期干預(yù),并提高22q 11.2微缺失伴先天性心臟病的診斷技術(shù)。

    1對(duì)象與方法

    1.1研究對(duì)象

    選擇2013年1月~2014年12月在本院產(chǎn)前檢查并檢測(cè)22q 11.2微缺失的高危孕婦62例,孕婦年齡28~43歲,平均(36.35±4.62)歲,胎齡13~33周,平均(23.64±4.28)周。根據(jù)妊娠周數(shù),11~14周行絨毛穿刺3例,17~24周行羊膜腔穿刺23例,>24周行臍帶血穿刺36例。62名孕婦以往均引產(chǎn)或分娩過CHD或唇腭裂等面部畸形胎兒。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書,研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 試劑與儀器

    FISH診斷試劑盒(購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司),膠原酶B、RNase A酶、胃蛋白酶(均購自美國(guó)Sigma公司)。國(guó)產(chǎn)長(zhǎng)風(fēng)恒溫水浴箱、奧林巴斯BX51型熒光顯微鏡。

    1.3 FISH檢測(cè)

    根據(jù)孕齡取羊水10 ml、臍血2 ml或絨毛3~4枝,采用FISH診斷試劑盒,對(duì)標(biāo)本22號(hào)染色體TUPLE1基因的微缺失進(jìn)行檢測(cè)。GLP TUPLE1/GLP ARSA為待檢測(cè)的基因,TUPLE1:22q 11和ARSA:22q 13為探針的位點(diǎn),其熒光信號(hào)分別為桔紅色和綠色,彼此互為內(nèi)對(duì)照探針。嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作,分別進(jìn)行滴片、干燥、變性、雜交、后洗、染色和鏡檢等操作。如果TUPLEl探針與22q 11.21成功雜交,顯示桔紅色的熒光信號(hào)(四甲基羅丹明);如果ARSA基因探針與22q 13.31成功雜交,則出現(xiàn)綠色的熒光信號(hào)(細(xì)胞綠)。TUPLE1和ARSA基因互為內(nèi)對(duì)照。在奧林巴斯BX51型熒光顯微鏡下對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行觀察,使用FISH VIDEOTEST 2.0軟件分析。FISH信號(hào)的評(píng)價(jià)規(guī)則:有效標(biāo)本為細(xì)胞膜完整且細(xì)胞雜交率80%,對(duì)每份樣本隨機(jī)分析100個(gè)處于分裂中期狀態(tài)的細(xì)胞,22號(hào)染色體在細(xì)胞內(nèi)呈綠色熒光,如果22q 11無缺失,22號(hào)染色體上應(yīng)該還可顯示2個(gè)桔紅色熒光信號(hào);如果只有1個(gè)桔紅色熒光信號(hào),提示22q 11.2存在微缺失。若熒光信號(hào)正常的細(xì)胞≥90%,則胎兒染色體可診斷正常;若熒光信號(hào)異常的分裂狀態(tài)細(xì)胞>60%,F(xiàn)ISH檢查結(jié)果陽性,提示胎兒存在22q 11.2微缺失。

    1.4超聲心動(dòng)圖檢查

    參照“ISUOG 胎兒心臟篩查指南”[6],超聲診斷儀為GE E8型。確認(rèn)胎兒心臟方位后,在胎兒腹部橫切面,依據(jù)下腔靜脈、胃、腹主動(dòng)脈等結(jié)構(gòu)對(duì)心臟位置是否正常進(jìn)行判斷;然后用超聲心動(dòng)圖對(duì)胎兒三血管氣管的橫截面、三血管的橫截面、左右室流出道的橫截面及四腔心橫截面篩查胎兒CHD。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),并采用配對(duì)McNemar檢驗(yàn)比較兩種診斷方法的差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1 FISH 法檢測(cè)22q 11.2微缺失結(jié)果

    62例高危孕婦中,共57例FISH檢測(cè)結(jié)果為>90%的細(xì)胞內(nèi)有2個(gè)綠色熒光、2個(gè)桔紅色熒光信號(hào),提示22q 11.2無微缺失。5例有60%以上細(xì)胞出現(xiàn)了2個(gè)綠色熒光、1個(gè)桔紅色熒光信號(hào),提示存在22q 11.2微缺失。

    2.2 超聲心動(dòng)圖結(jié)果

    5例22q 11.2微缺失胎兒超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果3例為法洛四聯(lián)癥(圖1),2例為室間隔缺損。而57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果三尖瓣輕度反流2例、肺動(dòng)脈狹窄2例、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉1例,22q 11.2微缺失胎兒超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)為100.00%異常,而無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動(dòng)圖表現(xiàn)異常率為8.77%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.28,P<0.01)(表1)。FISH和超聲心動(dòng)圖診斷結(jié)果的配對(duì)χ2檢驗(yàn)顯示2種方法對(duì)胎兒心臟異常診斷的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.00,P=0.06)(表2)。在FISH檢測(cè)結(jié)果和超聲心動(dòng)圖結(jié)果出來后,對(duì)于確診為法洛四聯(lián)癥的3例胎兒,在孕婦及其家屬同意的情況下行引產(chǎn)手術(shù),其他胎兒在征得孕婦及其家屬的同意下均活產(chǎn),隨訪結(jié)局情況見表3。

    3討論

    CHD的發(fā)病率近年來呈增高趨勢(shì),但其發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明了。大部分觀點(diǎn)認(rèn)為CHD是受遺傳和環(huán)境影響的多基因遺傳病,其中染色體畸變是出現(xiàn)CHD的主要病因,胎兒發(fā)育過程中極輕微的染色體畸變也能使附近的基因出現(xiàn)異常,并使心臟以及心外器官的發(fā)育受到影響,從而出現(xiàn)CHD和心畸形。而22q11.2微缺失綜合征是目前少數(shù)得到確認(rèn)的致CHD的染色體畸變之一。Hartman等[7]的研究顯示CHD患兒中22q 11.2微缺失的發(fā)生率為12.2%。22q 11.2微缺失主要為染色體減數(shù)分裂之后重組時(shí)發(fā)生的異常與不對(duì)稱導(dǎo)致,微缺失大小為1.5~3 Mb,缺失區(qū)域處于D22S306/308與D22S427/1638間。活產(chǎn)兒中22q 11.2的發(fā)生率約為1/4 000[8]。22q 11.2微缺失綜合征已經(jīng)被確認(rèn)為除外唐氏綜合征的導(dǎo)致CHD的最為多見的遺傳因素。22q 11.2微缺失綜合征患者臨床表現(xiàn)為CHD、唇腭裂、面部畸形、免疫缺陷等,而CHD中發(fā)生率較高的主要為法洛四聯(lián)征、主動(dòng)脈弓離斷、室間隔缺損、共同動(dòng)脈干等,患兒的生長(zhǎng)發(fā)育、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力都會(huì)出現(xiàn)異?;蜻t緩[9-11],對(duì)其預(yù)后和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重的不利影響。

    研究顯示22q 11.2微缺失綜合征的主要致病基因?yàn)門UPLE1基因,它的畸變或缺失是引起CHD的主要原因之一[12]。FISH技術(shù)通過特異性探針與細(xì)胞雜交對(duì)TUPLE1基因進(jìn)行檢測(cè),能對(duì)胎兒是否發(fā)生22q 11.2 微缺失進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷。FISH檢測(cè)不需要細(xì)胞培養(yǎng),能適用于細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)期,具有標(biāo)本采集后可立即檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),能在染色體原位顯色,定位精準(zhǔn)直觀,結(jié)果判斷時(shí)只需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、辨認(rèn)是否有雜交信號(hào),具有高度的靈敏性和特異度,成為臨床染色體微缺失檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。

    染色體異常與胎兒的發(fā)育畸形,特別是CHD的發(fā)生密切相關(guān)。心臟超聲檢查能夠清晰直觀地顯示胎兒心臟圖像,通過將胎兒心臟的掃查切面從四腔心切面擴(kuò)展到更多的標(biāo)準(zhǔn)切面,使心臟畸形的檢出率大為提高,因此超聲心動(dòng)圖是診斷胎兒CHD的可靠方法[14-15]。染色體畸變常伴基因異常或缺失,因此,心臟畸形或心外畸形較為多發(fā)。研究顯示CHD胎兒的染色體異常發(fā)生率為25%~30%,而當(dāng)合并有心外畸形時(shí)染色體異常發(fā)生率可高達(dá)40%[16]。通過產(chǎn)前的FISH檢查對(duì)胎兒進(jìn)行22q 11.2微缺失的檢測(cè),并結(jié)合心臟超聲影像學(xué)檢查,對(duì)提高CHD的產(chǎn)前診斷有顯著的臨床意義。本研究對(duì)62例高危孕婦進(jìn)行FISH檢測(cè),檢出5例22q 11.2微缺失,22q 11.2微缺失胎兒的超聲心動(dòng)圖均顯示有心臟畸形,其中法洛四聯(lián)癥3例,室間隔缺損2例;而57例無22q 11.2微缺失的胎兒超聲心動(dòng)圖檢查心臟畸形率為8.77%,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明22q 11.2微缺失與胎兒CHD的發(fā)生有較大的相關(guān)性,與閆亞妮等[17]的研究相似,同時(shí)也提示CHD是環(huán)境因素與多基因遺傳共同影響的結(jié)果,CHD的病因還需更深入的研究。應(yīng)用FISH技術(shù)檢測(cè)22q 11.2微缺失,所需樣本量少、且操作簡(jiǎn)便,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。隨著標(biāo)記技術(shù)和探針制備的發(fā)展,F(xiàn)ISH技術(shù)對(duì)臨床胎兒CHD檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值將進(jìn)一步得到體現(xiàn)[16]。

    本研究顯示,對(duì)高危孕婦進(jìn)行FISH檢測(cè)以篩查22q 11.2微缺失,并結(jié)合超聲心動(dòng)圖檢查以明確診斷,以減少和避免22q 11.2微缺失綜合征的患兒出生,降低圍生兒病死率,提升人口素質(zhì),值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2017-04-25 本文編輯:許俊琴)

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