飼料中添加嗜水氣單胞菌對日本醫(yī)蛭生長和成活的影響

張濤+于翔+龔元+李軍+張健

摘 要：在水溫21.3～27.5 ℃條件下研究了兩種不同基礎(chǔ)飼料配比不同濃度的嗜水氣單胞菌后，日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponia）增重率、飼料系數(shù)和存活率的變化。結(jié)果表明，以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料配比試驗，試驗2#、3#組日本醫(yī)蛭總增重率分別為804.99%±56.16%和682.33%±43.11%，高于其余各組；試驗2#組的總飼料系數(shù)為2.71±0.32，低于0#、1#組，試驗3#組飼料系數(shù)最低為2.61±0.19 ；試驗2#、3#組日本醫(yī)蛭存活率分別為93%±4.23和96.00%±0.00%，高于其余各組。以人工配合飼料為基礎(chǔ)飼料配比試驗，試驗1#、2#組日本醫(yī)蛭總增重率分別為102.33%±12.12% 和114.33%±14.81%，高于其余各組；試驗1#、2#組總飼料系數(shù)分別為3.57±0.31和3.41±0.25，低于其余各組；試驗1#、2#組日本醫(yī)蛭存活率分別為88.00%±5.64%和87.00%±4.23%，高于其余各組。

關(guān)鍵詞：日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponia）；嗜水氣單胞菌；增重率；飼料系數(shù)；存活率

日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponia Whitman，1886）屬于醫(yī)蛭科（Hirudinidae Whitman，1886），醫(yī)蛭屬（Hirudo Linnaeus，1758），別名水蛭、稻田醫(yī)蛭。此種以人、牲畜和蛙的血液為食，在我國分布較廣，江蘇、山東、湖北、四川、吉林、河南、內(nèi)蒙古、遼寧等地均有發(fā)現(xiàn)[1]。日本醫(yī)蛭屬于吸血類水蛭，其體內(nèi)含有水蛭素（Hirudin）[2，3]。水蛭素最早是從歐洲醫(yī)蛭（Hirudo medicinalis）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離鑒定的[4，5]，具有抗凝、抗血栓、纖溶性和降血脂等作用。Kim 等[6]報道了水蛭素在預(yù)防和治療心血管病方面的功效。日本醫(yī)蛭又是一種重要的中藥材，我國明朝李時珍的《本草綱目》已有記載，主要用來治療跌打損傷、女子月閉及產(chǎn)后血暈等癥狀。

近年來，由于日本醫(yī)蛭的醫(yī)用價值和經(jīng)濟價值，人類亂捕亂抓現(xiàn)象極其嚴重，天然種群數(shù)量不斷減少，為保證其自然資源的穩(wěn)定性和可持續(xù)性，人工養(yǎng)殖勢在必行。目前，人工養(yǎng)殖日本醫(yī)蛭因密度大，導(dǎo)致疾病頻發(fā)，死亡率高，而日本醫(yī)蛭中的腸道工程菌具有分解蛋白質(zhì)和脂肪、吸收血細胞、調(diào)節(jié)腸道微生物種群、預(yù)防疾病等特點[7]。因此，本試驗以前期實驗為基礎(chǔ)，在日本醫(yī)蛭的飼料中加入不同濃度的腸道工程菌，從而檢驗?zāi)c道工程菌對日本醫(yī)蛭增重率和成活率的影響，確定腸道工程菌與日本醫(yī)蛭飼料的最佳配比濃度，為日本醫(yī)蛭及其他吸血類水蛭的人工養(yǎng)殖及疾病預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

日本醫(yī)蛭在遼寧省遼中縣周邊有河溝的地區(qū)采集，健康無病，平均每條體質(zhì)量0.24 g。采集的日本醫(yī)蛭暫養(yǎng)至580 mm×380 mm×250 mm的60目網(wǎng)箱中，網(wǎng)箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，并加入曝氣24 h以上的自來水，并以此作為日本醫(yī)蛭的養(yǎng)殖用水，其水溫21.3～27.5 ℃，pH 為7.2～7.4 ，溶解氧為6.02～9.13 mg/L，空氣濕度為48%～71.5%RH。

1.2 腸道工程菌的分離與鑒定

隨機挑選暫養(yǎng)的日本醫(yī)蛭，經(jīng)10 mg/L聚維酮碘消毒5 min，高壓滅菌麻醉劑[8]麻醉后，腹部朝上固定到酒精消毒的解剖盤上解剖，解剖后消化道的內(nèi)容物用無菌生理鹽水清洗，再用無菌棉簽在腸道內(nèi)壁擦拭后，涂布到血瓊脂培養(yǎng)基[9]上，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)出的細菌通過16S rDNA-1500 bp測序快速鑒定菌種，鑒定的菌種為腸道共生菌（圖1、圖2）。根據(jù)前期實驗確定的菌種的種群數(shù)量選取腸道共生菌中的優(yōu)勢菌種S2作為試驗用腸道工程菌，其中菌種S2的DNA序列通過NCBI-Blast比對與嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）相似度達到99.4%，因此確定S2菌種為嗜水氣單胞菌。

1.3 試驗動物分組

挑取饑餓健康的日本醫(yī)蛭進行分箱試驗，每箱50尾醫(yī)蛭，并設(shè)有3組平行，其平均體質(zhì)量≥0.2 g；以醫(yī)蛭消化道上分離出來的嗜水氣單胞菌為菌種來源，通過血平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，制得2.4×108 cfu/mL嗜水氣單胞菌，再分別以新鮮豬血和人工飼料（見表1）為基礎(chǔ)飼料配比不同濃度的嗜水氣單胞菌作為本次試驗的考察因素（表2），以日本醫(yī)蛭增重率、飼料系數(shù)、存活率做評價指標；并以對照0#組為參照，優(yōu)選日本醫(yī)蛭腸道工程菌與食用飼料的最佳配比濃度。

1.4 日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖管理

日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖采用室內(nèi)網(wǎng)箱水養(yǎng)法，把日本醫(yī)蛭放入380 mm×275 mm×140 mm的60目網(wǎng)箱中，網(wǎng)箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，并加入曝氣24 h的養(yǎng)殖用水，將豬血和人工飼料分別配比成含有不同濃度的嗜水氣單胞菌，然后灌制豬大腸放入網(wǎng)箱中投喂，投喂飼料按照每箱日本醫(yī)蛭200 ml量投喂。養(yǎng)殖周期為30 d（2015年8月19日至2015年9月22日），投喂頻率為1次/5 d，共計6次。試驗中注意觀察醫(yī)蛭飽食后狀態(tài)及其活動。試驗期間，保持室內(nèi)安靜，通風(fēng)良好，觀察醫(yī)蛭存活情況，及時挑出病蛭及死蛭（根據(jù)養(yǎng)殖情況及時換水），保持清潔的養(yǎng)殖環(huán)境及一定的濕度。

1.5 日本醫(yī)蛭樣品采集與數(shù)據(jù)分析處理

試驗開始前，選取暫養(yǎng)后日本醫(yī)蛭100尾，稱量日本醫(yī)蛭總體質(zhì)量（精確到0.01 g），計算日本醫(yī)蛭個體平均體質(zhì)量，稱量前用潤濕的紗布除去蛭體表附著的臟物和水分。試驗分組后，測定每箱日本醫(yī)蛭的總體質(zhì)量。在試驗期間，每次飼料投喂前后按試驗分組分別統(tǒng)計存活日本醫(yī)蛭尾數(shù)以及存活日本醫(yī)蛭總體質(zhì)量，計算日本醫(yī)蛭體質(zhì)量增長率、飼料系數(shù)和成活率，最后按照日本醫(yī)蛭體重增重率、飼料系數(shù)、存活率綜合指標值確定嗜水氣單胞菌與日本醫(yī)蛭飼料的最佳配比濃度。

試驗描述結(jié)果數(shù)值用“平均值±標準差（Mean±SD）”表示，采用SPSS13.0在a=0.05水平下進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析后進行組間兩兩（LSD）比較和顯著性檢驗。質(zhì)量增長率、飼料系數(shù)和成活率見公式一、二、三。

W1：每次飼料試驗投喂前醫(yī)蛭的個體體質(zhì)量（g），W2：每次飼料試驗投喂5 d后醫(yī)蛭的個體體質(zhì)量（g），W3：每次飼料試驗投喂后醫(yī)蛭的個體體質(zhì)量（g），S1：試驗開始時醫(yī)蛭的尾數(shù)（尾），S2：每次飼料試驗結(jié)束時醫(yī)蛭的尾數(shù)（尾）

2 結(jié)果

2.1 以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料配比不同濃度的嗜水氣單胞菌對日本醫(yī)蛭各項評價指標的影響

由表3可知，第一次飼料試驗，試驗各組體重增長率明顯高于后幾次飼料試驗，各組在試驗期間體重增長率有一定差異，試驗2#組日本醫(yī)蛭總增重率最高，為804.99%±56.16%，顯著高于0#、1#、4#組（P<0.05），其次是3#組，為682.33%±43.11% 。由表4可知，各組在試驗期間日本醫(yī)蛭飼料系數(shù)有一定差異，但試驗后2#組的總飼料系數(shù)低于0#、1#組，為2.71±0.32，但并不顯著（P>0.05），最低是3#組，為2.61±0.19。由表5可知，各組在試驗期間日本醫(yī)蛭存活率有一定差異，試驗2#、3#組日本醫(yī)蛭存活率高于其余3組，分別為93%±4.23%，96.00%±0.00%，顯著高于4#組（P<0.05）。

2.2 以人工配合飼料為基礎(chǔ)飼料配比不同濃度的嗜水氣單胞菌對日本醫(yī)蛭各項評價指標的影響

由表6可知，第一次和第二次飼料試驗，試驗各組體重增長率明顯高于后幾次飼料試驗，第一次飼料試驗體重增長率最高，當(dāng)水溫降低到24 ℃以下時，0#、3#、4#各組在試驗后期體重增重率還出現(xiàn)負增長，并且各組在試驗期間體重增長率有一定差異，試驗1#、2#組日本醫(yī)蛭增重率高于其余組，分別為102.33%±12.12% 和114.33%±14.81%，顯著高于3#組（P<0.05）。由表7可知，各組在試驗期間日本醫(yī)蛭飼料系數(shù)有一定差異， 1#、2#組飼料系數(shù)分別為3.57±0.31和3.41±0.25，低于其余各組，并顯著低于0#、4#組（P<0.05）。由表8可知，各組在試驗期間日本醫(yī)蛭存活率有一定差異，試驗1#、2#組日本醫(yī)蛭在存活率顯著高于其余3組（P<0.05），分別為88.00%±5.64%和87.00%±4.23%。

2.3 兩種基礎(chǔ)飼料配比不同濃度的嗜水氣單胞菌其日本醫(yī)蛭各項評價指標的相互比較

由表9可知，以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料各試驗組日本醫(yī)蛭總增重率顯著高于人工飼料為基礎(chǔ)飼料各試驗組日本醫(yī)蛭總增重率（P<0.05）。由表10可知，以人工飼料為基礎(chǔ)飼料各試驗組飼料系數(shù)高于以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料各試驗組飼料系數(shù)。其中，0#、3#、4#組以人工飼料為基礎(chǔ)飼料各試驗組飼料系數(shù)顯著高于以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料各試驗組飼料系數(shù)（P<0.05）。由表11可知，除1#組外，以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料各試驗組總存活率高于以人工飼料為基礎(chǔ)飼料各試驗組。其中，以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料3#組的總存活率顯著高于以人工飼料為基礎(chǔ)飼料3#組的總存活率（P<0.05）。

3 討論

日本醫(yī)蛭生活于水田、池塘和水溝里，以人、畜的血液為食，具有特殊的攝食性。如何能夠在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中提高日本醫(yī)蛭的產(chǎn)量，并降低其死亡比例是急需解決的問題。目前，為解決水產(chǎn)養(yǎng)殖面臨的水體富營養(yǎng)化、農(nóng)藥殘留、病原微生物抗耐藥性問題，提高水產(chǎn)經(jīng)濟動物成活率和產(chǎn)量，微生態(tài)制劑已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)中。有資料報道，芽孢桿菌能提高鯉魚、異育銀鯽和凡納濱對蝦等水產(chǎn)動物的蛋白酶活性[10-12]，提高大菱鲆和斑節(jié)對蝦的增重率和成活率[13，14]。然而，微生態(tài)制劑用于日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖生產(chǎn)尚未見到有關(guān)報道。筆者曾在前期實驗中從日本醫(yī)蛭腸道中分離出優(yōu)勢工程菌嗜水氣單胞菌，Sivachdran等[15]報道了水蛭腸道工程菌能夠促進血細胞的吸收，所以本試驗通過在日本醫(yī)蛭飼料中配比不同濃度的嗜水氣單胞菌，從而找到能夠提高日本醫(yī)蛭產(chǎn)量和降低日本醫(yī)蛭死亡率的最佳配比濃度。

兩種基礎(chǔ)飼料配比不同濃度的嗜水氣單胞菌試驗中，第一次飼料試驗日本醫(yī)蛭增重率都不同程度高于后期飼料試驗日本醫(yī)蛭增重率，說明日本醫(yī)蛭在饑餓狀態(tài)下的攝食量要高于正常養(yǎng)殖狀態(tài)下日本醫(yī)蛭的攝食量。在以人工配合飼料為基礎(chǔ)飼料配比試驗中，0#、3#、4#各組在試驗后期體重增長率出現(xiàn)負增長，而以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料配比試驗卻未出現(xiàn)此狀況，這說明在相同的養(yǎng)殖環(huán)境和水溫條件下，當(dāng)水溫降到24 ℃以下時，以人工配合飼料為基礎(chǔ)飼料對日本醫(yī)蛭的攝食狀況影響很大，出現(xiàn)其攝食量小于代謝量，從而出現(xiàn)負增長。

從表3-表8的試驗結(jié)果分析表明，兩種基礎(chǔ)飼料配比試驗中，與對照0組比較，飼料中適當(dāng)添加嗜水氣單胞菌，日本醫(yī)蛭的增重率和成活率都有所提高，而飼料系數(shù)有所降低，這可能是因為以下幾點原因：①嗜水氣單胞菌能夠調(diào)節(jié)日本醫(yī)蛭消化道的內(nèi)環(huán)境，恢復(fù)和維持正常微生物的平衡，從而抑制了大腸桿菌、沙門氏菌等條件致病菌的增殖，使得消化機能正常運行而不紊亂。②日本醫(yī)蛭腸道中繁殖的嗜水氣單胞菌能在代謝過程中能合成多種維生素和氨基酸，從而增加營養(yǎng)物質(zhì)供給宿主利用，有明顯的加強代謝的作用。③嗜水氣單胞菌可能刺激日本醫(yī)蛭免疫系統(tǒng)的建立，增強了其防病、抗病能力。④嗜水氣單胞菌能分解蛋白質(zhì)、脂肪，促進對血細胞的吸收，促進了醫(yī)蛭對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收。

從表9-表11的試驗結(jié)果分析，綜合比較兩種基礎(chǔ)飼料配比試驗中的各試驗組總增重率、飼料系數(shù)和存活率的綜合指標可看出，以新鮮豬血為基礎(chǔ)飼料各試驗具有總增率高、飼料系數(shù)低和存活率較高等特點，這可能與日本醫(yī)蛭攝食習(xí)性有關(guān)。自然生態(tài)條件下，日本醫(yī)蛭以哺乳動物的血液為食，哺乳動物的新鮮血液主要含有血漿和有形成分兩部分，其中有形成分包括紅細胞、白細胞和血小板；血漿主要成分有血漿蛋白、非蛋白質(zhì)的有機物和無機鹽；而人工飼料所用血球蛋白粉是新鮮血液在低溫處理條件下，經(jīng)去除血漿、濃縮的血球經(jīng)高溫瞬間噴霧干燥后得到的粉末，再添加復(fù)合維生素預(yù)混合飼料、氯化鈉和精氨酸，以滿足飼料對日本蛭的誘食性及其營養(yǎng)需求；人工飼料雖然保留了高品質(zhì)的營養(yǎng)成分，但血球蛋白粉與血細胞的形態(tài)有顯著差異，這可能就影響了日本醫(yī)蛭腸道工程菌對人工飼料吸收作用，從而最終表現(xiàn)出兩種基礎(chǔ)飼料配比試驗中的各試驗組總增重率、飼料系數(shù)和存活率一定的差異。

總之，日本醫(yī)蛭在人工養(yǎng)殖過程中，適當(dāng)加入一定量的嗜水氣單胞菌可以提高日本醫(yī)蛭產(chǎn)量，在一定密度下降低其死亡率，本文的研究為日本醫(yī)蛭大規(guī)模養(yǎng)殖生產(chǎn)提供了一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

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