蝴蝶蘭莖尖脫毒再生體系建立與優(yōu)化

朱嬌++馬蕾++劉芳++楊元軍++張冀華++泮海軍++董道峰

摘要：以蝴蝶蘭莖尖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，研究培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度、糖濃度、激素比例及外植體大小對(duì)其莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)成活率及脫毒效果的影響。結(jié)果表明，蝴蝶蘭莖尖組培脫毒外植體大小為0.2～0.4 mm，并附帶1個(gè)葉原基，可脫除ORSV病毒。適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽與6-BA濃度有利于提高莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的成活率。培養(yǎng)基中添加15 g/L的綿白糖有利于莖尖的成活及生長(zhǎng)。1/3MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA為最適宜的蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：蝴蝶蘭；脫毒；莖尖；再生

中圖分類號(hào)：S682.310.4+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）06-0060-04

AbstractThe shoot tip of Phalaenopsis amabilis was cultured as explant to study the effects of inorganic salt concentration， sugar concentration， hormone proportion and explant size on survival rate and virus-free effect of shoot tip growing point. The results showed that when the explant had the size of 0.2 to 0.4 mm and attached 1 leaf primordium， the ORSV could be eradicated. When the inorganic salt and sugar concentration decreased properly， the survival rate of shoot tip growing point could improve. When 15 g/L soft sugar was added into culture medium， it was beneficial to survival and growth of shoot tip. The medium containing 1/3 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA was suitable for shoot tip culture of Phalaenopsis amabilis.

KeywordsPhalaenopsis amabilis； Virus free； Tip shoot； Regeneration

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）屬熱帶或亞熱帶的氣生蘭，因其株型美觀，花形奇特，色彩艷麗，花期長(zhǎng)久，素有“蘭花皇后”之美稱，在國(guó)際花卉市場(chǎng)上具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。隨著蝴蝶蘭種苗組培快繁技術(shù)的發(fā)展以及國(guó)際貿(mào)易的日趨頻繁，蘭花病毒病成為阻礙蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[2]。由于病毒可通過(guò)蚜蟲、飛虱、機(jī)械性傷口等進(jìn)行傳播，而蝴蝶蘭商品苗主要采用組織培養(yǎng)方式快繁，若感染病毒，很容易快速蔓延造成嚴(yán)重?fù)p失。目前蘭花病毒病害沒有有效的防治方法，為了從根源上避免病毒的擴(kuò)散和危害，研究蝴蝶蘭的脫毒技術(shù)對(duì)培育無(wú)病毒種苗具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

莖尖培養(yǎng)不僅是組織培養(yǎng)的一種重要手段，也是脫毒的關(guān)鍵步驟之一。前人研究表明，病毒在植物體內(nèi)分布不均，一般頂端分生組織細(xì)胞的分裂速度較快，超過(guò)病毒的繁殖速度，因此病毒含量很低，甚至不含病毒[3]。莖尖的成活率和脫毒率是決定莖尖脫毒技術(shù)成功的兩個(gè)關(guān)鍵因子。褐化是導(dǎo)致莖尖培養(yǎng)成活率降低的主要原因。褐化程度受植物基因型、取材時(shí)間、莖尖長(zhǎng)度、培養(yǎng)基類型、激素配比、培養(yǎng)基添加物及培養(yǎng)方式等因素的影響。莖尖越小，褐化越嚴(yán)重，越容易死亡，尤其對(duì)于蘭花類植物，褐化尤為嚴(yán)重，是影響莖尖成活率的關(guān)鍵問題之一[4，5]。目前已在馬鈴薯、草莓、甘蔗、百合、葡萄等植物中利用莖尖脫毒技術(shù)成功獲得了脫毒種苗[6-10]。有關(guān)蝴蝶蘭脫毒種苗的研究已有報(bào)道[11，12]，但研究重點(diǎn)在于比較各種脫毒方法，對(duì)于莖尖再生培養(yǎng)體系的建立未進(jìn)行深入研究。景維杰等[13]對(duì)培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度、鉀濃度比例、氮素形態(tài)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了試驗(yàn)優(yōu)化，研究表明1/5大量元素的無(wú)機(jī)鹽濃度適合蝴蝶蘭莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的培養(yǎng)，一定濃度范圍內(nèi)，提高氮源中硝態(tài)氮的比例，或提高培養(yǎng)基中鉀的濃度比例，均有助于蝴蝶蘭莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的存活，但該研究并未對(duì)影響莖尖成活率的基本培養(yǎng)基及糖濃度等重要因素進(jìn)行深入研究[13]。

本試驗(yàn)系統(tǒng)研究了莖尖大小、基本培養(yǎng)基、激素配比、糖濃度等對(duì)蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)再生的影響，旨在建立高效的蝴蝶蘭莖尖脫毒再生體系，為蝴蝶蘭脫毒種苗的研究及生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒舌蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV） 復(fù)合感染的蝴蝶蘭1031組培苗為試驗(yàn)材料。CymMV和ORSV病毒檢測(cè)試劑盒購(gòu)自安德珍生物技術(shù)有限公司（ADGEN Biotechnology Co.， Ltd.）。

1.2方法

蝴蝶蘭組培苗的無(wú)菌操作在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。在 40倍冷光源解剖鏡下用解剖針和手術(shù)刀剝?nèi)ドL(zhǎng)點(diǎn)外圍的幼葉，露出微凸、穹形、發(fā)亮的生長(zhǎng)點(diǎn)。切下生長(zhǎng)點(diǎn)快速放在培養(yǎng)基上表面。基本培養(yǎng)基試驗(yàn)、激素配比試驗(yàn)及糖濃度試驗(yàn)所用外植體均為0.2～0.4 mm帶1個(gè)葉原基的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。每瓶接種3個(gè)莖尖，每個(gè)處理8瓶，重復(fù)2次。接種后暗處理2周，然后進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照條件800 lx，光照時(shí)間為10 h/d，溫度22～28℃。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)莖尖的成活率、褐化率及死亡率。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。

1.2.1基本培養(yǎng)基試驗(yàn)基本培養(yǎng)基共設(shè)5個(gè)處理：M1，MS；M2，1/2MS；M3，1/3MS；M4，1/4MS；M5，1/5MS。其中，1/2MS、1/3MS、1/4MS、1/5MS是指將MS中的大量元素變?yōu)樵瓉?lái)的1/2、1/3、1/4、1/5。每個(gè)處理培養(yǎng)基均添加3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA + 25 g/L綿白糖+ 1.0 g/L AC（活性炭）+15%CW（椰乳）。

1.2.2激素配比試驗(yàn)激素配比共設(shè)5個(gè)處理：A1，8.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA；A2，5.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA；A3，3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；A4，2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；A5，1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA。每個(gè)處理培養(yǎng)基均添加1/2MS +25 g/L綿白糖+1.0 g/L AC +15%CW。

1.2.3糖濃度試驗(yàn)綿白糖濃度共設(shè)5個(gè)處理：T1，10 g/L；T2，15 g/L；T3，20 g/L；T4，25 g/L；T5，30 g/L。其中每種培養(yǎng)基均添加1/2MS+ 3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC +15%CW。

1.2.4莖尖大小試驗(yàn)莖尖大小共設(shè)3個(gè)處理：S1，≤0.2 mm，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)不帶葉原基；S2，0.2～0.4 mm，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)帶1個(gè)葉原基；S3，≥0.5 mm，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)帶2個(gè)葉原基。培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L綿白糖+1.0 g/L AC+15% CW。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2007及SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以鄧肯氏新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)，比較0.05水平上的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的影響

由表1可見，無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)蝴蝶蘭莖尖褐化率、成活率及外植體生長(zhǎng)有顯著影響。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著無(wú)機(jī)鹽濃度的降低，莖尖成活率顯著增加。無(wú)機(jī)鹽濃度太高或是太低均導(dǎo)致莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)黃褐化、玻璃化明顯。其中M3處理的莖尖葉色翠綠，長(zhǎng)勢(shì)健康，為莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)的最適宜濃度。

2.2激素配比對(duì)蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的影響

由表2可見，不同激素配比的培養(yǎng)基中蝴蝶蘭莖尖外植體褐化率、成活率及長(zhǎng)勢(shì)特征差異明顯。A3處理莖尖成活率最高，但莖尖芽小，長(zhǎng)勢(shì)弱；而A5處理成活率雖較A3處理略低，但莖尖生長(zhǎng)勢(shì)健壯，為最適激素配比。另外，高濃度的6-BA易導(dǎo)致莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)黃褐化、玻璃化嚴(yán)重，且有變異現(xiàn)象。

2.3糖濃度對(duì)蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的影響

由表3可見，糖濃度對(duì)蝴蝶蘭莖尖褐化率、成活率有顯著的影響，且不同糖濃度處理外植體長(zhǎng)勢(shì)特征差異明顯。隨著糖濃度的升高，莖尖成活率顯著降低，糖濃度太高或是太低均導(dǎo)致莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)黃褐化、玻璃化明顯。其中T2處理莖尖長(zhǎng)勢(shì)健康，葉色翠綠，為莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)組織培養(yǎng)最適宜的糖濃度。

2.4莖尖大小對(duì)其組培成活率和脫毒效果的影響

隨著外植體增大，莖尖培養(yǎng)成活率相應(yīng)提高，主要是因?yàn)椴牧显叫?chuàng)傷面積相對(duì)越大，成活率低。其中，S1處理莖尖全部死亡；S2處理莖尖成活率為8.3%，有2株未檢測(cè)到ORSV病毒，病毒脫除率為40%，表明莖尖大小介于0.2～0.4 mm之間，帶1個(gè)葉原基，有利于脫除ORSV病毒；S3 處理莖尖成活率為21.6%，但均未脫除CymMV和ORSV病毒，表明莖尖大小大于0.5 mm，帶2個(gè)葉原基，外植體成活率雖高，但不能達(dá)到脫毒效果（表4）。

3討論與結(jié)論

莖尖大小是影響脫毒率的主要因素。通常切取的莖尖越小，脫除效果越好，但成活率低。不同的植物種類因基因型和個(gè)體的差異，脫毒莖尖長(zhǎng)度也不相同。席夢(mèng)利等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)宜興百合莖尖接種長(zhǎng)度為0.8～2.0 mm時(shí)，成活率可達(dá)90%～100%，但起不到脫除病毒的作用；只有0.8 mm以下的莖尖才有可能獲得無(wú)病毒植株。而本研究結(jié)果表明蝴蝶蘭莖尖大小介于0.2～0.4 mm且?guī)?個(gè)葉原基時(shí)，有利于脫除ORSV病毒，但莖尖生長(zhǎng)緩慢，易褐化死亡，成苗率較低。這可能是由于植物材料不同所致。

MS培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度對(duì)莖尖成活率影響顯著，本研究中隨著培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度的降低，莖尖成活率明顯增加。景維杰等[13]研究表明，培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的外植體存活率有重要影響，無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高造成的培養(yǎng)基高滲透壓逆境降低了蝴蝶蘭莖尖組織培養(yǎng)的存活率，這與本研究的結(jié)果一致。

激素配比對(duì)植物組織培養(yǎng)有重要的影響。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)高或過(guò)低的激素配比均不利于莖尖的成活，激素配比過(guò)高容易導(dǎo)致莖尖發(fā)生變異死亡，過(guò)低又不利于誘導(dǎo)生長(zhǎng)點(diǎn)啟動(dòng)，這與賀嘉[15]的研究結(jié)果一致。糖濃度是影響培養(yǎng)基滲透壓的重要因素，而滲透壓又直接影響了莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的成活率，本研究結(jié)果表明糖濃度與莖尖成活率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜上可得，1/3MS+ 1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +15 g/L綿白糖為最適宜的蝴蝶蘭莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)基。本試驗(yàn)中蝴蝶蘭莖尖存活率雖有所提高，但脫毒比率仍然較低。分析原因可能是：第一，本研究采用CymMV和ORSV兩種病毒復(fù)合感染蝴蝶蘭，加大了脫除病毒的難度；第二，莖尖剝離技術(shù)不精準(zhǔn)，還有待進(jìn)一步改進(jìn)。因此建議在以后的研究中對(duì)于復(fù)合感染的材料，可以先使用病毒抑制試劑（如病毒唑等）進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，降低外植體所帶病毒的濃度，再配合莖尖培養(yǎng)脫毒；其次，在莖尖基本培養(yǎng)基中添加抗褐化試劑如活性炭或抗壞血酸，以減弱外植體的褐化程度，以提高莖尖成活率。

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