高良姜粗多糖體外降膽固醇效果研究

廖坤梅，白天禾，陳楚華，鐘曉婷，張 鵬，李澤清，諶素華

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

高良姜粗多糖體外降膽固醇效果研究

廖坤梅，白天禾，陳楚華，鐘曉婷，張 鵬，李澤清，*諶素華

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

采用熱水浸提法提取高良姜粗多糖，采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀高良姜粗多糖，并以高良姜粗多糖得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定粗多糖最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明使用無(wú)水乙醇得到的高良姜粗多糖得率最高約為1.58%；采用體外模擬腸道超聲波乳化法制備膽固醇膠束，按照膽固醇試劑盒法檢測(cè)高良姜粗多糖結(jié)合膽固醇膠束能力，結(jié)果表明高良姜粗多糖對(duì)膽固醇膠束的結(jié)合率最高約為76.09%；使用紫外分光光度法測(cè)定高良姜粗多糖結(jié)合膽酸鹽能力，結(jié)果表明其對(duì)?；悄懰徕c的結(jié)合率約為70.18%，對(duì)水合膽酸鈉的結(jié)合率約為79.55%，對(duì)甘氨膽酸鈉的結(jié)合率約為83.04%。由此可見(jiàn)，高良姜粗多糖具有較好的體外降膽固醇效果。

高良姜；粗多糖；膽固醇膠束；膽酸鹽

高良姜為姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖，別名風(fēng)姜、小良姜、高涼姜、良姜等，為衛(wèi)生部認(rèn)定的藥食同源物之一。高良姜營(yíng)養(yǎng)成分豐富，含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、微量元素等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明高良姜具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)高良姜的研究主要集中于黃酮、芳香油等化學(xué)成分，以及抑菌、抗腫瘤、降血脂等藥理功能上[3]，對(duì)高良姜多糖的研究較少。關(guān)于春砂仁、莪術(shù)等其他姜科植物多糖的研究發(fā)現(xiàn)，多種姜科植物多糖都具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用。廣東省湛江市徐聞縣是“高良姜之鄉(xiāng)”，高良姜種植總面積為4 690 hm2，居全國(guó)之首，產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的90%以上[4-7]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，人均膽固醇水平也有了顯著增高，導(dǎo)致冠心病、腦血栓等一系列心腦血管疾病的增多，亟待尋找和開(kāi)發(fā)天然高效的降膽固醇物質(zhì)。高良姜多糖是一種具有極大開(kāi)發(fā)潛力的活性物質(zhì)，其體外結(jié)合膽固醇效果的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

試驗(yàn)采用熱水浸提法提取高良姜粗多糖，并通過(guò)體外結(jié)合膽固醇膠束試驗(yàn)及結(jié)合膽酸鹽試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其體外降膽固醇效果，旨在為加大高良姜的開(kāi)發(fā)利用提供一定科學(xué)依據(jù)，以便于高良姜粗多糖能盡快作為保健食品進(jìn)入市場(chǎng)，幫助高膽固醇人群降低膽固醇水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高良姜：取自徐聞縣，用蒸餾水洗凈后去皮，切片，于60℃恒溫箱中干燥4 h，質(zhì)量恒定后粉碎。過(guò)60目篩，干燥保存待用。

無(wú)水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、氯化鈉、氫氧化鈉等，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司提供；油酸、L-α-卵磷脂，均為分析純，Sigma-Aldrich公司提供；甘氨膽酸鈉水合物、?；悄懰徕c、水合膽酸鈉，均為分析純，Aladdin公司提供；膽固醇，為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；膽固醇試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FD8508型真空冷凍干燥機(jī)，韓國(guó)Ilshin公司產(chǎn)品；Varioskan Flash型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Therom公司產(chǎn)品；HH S21-6型水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；JYL-C020E型料理機(jī)，杭州九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；DD5M型低速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品；N-1000D-W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海愛(ài)朗儀器有限公司產(chǎn)品；DC12H型氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高良姜粗多糖的提取

采用熱水浸提法[8]：稱取20 g高良姜粉，用860 mL蒸餾水溶解，于95℃條件下加熱4 h，期間每隔20 min攪拌1次，使多糖盡量溶出。粗多糖提取液以轉(zhuǎn)速4 600 r/min離心10 min，過(guò)濾去除姜粉殘?jiān)?。將粗多糖溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，在4℃冰箱中醇析12 h，再次離心，取其沉淀，并用無(wú)水乙醇洗滌3次并晾干。Sevage法脫蛋白6次，冷凍干燥48 h得到高良姜粗多糖粉末。

1.3.2 高良姜粗多糖提取的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)測(cè)定

分別取3份100 mL濃縮后的高良姜粗多糖提取液，分別加入60%，70%，80%，90%乙醇及無(wú)水乙醇100 mL，按1.3.1中的方法操作提取多糖，計(jì)算最終的高良姜粗多糖得率。

1.3.3 高良姜粗多糖總糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法：稱取0.01 g標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶于100 mL蒸餾水中，配制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支具塞試管分別加入上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8 mL，并加蒸餾水補(bǔ)至1 mL。再于冰水浴中加入蒽酮試劑4 mL，管口加蓋，沸水浴10 min。冰水浴冷卻至室溫，于波長(zhǎng)620 nm處測(cè)其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

再取適量質(zhì)量濃度的高良姜粗多糖溶液1 mL，以同樣方法測(cè)定其吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出高良姜總糖含量。

1.3.4 高良姜粗多糖含量的測(cè)定

采用苯酚硫酸法：稱取0.01g葡萄糖溶解于100 mL蒸餾水中，取10支試管分別加入0，0.1～0.9 mL葡萄糖溶液并補(bǔ)充蒸餾水到1 mL，再加入6%苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL，冷卻10 min后搖勻。在室溫下放置20 min，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)OD值。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

再取適量質(zhì)量濃度的高良姜粗多糖溶液1 mL按上述方法測(cè)量其OD值，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗多糖含量。

1.3.5 高良姜粗多糖結(jié)合膽固醇膠束試驗(yàn)

膽固醇膠束溶液配制參考文獻(xiàn)[9]，并稍作改動(dòng)。稱取0.058 g膽固醇（最終質(zhì)量濃度0.5 mmol/L），0.267 g卵磷脂（最終質(zhì)量濃度2.4 mmol/L），0.085 g油酸（最終質(zhì)量濃度1.0 mmol/L）溶解于100 mL甲醇中，超聲波處理5 min，輸出功率84 W（70%），使其充分溶解。氮?dú)獯蹈珊蠹尤?9.8 mmol/L牛磺膽酸鈉溶液、396 mmol/L氯化鈉溶液、pH值7.4磷酸緩沖液各100 mL，然后超聲波處理2次，每次4 min，輸出功率108 W（90%）。處理后的溶液在37℃條件下培養(yǎng)12 h，以形成膽固醇膠束溶液。

取上述膽固醇膠束溶液，加入不同量的高良姜粗多糖溶液，在37℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)2 h，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心20 min。用膽固醇試劑盒測(cè)定膽固醇含量，即分別取每個(gè)樣品2.5 μL滴于96孔板上，并取2.5 μL蒸餾水，2.5 μL校準(zhǔn)液于孔板中，然后分別加入250 μL工作液，混勻，在37℃條件下孵育10 min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定各孔板的吸光度。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。

1.3.6 高良姜粗多糖結(jié)合膽酸鹽試驗(yàn)

試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10]，并稍作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取?；悄懰徕c0.032 g（最終濃度0.3 mmol/L），甘氨膽酸鈉0.029 g（最終濃度0.3 mmol/L），水合膽酸鈉0.026 g（最終濃度0.3 mmol/L），分別溶于200 mL pH值7.6的磷酸緩沖液中，作為母液。

取上述母液0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mL于10 mL具塞比色管中，加入pH值為7.6的磷酸緩沖液補(bǔ)至2 mL，再加入5 mL硫酸，于70℃條件下水浴20 min，取出后冰水浴5 min，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)387 nm處測(cè)量其吸光度。以膽酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，分別繪制3種膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取2，4，6，8，10 mL高良姜粗多糖溶液，加入蒸餾水補(bǔ)至10 mL，并分別加入2 mL模擬胃液（HCl濃度0.1 mol/L），在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2 h，以0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.6。每份樣品中加入膽酸鹽母液4 mL，在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2 h。將混合物轉(zhuǎn)入離心管，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，取上清液按上述方法測(cè)定膽酸鹽含量。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，1個(gè)底物空白，1個(gè)膽酸鹽空白。對(duì)照膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定得出其膽酸鹽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇析中乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)高良姜粗多糖得率的影響不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取高良姜粗多糖結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取高良姜粗多糖結(jié)果

由圖1可知，在試驗(yàn)的條件下以60%，70%，80%，90%乙醇進(jìn)行醇析，高良姜粗多糖得率分別為0.77%，0.93%，1.29%，1.46%；以無(wú)水乙醇進(jìn)行醇析，高良姜粗多糖得率為1.58%。因此，確定以無(wú)水乙醇進(jìn)行醇析為最佳方案。

2.2 高良姜粗多糖中總糖及多糖含量測(cè)定結(jié)果

總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=0.010 7X-0.013 9，R2=0.997 2；

多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=1.041 5X+0.003 4，R2=0.993 8。

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得高良姜粗多糖中總糖含量約為58.68%，多糖含量約為34.22%。

2.3 高良姜粗多糖結(jié)合膽固醇膠束能力測(cè)定

高良姜粗多糖膽固醇膠束結(jié)合率見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著高良姜粗多糖溶液體積的增加，與膽固醇膠束結(jié)合率呈上升趨勢(shì)，并在加入10 mL高良姜粗多糖溶液（約含有7.5 mg高良姜多糖）后曲線趨于平緩，結(jié)合率最高約為76.09%。說(shuō)明高良姜粗多糖能夠有效地結(jié)合膽固醇，降低膽固醇質(zhì)量濃度。

2.4 高良姜粗多糖結(jié)合膽酸鹽試驗(yàn)

牛磺膽酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=17.744X+0.025 8，R2=0.996 8，

水合膽酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=12.252X+0.012 2，R2=0.996 4，

甘氨膽酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

Y=15.422X+0.028 3，R2=0.996 4.

高良姜粗多糖膽酸鹽結(jié)合率見(jiàn)圖3。

圖2 高良姜粗多糖膽固醇膠束結(jié)合率

圖3 高良姜粗多糖膽酸鹽結(jié)合率

由圖3可知，隨著高良姜粗多糖溶液體積的增加，與3種膽酸鹽的結(jié)合率均呈上升趨勢(shì)。在加入8 mL高良姜粗多糖溶液（約含有6 mg高良姜多糖）后上升趨勢(shì)減緩，在加入10 mL高良姜粗多糖溶液（約含有8 mg高良姜多糖）時(shí)基本達(dá)到最高的結(jié)合率，此時(shí)粗多糖對(duì)牛磺膽酸鹽的結(jié)合率約為70.18%，對(duì)水合膽酸鹽的結(jié)合率約為79.55%，對(duì)甘氨膽酸鹽的結(jié)合率約為83.04%?？梢?jiàn)，高良姜粗多糖有一定的結(jié)合膽酸鹽能力。

3 結(jié)論

（1）采用熱水浸提法提取高良姜粗多糖，采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀高良姜粗多糖，并以高良姜粗多糖得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定粗多糖最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，使用無(wú)水乙醇得到的高良姜粗多糖得率最高，約為1.58%。

（2）采用體外模擬腸道超聲波乳化法制備膽固醇膠束，并用試劑盒測(cè)定其結(jié)合膽固醇膠束能力，在加入10 mL高良姜粗多糖溶液時(shí)，膽固醇結(jié)合率最高，約為76.09%，證明高良姜粗多糖有較好的體外結(jié)合膽固醇膠束能力。

（3）使用分光光度法測(cè)定其結(jié)合膽酸鹽能力，結(jié)果表明在加入10 mL高良姜粗多糖時(shí)，對(duì)?；悄懰猁}的結(jié)合率約為70.18%，對(duì)水合膽酸鹽的結(jié)合率約為79.55%，對(duì)甘氨膽酸鹽的結(jié)合率約為83.04%?？梢?jiàn)，高良姜粗多糖有較好的體外結(jié)合膽酸鹽效果。

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Research on the Effect of Cholesterol Lowering in Vitro of Alpinia officinarum Hance Crude Polysaccharide

LIAO Kunmei，BAI Tianhe，CHEN Chuhua，ZHONG Xiaoting，ZHANG Peng，LI Zeqing，*CHEN Suhua
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

This article used the hot water extraction method to extract the crude polysaccharide of Alpinia officinarum Hance，and determined the best alcohol precipitation concentration by measuring crude polysaccharide of Alpinia officinarum Hance in different alcohol precipitation concentration.The result indicates that by using absolute alcohol，the experiment got the highest crude polysaccharide extraction rate（around 1.58%）.The article used simulated intestinal environment and ultrasonic emulsification method to preparation cholesterol micelle，and uses cholesterol reagent kit to determination the ability of cholesterol micelle combination.In the measuring range of this experience the highest cholesterol micelle combination is about 76.09%. The article also uses ultraviolet spectrophotometric method to determination the ability of bile salt combination.Result shows that the sodium taurocholate combination rate of Alpinia officinarum Hance crude polysaccharide is 70.18%，while the figure for hydration sodium cholate and sodium glycocholate is around 79.55%and 83.04%.It is demonstrate that the crude polysaccharide of Alpinia officinarum Hance has preferable ability of cholesterol lowering in vitro according to this experiment.

Alpinia officinarum Hance；crude polysaccharide；cholesterol micelle；cholate salt

R284

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.029

1671-9646（2017）05b-0004-03

2017-04-25

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（CXXL2014025）。

廖坤梅（1990—），女，在讀本科，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

*通訊作者：諶素華（1973—），女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程專業(yè)教學(xué)與科研。