一例牛支原體與多殺性巴氏桿菌混合感染的診斷與治療

高 鐸，孔令聰，高云航，王 梓，賈博巖，劉樹明，辛九慶，馬紅霞

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院， 吉林長春130118； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所， 黑龍江哈爾濱150001)

一例牛支原體與多殺性巴氏桿菌混合感染的診斷與治療

高 鐸1，孔令聰1，高云航1，王 梓1，賈博巖1，劉樹明1，辛九慶2，馬紅霞1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院， 吉林長春130118； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所， 黑龍江哈爾濱150001)

某肉牛養(yǎng)殖場經(jīng)長途運輸?shù)臓倥１┌l(fā)肺炎，并發(fā)生大規(guī)模死亡。經(jīng)主訴和臨床癥狀的分析、肺臟病變觀察、病原的形態(tài)學檢查、分子生物學鑒定，結(jié)果確診為牛支原體(M.bovis)與莢膜血清多殺性巴氏桿菌(A型P.mutocida)混合感染。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果推薦該場使用恩諾沙星肌肉注射輔以電解多維對患病牛進行治療，疫情得到有效控制。

牛呼吸系統(tǒng)疾病 ； 牛支原體 ； 多殺性巴氏桿菌 ； 混合感染 ； 抗菌藥物敏感性試驗

經(jīng)長途運輸?shù)娜馀Ｒ谆寂：粑到y(tǒng)疾病(Bovine respiratory disease，BRD)，其不但造成一定死亡率，還能影響肉牛育肥，已成為危害肉牛產(chǎn)業(yè)最為嚴重的疾病之一。近年來發(fā)現(xiàn)，牛支原體(Mycoplasmabovis,M.bovis)單獨致病或與多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamutocida,Pm)等細菌混合感染協(xié)同致病成為引發(fā)BRD的重要致病原因之一[1-3]。2013年8月末，通遼市某肉牛養(yǎng)殖場經(jīng)長途運輸?shù)臓倥１┌l(fā)肺炎，并發(fā)生大規(guī)模死亡。該場送檢樣品為發(fā)生肺炎的犢牛肺臟和含有患牛漿液性鼻涕的鼻拭子，通過對主訴和臨床癥狀與肺臟病變的分析，以及實驗室檢驗確診該場暴發(fā)的是M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida混合感染造成的BRD。通過病原體的抗菌藥物敏感性試驗(Antibiotic Susceptibility Testing，AST)結(jié)果，推薦該場使用恩諾沙星肌肉注射輔以電解多維對患病牛進行治療，疫情得以控制，未見新發(fā)病例。報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源 采自通遼市某肉牛養(yǎng)殖場患呼吸系統(tǒng)疾病犢牛的鼻拭子。

1.2 主要試劑Taq酶等，均購自TakaRa公司；PPLO肉湯培養(yǎng)基、腦心浸湯(BHI)培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限責任公司；紅霉素等8種抗生素標準品，均購自中國食品藥品檢定研究院。疊氮鈉、丙酮酸鈉、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 病原分離鑒定 將病牛鼻拭子樣本分別接種于改良的PPLO液體培養(yǎng)基(含青霉素與疊氮鈉)中和BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法參考文獻[1、2]。

1.4 分子生物學鑒定 使用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取M.bovis和牛源P.mutocida基因組。

1.4.1 牛支原體特異性鑒定及16S rRNA序列分析 參考Rifatbegovic等合成M.bovisoppD/F基因特異性引物對疑似菌株進行PCR鑒定，預(yù)計擴增出1 912 bp的目的條帶。參考辛九慶等合成擴增16S-rRNA全長引物，預(yù)計擴增出約1.5 kb的目的條帶[4]。PCR產(chǎn)物測序后與GenBank中登錄菌株的16S rRNA序列比對分析。

1.4.2 牛源多殺性巴氏桿菌特異性鑒定、基因分型 參考Townsend合成P.mutocida種特異性基因引物Kmt1，A、B、D莢膜血清型特異性基因引物capA、capB、capD，使用多重PCR對疑似菌株進行鑒定，預(yù)計擴增出460 bp和1 020 bp的特異性條帶[2]。自行設(shè)計P.mutocida16S rRNA全長引物，預(yù)計擴增出約1.5 kb的目的條帶，引物序列為：Forward：5′-TCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAAC-3′;Reverse：5′-CACCCCAGTCATGAATCATACCGTGGTAA-3′.各PCR產(chǎn)物測序后與GenBank中登錄菌株比對分析。

1.5 菌落計數(shù) 用常規(guī)方法對P.mutocida進行菌落計數(shù)，用倍比稀釋法測定M.bovis的顏色變化單位(Colour change unit,CCU)[5]。動物回歸試驗選取107CFU/mLP.mutocida菌懸液作為接種菌液[2]。P.mutocida和M.bovisAST菌液最佳濃度分別為5×104～5×105CFU/mL和103～104CFU/0.2mL[5-6]。

1.6 動物回歸試驗 取SPF級BALB/c健康小鼠4只，第1～3只胸腔注射菌量為107CFU/mL的3株P(guān).mutocida菌懸液200 μL，第4只胸腔注射無菌生理鹽水作為對照，逐日觀察小鼠發(fā)病及死亡情況。

1.7 抗菌藥物敏感性試驗 根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)的指導方針[6]，參考《支原體學》[5]，將各抗生素溶解并稀釋成2 048 μg/mL的抗生素貯存液。采用改良的微量稀釋法AST測定M.bovis對抗菌藥物的體外敏感性；采用瓊脂稀釋法AST測定P.mutocida對抗菌藥物的體外敏感性。P.mutocida和M.bovisAST的敏感、中度敏感、耐藥標準主要參考CLSI[6]，即氟喹諾酮類：MIC≤0.25定義為敏感，MIC=0.5-1定義為中度敏感，MIC≥2定義為耐藥；大環(huán)內(nèi)酯類：MIC≤16定義為敏感，MIC=32定義為中度敏感，MIC≥64定義為耐藥；四環(huán)素類和氟苯尼考：MIC≤2定義為敏感，MIC=4定義為中度敏感，MIC≥8定義為耐藥。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCCR29213和大腸埃希菌ATCC?25922，其MIC值均在CLSI允許的范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及病理剖檢結(jié)果 主訴：病牛精神沉郁、咳嗽、氣喘、伴有漿液性鼻涕、體溫升高、嚴重者呼吸困難并且進食停止；有的患牛伴有拉稀或繼發(fā)關(guān)節(jié)炎。發(fā)生肺炎的肺臟質(zhì)地變硬，肺臟表面廣泛分布黃白色干酪樣壞死灶(如中插彩版圖1)。

2.2 病原的形態(tài)學檢查結(jié)果 采集的3頭病牛鼻拭子中各分離得到3株疑似M.bovis與3株疑似P.mutocida。疑似M.bovis菌株在低倍顯微鏡下的菌落均呈典型的“油煎蛋”樣(如中插彩版圖2)。疑似牛源P.mutocida在BHI培養(yǎng)基中菌落為圓形、光滑呈露滴狀。取典型菌落涂片，染色鏡檢，均為革蘭陰性小桿菌，美藍染色呈明顯的兩極著色。

2.3 分子生物學鑒定結(jié)果

2.3.1 牛支原體的分子生物學鑒定 利用M.bovisoppD/F基因特異性引物擴增出1 912 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符。證明所分離的3株疑似菌株均為M.bovis。結(jié)果如圖3所示。利用16S rRNA全長引物擴增出約1.5 kb的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖略)，該基因片段測序后使用BLAST對其堿基序列進行分析，結(jié)果顯示，所分離菌株的16S rRNA相應(yīng)序列與模式株P(guān)G45和國內(nèi)臨床分離株HB0801與Hubei-1相應(yīng)序列同源性均為99%，與無乳支原體PG2相應(yīng)序列同源性為98%。

圖3 M.bovis的oppD/F基因的擴增結(jié)果M:DL-2 000; 1-3：P9,P10,P11oppD/F基因PCR產(chǎn)物; 4：陽性對照

圖4 P.mutocida的kmt1+capA基因的擴增結(jié)果M:DL-2 000;1-3:TL-1,TL-2,TL-3kmt1+capA基因PCR產(chǎn)物4:陽性對照

2.3.2 牛源多殺性巴氏桿菌的分子生物學鑒定與基因分型P.mutocida經(jīng)多重PCR均擴增得到460 bp和1 000 bp的特異性條帶，符合kmt1+capA基因擴增結(jié)果，測序后運用BLAST對堿基序列進行分析，其比對結(jié)果與GenBank中P.mutocida36950株同源性均高達99%，個別菌株之間有無意義點突變，證明所分離菌株均為牛源莢膜血清A型P.mutocida。結(jié)果如圖4所示。通過自行設(shè)計的16S rRNA全長引物擴增出約1.5 kb的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖略)，測序后使用BLAST對其堿基序列進行分析，結(jié)果顯示，所分離菌株的16S rRNA與GenBank中P.mutocida36950株同源性均高達99%。

2.4 動物回歸試驗結(jié)果 注射107CFU/mL 3株P(guān).mutocida菌液的小鼠均具有精神不振、食欲下降的癥狀，并在12 h內(nèi)死亡，剖檢各組死亡小鼠，肺臟觸片，堿性美藍染色，可見兩極著色的菌體。對照小鼠24 h內(nèi)全部正常且剖檢后無病理變化。

2.5 抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果 微量稀釋法測定3株M.bovis的MIC顯示，P11對紅霉素耐藥(MIC≥64 μg/mL)，3株M.bovis均對阿奇霉素和吉他霉素敏感(MIC≤16 μg/mL)，對強力霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，對恩諾沙星敏感(MIC≤0.5 μg/mL)，P9對氟苯尼考耐藥(MIC≥8 μg/mL)，P10對氟苯尼考敏感(MIC≤2 μg/mL)；瓊脂稀釋法測定3株P(guān).mutocida的MIC顯示，P.mutocida8除對泰樂菌素中度敏感(MIC=32 μg/mL)外，對其他各抗生素均敏感，其余兩株P(guān).mutocida亦對各抗生素敏感。見表2。

表2 8種臨床常用抗生素對分離菌的藥敏試驗結(jié)果 (μg/mL)

2.6 治療 通過對AST結(jié)果進行比較，推薦該場使用對兩種病原均有較好抑菌作用的恩諾沙星作為治療首選藥物，1次/天，同時輔以電解多維，用于補充機體所需的營養(yǎng)成分，使病牛得以更快康復。據(jù)悉，該場按本實驗室推薦方案進行治療后，疫情得以有效的控制。用藥后，未新增死亡病例，一周之內(nèi)患牛大部分痊愈，未見新發(fā)病例，極大的減少了該場的經(jīng)濟損失。

3 討論

本試驗通過主訴、臨床癥狀的分析、肺臟病變觀察、病原的形態(tài)學檢查、分子生物學鑒定等方法，確認同時從病牛鼻拭子中分離出的兩種微生物分別為M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida，從而確診該場暴發(fā)的是M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida混合感染造成的牛呼吸系統(tǒng)疾病。M.bovis的感染通常伴隨著其他致病菌尤其是P.mutocida的混合感染，且致病菌的混合感染往往可以比單獨感染給患牛帶來更高的發(fā)病率和死亡率，Soehnlen M K.等對美國賓夕法尼亞州采集的90份樣品進行BRD主要病原的檢測，結(jié)果顯示，M.bovis、P.mutocida和溶血性曼氏桿菌單獨感染檢出率分別為41%、1.1%和1.1%，而M.bovis和P.mutocida混合感染檢出率為7.8%，M.bovis和溶血性曼氏桿菌混合感染檢出率為4.4%[7]；在國內(nèi)近幾年BRD混合感染病例中，主要也為莢膜血清A型P.mutocida和M.bovis混合感染[2-3]。目前普遍認為，長途運輸?shù)拳h(huán)境因素刺激是暴發(fā)BRD的重要原因之一。所以，今后合理進行“異地育肥”，在運輸途中通過保健藥物或其他手段緩解應(yīng)激可能是減少該病發(fā)病率的途徑之一。

該場依據(jù)本試驗結(jié)果給出的指導建議，成功控制了由M.bovis與莢膜血清A型P.mutocida混合感染引發(fā)的BRD，對今后治療和控制該疾病的暴發(fā)起到一定的指導作用，提供了理論依據(jù)。如何快速的針對引發(fā)BRD的病原及時提出合理的治療方案將是今后研究的熱點方向之一。

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[2] 孔令聰,高鐸,高云航,等.吉林省育肥牛呼吸系統(tǒng)疾病的分離鑒定及耐藥性檢測[J].中國獸醫(yī)雜志,2014,50(1):34-37.

[3] 肖淦文,彭清潔,崔朋,等.肉牛牛支原體肺炎感染的細菌學研究[J].中國牛業(yè)科學,2012,38(3):22-26.

[4] 辛九慶,李媛,郭丹,等.國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學報,2008,30(9):661-664.

[5] 吳移謀,葉元康.支原體學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2008：16-25.

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[7] Soehnlen M K,Aydin A,Murthy K S,etal.Epidemiology ofMycoplasmabovisin Pennsylvania veal calves[J].Journal of dairy science,2012,95(1):247-254.

2014-08-04

國家自然科學基金項目(31272611)；教育部新世紀優(yōu)秀人才項目(NCET-10-0174)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目(2011-Y05)；吉林省牧業(yè)管理局項目(20120113)

高鐸(1989- )，男，碩士生，從事動物藥理與毒理學研究，E-mail：goddard518@126.com

馬紅霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

S852.65+3

B

0529-6005(2017)04-0049-03