生物制品中牛病毒性腹瀉病毒RT—PCR及套式 RT—PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

顧蓓蓓++王妍鱈++李雙潔++盧勁曄++苗晉鋒

摘要：為建立生物制品中牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）污染的檢測方法，根據(jù)GenBank公布的BVDV序列，分別設(shè)計了普通PCR和套式PCR的特異性引物，建立了檢測BVDV的普通PCR和套式PCR檢測方法。結(jié)果表明，該方法可以快速檢測出生物制品中的BVDV污染，為生物制品中BVDV的快速、低含量檢測提供了簡單快速的檢測方法。

關(guān)鍵詞：牛血清；疫苗；牛病毒性腹瀉病毒；套式RT-PCR

中圖分類號： R914；S858.235.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0030-03

牛病毒性腹瀉/黏膜病（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的，以發(fā)熱、白細(xì)胞減少、胃腸道黏膜糜爛潰瘍、腹瀉及懷孕母牛不孕、流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的一種傳染病[1]。牛病毒性腹瀉呈世界性分布，在養(yǎng)牛發(fā)達(dá)國家也廣泛存在，給畜牧業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬，與豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）同屬，具有抗原相關(guān)性，豬也可感染BVDV，感染后癥狀和病理變化與豬瘟類似，此病引起許多國家的關(guān)注，尤其是豬瘟已經(jīng)被消滅或控制的國家和地區(qū)。

近年來，國內(nèi)研究人員多次從發(fā)病豬群中分離到BVDV，證實了該病在我國一直存在。一般認(rèn)為豬感染BVDV的傳染源為污染了BVDV的豬瘟活疫苗。據(jù)調(diào)查，我國豬瘟疫苗質(zhì)量控制問題突出，BVDV污染嚴(yán)重。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所對國內(nèi)不同廠家生產(chǎn)的不同批次豬瘟疫苗半成品及成品檢測結(jié)果顯示，兩者的BVDV陽性率分別達(dá)20.7%、22.2%。疫苗生產(chǎn)中感染牛病毒性腹瀉病毒是因為在細(xì)胞培養(yǎng)時使用了被BVDV污染的犢牛血清造成的，而這種感染又不易被發(fā)現(xiàn)，使用這種感染的血清用于生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞受到污染，損失巨大[2-3]。近年來，多地檢驗檢疫部門在進(jìn)口牛血清中檢測出BVDV。目前針對牛血清及疫苗中BVDV的檢測標(biāo)準(zhǔn)缺失，因此建立特異性的BVDV檢測方法至關(guān)重要。本研究根據(jù)GenBank公布的BVDV序列，分別設(shè)計了普通PCR和套式PCR的特異性引物，建立了檢測BVDV的普通PCR和套式PCR檢測方法，以期為牛病毒性腹瀉/黏膜病的臨床快速診斷提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、豬瘟病毒（CSFV）、牛腎細(xì)胞MDBK、傳染性牛鼻氣管炎病毒由筆者所在實驗室保存。TRIzol購自Invitrogen公司，Takara PCR Mix、凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

主要儀器：SmartSpecTM Plus核酸濃度測定儀、梯度PCR儀、GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）、臺式高速低溫離心機(jī)（eppendorph）。

1.2病毒基因組RNA的提取

將BVDV接種于MDBK單層細(xì)胞，設(shè)空白對照，待細(xì)胞出現(xiàn)典型的空泡病變后，收獲病毒，用Trizol試劑盒提取病毒基因組及對照細(xì)胞的RNA。

1.3RT-PCR反應(yīng)

1.3.1RT-PCR反應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株的全序列，設(shè)計合成引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：WS-BVDV-F：5′-CTT AGC GAA GGC CGA AAA GAG-3′；WS-BVDV-R：5′-CTC CAT GTG CCA TGT ACA GCA G-3′。

用隨機(jī)引物同時對樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立樣品的cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Takara PCR Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L 上游、下游引物各1 μL，加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴(kuò)增反應(yīng)條帶為312 bp。

1.3.2套式RT-PCR反應(yīng)根據(jù)已發(fā)表的BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株的全序列，選擇BVDV保守性較強(qiáng)的5′非編碼區(qū)域，設(shè)計合成2對特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下：BVDV-1 F：5′-TCAGCGAAGGCCGAAAAGAGG-3′；BVDV-1 R：5′-TCCATGTGCCATGTACAGCAGAG-3′；BVDV-1 Fn：5′-CAGTGGCGAGTTCGTTGGATG-3′；BVDV-1 Rn：5′-GGCCTCTGCAGCATCCTATCAG-3′。

用隨機(jī)引物同時對樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立樣品的cDNA。第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：TaKaRa PCR Mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，上游、下游引物BVDV-1F、BVDV-1R（10 μmol/L）各1 μL，加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴(kuò)增反應(yīng)條帶為309 bp。

第2輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板為第1輪PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系：TaKaRa PCR Mix 12.5 μL，第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物 1 μL，20 μmol/L上游、下游引物各1 μL，加水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴(kuò)增反應(yīng)條帶為197 bp。

1.4PCR特異性試驗

分別提取BVDV、CSFV、傳染性牛鼻氣管炎病毒、MDBK 正常細(xì)胞的RNA，用已建立的2種方法進(jìn)行擴(kuò)增，驗證所建方法的特異性。

1.5檢測方法的初步應(yīng)用

利用所建的套式RT-PCR方法檢測血清、疫苗等生物制品，同時對陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，進(jìn)行序列分析。

2結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于312 bp，套式PCR第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物位于309 bp（圖1），第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物在197 bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符（圖2）。

2.2特異性試驗

利用設(shè)計的普通PCR引物對牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物位于312 bp，豬瘟病毒、MDBK細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒均未擴(kuò)增出片段（圖3）。利用設(shè)計的套式PCR第1輪引物對牛病毒性腹瀉病毒擴(kuò)增除了309 bp的目的基因片段，測序結(jié)果與BVDV毒株序列一致，而豬瘟病毒、MDBK 細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒均未能擴(kuò)增出片段（圖4）。取第1輪PCR產(chǎn)物各1 μL為模板，利用第2輪引物進(jìn)行擴(kuò)增，在位于197 bp處可見特異性DNA擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符，測序鑒定結(jié)果與BVDV序列一致，而豬瘟病毒、MDBK細(xì)胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒均未擴(kuò)增出片段（圖5）。

2.3檢測方法的應(yīng)用

應(yīng)用本研究建立的BVDV普通RT-PCR和套式 RT-PCR 檢測方法，檢測來自不同批次的牛血清和疫苗制品各6份，共計12份樣品，檢測結(jié)果表明，本研究建立的方法能夠檢測出生物制品中污染BVDV的情況，且套式PCR的檢測結(jié)果更為靈敏、準(zhǔn)確（圖6、圖7）。

3結(jié)論與討論

小牛血清是生物制品制造過程中不可或缺的原材料，其安全性備受關(guān)注。研究表明，細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品中BVDV

核酸物質(zhì)污染基本上是由于使用了含有BVDV核酸物質(zhì)的牛血清引起的。因此在使用牛血清前，尤其是在用于制造人或動物疫苗等生物制品時，應(yīng)嚴(yán)格檢測其是否被BVDV污染[4]?！稓W盟生物制品生產(chǎn)牛血清使用指南》要求用細(xì)胞培養(yǎng)法和免疫熒光抗體法確認(rèn)牛血清病毒的感染性[5]?！吨袊幍洹啡扛戒浺矊π律Ｑ鍣z測提出了相同的技術(shù)要求。雖然各國對于牛血清的生產(chǎn)均有嚴(yán)格的技術(shù)規(guī)范，但由于檢測技術(shù)存在局限性，市場上還是有部分牛血清存在BVDV污染現(xiàn)象[6]。近2年，我國2次在進(jìn)口小牛血清中檢測到BVDV，發(fā)布了2次風(fēng)險預(yù)警，先后禁止新西蘭、澳大利亞的相關(guān)產(chǎn)品入境。由于BVDV和CSFV存在抗原交叉性，帶有BVDV抗原的血清不能用來培養(yǎng)CSFV，而應(yīng)用BVDV

污染的豬瘟疫苗免疫豬只可能導(dǎo)致其感染BVDV，引起類似于非典型豬瘟的發(fā)生。因此科研單位和生物制品企業(yè)應(yīng)該加強(qiáng)對其使用的小牛血清的BVDV檢測。

目前，BVDV的檢測方法有病毒分離技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、病毒中和試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等[7]。與病毒分離技術(shù)、病毒中和試驗等方法相比，RT-PCR技術(shù)具有快速高效且特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究建立了BVDV的RT-PCR檢測方法，同時根據(jù)BVDV 5′端非編碼區(qū)設(shè)計2對引物，建立了比常規(guī)PCR靈敏度更高的套式RT-PCR方法，為生物制品中微量的BVDV污染提供了一種更加特異、敏感的方法。本方法臨床應(yīng)用結(jié)果顯示，在隨機(jī)抽檢的疫苗和血清樣品中均能檢測到被BVDV污染的樣品，且套式PCR的檢測靈敏度優(yōu)于普通PCR，表明上述2種方法均能用于檢測生物制品中BVDV污染。

參考文獻(xiàn)：

[1]祖立闖，王金良，李嬌，等. 牛病毒性腹瀉病毒套式RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30（12）：1598-1601，1605.

[2]Peterhans E，Bachofen C，Stalder H，et al. Cytopathic bovine viral diarrhea viruses （BVDV）：emerging pestiviruses doomed to extinction[J]. Veterinary Research，2010，41（6）：44.

[3]陶潔，廖金虎，張倩，等. 豬感染牛病毒性腹瀉病毒研究進(jìn)展[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36（5）：410-413.

[4]祖立闖，魏鳳，苗立中，等. 應(yīng)用套式RT-PCR檢測豬瘟制品中牛病毒性腹瀉病毒污染的研究[J]. 養(yǎng)豬，2011（6）：97-100.

[5]The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. Note for guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal product（CPMP/BWP/1793/02） [M]. London：EMEA，2003：5-7.

[6]王競晗，李素，何文瑞，等. 進(jìn)口胎牛血清中牛病毒性腹瀉病毒的分離及鑒定[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2016，29（3）：308-311.

[7]張寧，秦建華，趙博偉，等. 牛病毒性腹瀉-黏膜病診斷方法研究進(jìn)展[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29（2）：93-97.