禽流感H9N2病毒樣顆粒疫苗佐劑的篩選及其對雞的免疫效果評價

周康森，顧 盼，王玲玲，吳勝昔，蔡家利

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

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禽流感H9N2病毒樣顆粒疫苗佐劑的篩選及其對雞的免疫效果評價

周康森，顧 盼，王玲玲，吳勝昔，蔡家利

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

為使禽流感H9N2病毒樣顆粒疫苗盡早投入市場，有效防控H9N2禽流感的流行，擬從油乳、ISA 206和微球佐劑中篩選出一種最適用于禽流感H9N2病毒樣顆粒疫苗的佐劑。首先對H9N2病毒樣顆粒血凝效價及血凝素(HA)含量的測定，然后制備出禽流感H9N2病毒樣顆粒油乳疫苗、ISA 206佐劑疫苗、微球疫苗，并對其穩(wěn)定性、無菌性和安全性等進行檢驗。通過溶菌酶含量、血凝抑制試驗以及T淋巴細胞刺激指數(shù)等試驗檢測其非特異性免疫和特異性免疫水平。結(jié)果表明：微球VLP疫苗組溶菌酶含量高于其他各疫苗組(p﹤0.01)，能引起非特異性免疫；微球VLPs(口服)疫苗組的血凝抑制滴度高于其他各疫苗組(p﹤0.01)，抗體增長趨勢與陽性對照組無顯著差異(p>0.05)，產(chǎn)生了有效的體液免疫應答；微球VLP疫苗(口服)疫苗組T淋巴細胞刺激指數(shù)最高。微球口服疫苗其免疫原性強，安全穩(wěn)定，能誘導機體產(chǎn)生有效的免疫應答，可為新型病毒樣顆粒疫苗佐劑的選擇提供參考。

H9N2禽流感病毒；病毒樣顆粒； 佐劑；微球

禽流感(avian influenza,AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起家禽感染的一類傳染性疾病，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1-4]。H9N2亞型屬低致病性禽流感病毒雖然不會導致感染家禽大批量死亡，但因其傳播速度快，能使蛋雞產(chǎn)蛋量下降等特點，其危害性不容忽視[2,5-6]。目前，我國主要采用免疫預防與捕殺相結(jié)合的措施來控制H9N2亞型禽流感病毒的爆發(fā)。市場上主要以滅活疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗來預防H9N2亞型禽流感的流行，但因這幾類疫苗存在免疫效果差和安全性等問題，因此研發(fā)一種新品種疫苗迫在眉睫。

近年來，利用分子生物學等相關技術已成功構(gòu)建了H9N2亞型病毒樣顆粒(virus-like particles,VLP)[4,7-10]，因其在形態(tài)上與真正的病毒粒子相似且具有與完整病毒相似的免疫原性以及不含核酸，所以在動物機體內(nèi)不能自主復制，安全性高。佐劑可以增強抗原的免疫原性或改變免疫類型，但目前尚未有用于病毒樣顆粒使用的佐劑[11-13]。本研究主要用油乳佐劑、ISA 206佐劑和微球佐劑與禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒制成不同佐劑類型的病毒樣顆粒疫苗，并檢測其非特異性免疫和特異性免疫情況，篩選出最適合于禽流感H9N2亞型病毒樣顆粒的佐劑，為研制出新型病毒樣顆粒疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒種與實驗動物

H9N2病毒尿囊液及H9N2亞型病毒樣顆粒，由重慶理工大學藥學與生物工程學院實驗室制備并保存。1日齡SPF雞，購于長壽區(qū)長水雞廠，籠養(yǎng)至10日齡用于免疫實驗。

1.2 主要試劑和儀器

BCA檢測試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。血凝素ELISA檢測試劑盒及溶菌酶測試盒購自上海酶聯(lián)生物技術有限公司。雞淋巴細胞分離液購自天津瀚洋生物制品科技有限公司。酶標儀購自美國Thermo Fisher公司。冷凍干燥機購自基因有限公司。

1.3 H9N2亞型病毒樣顆粒血凝效價及血凝素(HA)含量測定

采用血球凝集實驗[10]檢測VLPs的血凝效價。在V型血凝板中，各孔加入30 μL生理鹽水，取等量待測樣品，通過倍比稀釋至第12孔，進行平行3次實驗，并以生理鹽水作為陰性對照。然后加入30 μL 1%雞血紅細胞，混勻后37 ℃靜置30 min，觀察結(jié)果。取制備好的H9N2亞型病毒樣顆粒上清液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，并采用血凝素(HA)定量ELISA檢測試劑盒測定上清液的血凝素(HA)含量。

1.4 病毒樣顆粒疫苗的制備與質(zhì)量檢驗

1.4.1 油乳佐劑疫苗

準確量取司盤-80 6 mL、白油94 mL，分別與1 g硬脂酸鋁加熱混合均勻制得硬脂酸鋁濃度為0.5%的油相。取適量H9N2亞型病毒樣顆粒上清液與吐溫-80 混合制得含5%吐溫-80的水相，濕熱滅菌，冷卻至室溫備用。油相與水相按3∶1的體積比高速攪拌乳化，2 min/次，共3次，即得油乳劑疫苗，分裝并保存于4 ℃冰箱備用。按疫苗生產(chǎn)規(guī)程對制備好的油乳疫苗進行黏度檢驗、無菌檢驗和穩(wěn)定性檢驗等相關檢驗[11,14]。

老人怏怏不樂地跟進來，站在門口，說，我只想種幾棵豆角……我知道草坪是用來看的，可是不過幾棵豆角，絕對影響不了觀賞……

1.4.2 ISA206佐劑疫苗

按照ISA206佐劑使用說明書進行乳化，勻速攪拌ISA206佐劑，并不斷滴加病毒液，混勻后高速攪拌乳化，乳化時間為30 s，間隔為30 s，共10次。制得的ISA206佐劑疫苗分裝并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ≈苽浜玫腎SA206疫苗進行相關檢驗[5,14]。

1.4.3 微球佐劑疫苗

稱量10 g NaSO4溶于100 mL去離子水中，制得10%(質(zhì)量體積分數(shù))硫酸鈉溶液。稱取2.5 g殼聚糖溶于980 mL去離子水中，加入20 mL乙酸和10 g吐溫-80，充分混勻，制得含2%(體積分數(shù))乙酸和1%吐溫-80(質(zhì)量體積分數(shù))的0.25%殼聚糖溶液，121℃濕熱滅菌備用。在無菌條件下，將2 mL 10%硫酸鈉溶液以1 mL/min的速度逐滴滴入200 mL 0.25%殼聚糖溶液中，超聲20 min，以2 700 r/min的速度離心20 min，取沉淀并洗滌3次，將制備好的微球冷凍干燥。冷凍干燥后的微球與適量病毒樣顆粒上清液吸附一定時間，即得微球佐劑疫苗。按疫苗生產(chǎn)相關文獻及規(guī)程[10]對其進行釋放度、無菌檢驗等相關檢驗。

1.5 試驗動物分組與疫苗免疫

將140只10日齡雛雞隨機分成7組，每組20只，分別為油乳VLP疫苗組、ISA206VLP疫苗組、微球VLP疫苗(口服)、微球VLP疫苗(注射)、VLPs組、H9N2滅活疫苗組及陰性對照組(陰性對照組以PBS為水相制備的疫苗免疫)。疫苗組雞血凝素(HA)免疫劑量為10 μg/只。除微球VLP疫苗(口服)組外，其他各組均采用頸部皮下注射方式免疫。

1.6 非特異性免疫水平測定

試驗雞免疫后第0、14、28 d各組隨機抽取1 mL 雞血液，分離血清，按溶菌酶測試盒說明書測定各組試驗雞溶菌酶含量。

1.7 抗體的檢測

免疫后0、3、7d以及每隔1周，采集各疫苗組及對照組雞的血液0.3～0.4 mL，分離血清，通過血凝抑制試驗[15-16]檢測特異性抗體效價。

1.8 T淋巴細胞刺激指數(shù)的測定

免疫后第14、28、56 d，隨機采取疫苗組和對照組雞的血液，并按淋巴細胞分離方法快速分離淋巴細胞。分離得到的淋巴細胞洗滌后用MTT法[1,17]測定T淋巴細胞增殖能力，從而判斷各組細胞免疫水平。

2 結(jié)果

2.1 H9N2亞型病毒樣顆粒血凝效價及血凝素(HA)含量測定

H9N2亞型病毒樣顆粒血凝試驗結(jié)果顯示： H9N2亞型病毒樣顆粒的血凝效價達1∶256，與H9N2病毒尿囊液血凝效價接近(見表1)。采用血凝素(HA)含量ELISA檢測試劑盒測定其血凝素(HA)含量，結(jié)果顯示血凝素(HA)含量為0.23 mg/mL。

2.2 病毒樣顆粒疫苗的制備與質(zhì)量檢驗

對單相W/O型白油佐劑疫苗和雙相W/O/W型ISA206佐劑疫苗進行加速穩(wěn)定試驗，結(jié)果顯示：經(jīng)加速離心后未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，將制備好的疫苗在(4±2)℃條件下放置12個月，未出現(xiàn)破乳現(xiàn)象。對微球佐劑疫苗在模擬胃液和人工腸液中釋放速率進行測定，結(jié)果表明：微球佐劑疫苗在模擬胃液及人工腸液中勻速緩慢釋放H9N2亞型病毒樣顆粒(見表2)。3種佐劑疫苗在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)和酪胨瓊脂(G.A)培養(yǎng)基上無菌生長。用30日齡健康未免疫雞肌肉或頸部皮下注射油乳佐劑VLP疫苗2 mL，飼養(yǎng)14 d，試驗組與對照組雞均未出現(xiàn)死亡或出現(xiàn)嚴重不良反應，精神狀態(tài)良好，采食量正常。

2.3 非特異性免疫水平測定

如表3所示，疫苗免疫前各組雞的溶菌酶含量無顯著差異(p>0.05)，在免疫試驗階段，溶菌酶的含量隨著雞日齡的增大而增高，其非特異性免疫能力越強。免疫后第14 d和 28 d，微球VLP疫苗組溶菌酶含量均高于其他各組，并存在顯著差異(p<0.05)，其他各疫苗組與對照組均無顯著差異(p>0.05)。結(jié)果表明:微球佐劑疫苗可引起試驗雞非特異性免疫，而其他佐劑疫苗則不能。

表1 血球凝集試驗結(jié)果

注：﹢表示凝集；﹣表示不凝集；±表示疑似凝集

表2 微球佐劑疫苗在模擬胃液和人工腸液中釋放后上清液的A562吸光度

表3 各組溶菌酶含量 μg·mL-1

2.4 抗體的檢測

不同佐劑疫苗組血凝抑制滴度結(jié)果如圖1所示，可見免疫后4周，各疫苗組血凝滴度上升到6Log2以上，僅微球VLP(口服)疫苗組與H9N2滅活疫苗(陽性對照組)無顯著性差異，說明微球佐劑能提高H9N2病毒樣顆粒的免疫原性。免疫后90 d內(nèi)檢測動物體內(nèi)特異性抗體消長規(guī)律曲線(見圖2)，結(jié)果表明：免疫后2周，微球VLP疫苗(口服)血凝抑制滴度為7.95±0.57 Log2，在免疫后第5周，其血凝抑制滴度高達9.68±0.65 Log2，在免疫后第90 d，其血凝抑制滴度降至5.45±0.61 Log2。各疫苗組的特異性抗體持續(xù)時間較長且抗體滴度較高，其中微球VLP疫苗(口服)與陽性對照疫苗組抗體消長趨勢相似，故采用口服給藥方式進行免疫動物，其免疫原性較好。

圖1 不同佐劑H9N2病毒樣顆粒疫苗血清抗體滴度的測定

圖2 免疫后各組蛋雞體內(nèi)特異性抗體增長曲線

2.5 T淋巴細胞刺激指數(shù)的測定

MTT法檢測T淋巴細胞增殖能力結(jié)果如圖3所示。由圖3可見：各疫苗組與PBS(陰性對照組)之間存在顯著性差異(p<0.01)；僅微球VLP疫苗(口服)疫苗組與H9N2滅活疫苗(陽性對照)組之間存在顯著差異(p<0.01)，其他疫苗組均與陽性對照組無顯著差異；微球VLP疫苗(口服)疫苗組與其他3組疫苗組間存在顯著差異(p<0.01)。微球VLP疫苗(口服)疫苗組刺激指數(shù)最高，為1.505 6，但未達到有效刺激值(有效刺激指數(shù)應大于等于3)。因此，從數(shù)據(jù)上可以看出各疫苗組均未產(chǎn)生有效的細胞免疫。

圖3 T淋巴細胞刺激指數(shù)的測定

3 討論

近年來，我國多次爆發(fā)H9N2亞型禽流感疫情，該病毒能引起雞輸卵管黏膜充血、水腫、變形，產(chǎn)蛋量下降，對我國家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前，用于預防H9N2亞型禽流感病毒的疫苗主要有全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗，而我國市場上的H9N2亞型禽流感疫苗均為針對特定毒株制備而成的全病毒滅活疫苗，其存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量小等缺點，已經(jīng)無法滿足預防需求。國外學者[18]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)研制的H9N2亞型禽流感病毒重組HA 蛋白亞單位疫苗，能引起機體有效的免疫應答。亞單位疫苗安全性高，無任何疫苗滅活劑，但其生產(chǎn)成本及設備要求高，無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等缺點。利用反向遺傳學技術制成的減毒活疫苗，其免疫原性強于滅活疫苗，但存在返毒風險，這類疫苗已不允許在禽類中使用。

與傳統(tǒng)禽流感疫苗生產(chǎn)相比，病毒樣顆粒疫苗不依賴于雞胚生產(chǎn)，采用體外細胞培養(yǎng)方式，具有良好免疫原性，安全性高，無返毒風險。到目前為止，已經(jīng)探索了幾種可作為疫苗候選類型的VLPs。多種病毒如人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒等的結(jié)構(gòu)蛋白都能在各種不同的表達系統(tǒng)中自動組裝成病毒樣顆粒[19]。H9N2亞型禽流感病毒樣顆粒在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上與完整的病毒非常相似，能刺激機體產(chǎn)生較為強烈的免疫應答。將制備好的H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗免疫SPF雞后未出現(xiàn)采食量減少和精神萎靡等現(xiàn)象，僅油乳佐劑與H9N2滅活疫苗疫苗組SPF雞免疫后出現(xiàn)黃豆大小腫塊，腫塊在免疫后2周消失，疫苗安全性好。免疫佐劑能增進抗原呈遞細胞(APC)對抗原的加工及呈遞，增強機體對抗原的特異性免疫應答，而本身并無抗原性。通過對蛋雞溶菌酶含量的測定發(fā)現(xiàn)：微球VLP疫苗(口服/注射)組蛋雞體內(nèi)溶菌酶含量高于其他各疫苗組，引起了非特異性免疫應答。通過特異性免疫水平的檢測發(fā)現(xiàn)：不加任何佐劑的VLPs疫苗組SPF雞產(chǎn)生特異性抗體效價較低，與其他疫苗組有顯著差異(p<0.01)，并且其抗體持續(xù)時間較短；加入佐劑的各疫苗組蛋雞的特異性抗體產(chǎn)生快，效價較高。微球佐劑在胃腸液內(nèi)具有緩釋作用，因此微球佐劑疫苗(口服)疫苗組引起機體產(chǎn)生的抗體水平比油乳佐劑和ISA 206佐劑疫苗組高，與H9N2滅活疫苗(陽性對照組)無顯著差異。MTT法檢測細胞免疫水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)：即使試驗各組均未引起有效的細胞免疫，但是微球佐劑疫苗(口服)疫苗組刺激指數(shù)顯著高于其它各疫苗組，說明微球佐劑能夠引起T淋巴細胞增殖。

本研究對H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗佐劑進行篩選及免疫效果評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：微球佐劑能增強病毒樣顆粒的免疫原性，免疫副作用小，免疫持續(xù)時間長，可作為H9N2亞型病毒樣顆粒疫苗的佐劑。

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(責任編輯 劉 舸)

Screening and Immune Protection Evaluation of Different Adjuvanted Avian Influenza H9N2 Virus-Like Particle Vaccines in Chicken

ZHOU Kang-sen，GU Pan，WANG Ling-ling，WU Sheng-xi，CAI Jiao-li

(College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054，China)

In order to have effectively prevention and control of avian influenza H9N2 pandemic, three kind of adjuvanted avian influenza H9N2 virus-like particle vaccines (oil-emulsion，ISA 206 and microspheres) were developed and selected to get the best one for avian influenza H9N2 VLPs by immunity evaluation in chicken. The HA assay was performed to demonstrate the agglutination activity of VLPs and the HA protein content was evaluated by the standard quantification method that is indirect ELISA assay. Then the stability, sterility and security of H9N2 VLPs vaccines were tested before vaccination. HI assay was used to assess the functional antibodies in the sera of immunized chicken to HA. Determination of T lymphocyte stimulation index and lysozyme content were investigated by MTT and lysozyme content detection kit. The results show that chicken orally vaccinated with the microspheres H9N2 VLPs generated higher lysozyme content and HI titers of antibody against H9N2 viruses than other groups(p<0.01) and little or no cellular immune response. The microspheres H9N2 VLPs vaccines provided the best safety, sterility and immunogenicity to chicken and these results indicate a reference for the choice of adjuvanted avian influenza H9N2 VLPs vaccines.

avian influenza H9N2; virus-like particle; adjuvant; microsphere

2017-02-25 基金項目：重慶高校優(yōu)秀成果轉(zhuǎn)化資助項目(KJZH14212)

周康森(1990—)，男，重慶人，碩士研究生，主要從事疫苗與診斷技術研究，E-mail:18290434625@163.com；蔡家利 (1956—),男,重慶人,博士，教授，主要從事動物疫病診斷技術與疫苗研制研究，E-mail:cjl@cqut.edu.cn。

周康森，顧盼，王玲玲，等.禽流感H9N2病毒樣顆粒疫苗佐劑的篩選及其對雞的免疫效果評價[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2017(5):99-104.

format：ZHOU Kang-sen，GU Pan，WANG Ling-ling,et al.Screening and Immune Protection Evaluation of Different Adjuvanted Avian Influenza H9N2 Virus-Like Particle Vaccines in Chicken[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(5):99-104.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.05.017

S855.3

A

1674-8425(2017)05-0099-06