豬MAVS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其多克隆抗體的制備

趙倩楠，應(yīng) 雪，李曉泉，張 珂，李曉寧，梁晶晶，羅廷榮

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室，廣西南寧530004 ；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004)

豬MAVS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其多克隆抗體的制備

趙倩楠1,2，應(yīng) 雪1,2，李曉泉1,2，張 珂1,2，李曉寧1,2，梁晶晶1,2，羅廷榮1,2

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室，廣西南寧530004 ；2.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004)

通過RT-PCR從PK-15細(xì)胞系中擴(kuò)增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-MAVS220，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，重組MAVS經(jīng)純化后免疫4周齡昆明系小鼠制備抗線粒體抗病病毒信號(hào)蛋白(MAVS)多克隆抗體。誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件為IPTG 0.05 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)6 h，重組MAVS以可溶性蛋白和包涵體兩種形式表達(dá)。應(yīng)用該重組蛋白免疫小鼠獲得的抗MAVS多克隆抗體與純化的重組MAVS蛋白反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1∶16 000；該抗體與Poly(I∶C)刺激PK-15細(xì)胞產(chǎn)生的MAVS及與轉(zhuǎn)染了重組MAVS基因真核表達(dá)載體pcDNA3.0-MAVS的BHK-21細(xì)胞表達(dá)的MAVS蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，效價(jià)可達(dá)1∶1 000，特異性良好。

豬MAVS ； 原核表達(dá) ； 多克隆抗體

固有免疫是機(jī)體抵抗外來病毒等微生物入侵的第一道防線。線粒體抗病病毒信號(hào)蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)是RLR(RIG-I-like receptor)信號(hào)通路中關(guān)鍵的接頭蛋白[1]。在病毒感染過程中，胞內(nèi)受體RLR識(shí)別病毒dsRNA，經(jīng)MAVS傳遞引起下游NF-κB和IRF-3等一系列細(xì)胞因子的激活[2]，從而誘導(dǎo)機(jī)體抗病病毒免疫反應(yīng)[3]。NLR家族的NLRX1(又叫NOD9)定位于線粒體外膜，能與MAVS相互作用，抑制MAVS介導(dǎo)的抗病病毒免疫反應(yīng)[4]。EYA4(eyes absent 4)與MAVS結(jié)合并對(duì)MAVS介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)至關(guān)重要[5]。SARS-CoV的ORF3b和ORF6兩個(gè)蛋白定位于線粒體，可以與RIG-1或者M(jìn)AVS結(jié)合從而抑制IFN的產(chǎn)生[6]。HCV通過具有Ser-蛋白酶體活性的NS3/4切割MAVS第508位半胱氨酸，造成MAVS不能正確定位在線粒體外膜上，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，成為HCV逃避宿主免疫機(jī)制的策略之一[7-8]。

目前，養(yǎng)豬業(yè)是我國重要的支柱產(chǎn)業(yè)之一，但常受到豬瘟病毒、豬呼吸與繁殖障礙病毒、口蹄疫病毒等的侵害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了進(jìn)一步研究豬體內(nèi)MAVS在病毒感染過程中的免疫應(yīng)答作用，需要應(yīng)用抗豬MAVS抗體，而該抗體正是目前全世界的生物制品市場(chǎng)中所缺乏的。本試驗(yàn)通過構(gòu)建豬MAVS基因原核表達(dá)載體，表達(dá)純化出重組MAVS蛋白，免疫小鼠從而制備獲得特異性高的抗豬MAVS多克隆抗體，為進(jìn)一步研究豬MAVS與豬病毒性疾病之間的相互作用機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料 PK-15細(xì)胞系、BHK-21細(xì)胞系、pET-32 a(+)質(zhì)粒由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；4周齡昆明系小鼠，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬MAVS基因序列(登錄號(hào)：NM_001097429)，對(duì)MAVS多肽的親疏水性和線性表位等指標(biāo)進(jìn)行了分析，選取MAVS基因序列1 018～1 677共660 bp作為原核表達(dá)的目的基因，設(shè)計(jì)亞克隆引物F：5′-cggaattcagcatggtgccctctaaa-3′；R：5′-cgctcgagatgatgatgatgatgatgccacggagccctagcctc-3′。

1.3 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-MAVS220 本實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)RT-PCR從PK-15細(xì)胞中擴(kuò)增出全長(zhǎng)MAVS基因，克隆至pMD18-T載體并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pcDNA3.0-MAVS(添加了c-Myc標(biāo)簽)。用分別帶有酶切位點(diǎn)EcoRI與XhoI的引物F和R對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-MAVS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接pMD18-T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-MAVS220，將其雙酶切后亞克隆至原核表達(dá)載體pET-32 a(+)，PCR鑒定和酶切鑒定后菌液送測(cè)。

1.4 重組蛋白的表達(dá)及純化 將pET-MAVS220轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至菌液光密度值(OD600)達(dá)0.6，加入IPTG至終濃度分別為0.05 mmol/L和0.50 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)6 h。取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以確定目的蛋白原核表達(dá)的最佳條件。超聲波破碎法裂解菌體，離心后分別收集上清與菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，鑒定重組蛋白的表達(dá)形式。然后用Ni-NTA親和層析柱純化可溶性蛋白。

1.5 豬MAVS多克隆抗體制備 純化蛋白透析后與弗氏佐劑混合乳化免疫4周齡昆明系小鼠，采用第1、7、21、35天背部皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫，每只小鼠蛋白免疫量約500 μg。三免后第7天隨機(jī)選一只小鼠收集少量血清，Western-Blot檢測(cè)多克隆抗體與重組蛋白的反應(yīng)性，鑒定小鼠是否產(chǎn)生特異性抗體。四免后第7天采血，收集血清。

1.6 多克隆抗體與豬MAVS特異性鑒定 培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞至融合狀態(tài)時(shí)參照脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MAVS真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-Blot。培養(yǎng)PK-15細(xì)胞至融合狀態(tài)時(shí)加入50 μg Poly(I∶C)刺激細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-Blot。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體pET-MAVS220構(gòu)建 利用引物F和R，對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T-MAVS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建獲得pMD18-T-MAVS220重組質(zhì)粒，將其雙酶切后連接pET-32 a(+)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10，PCR鑒定結(jié)果為陽性(圖1A)，質(zhì)粒雙酶切也得到預(yù)期目的條帶(圖1B)，測(cè)序結(jié)果正確。

圖1 豬MAVS原核表達(dá)載體的鑒定

2.2 重組菌誘導(dǎo)及其表達(dá)形式的鑒定 取未誘導(dǎo)及誘導(dǎo)的重組菌菌液各1 mL離心，菌體處理后用于SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，重組載體表達(dá)出約43 kD的融合蛋白，且IPTG終濃度為0.05 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)效果較好(圖2)。誘導(dǎo)的重組菌超聲波破碎后分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，37 ℃、IPTG 0.05 mmol/L時(shí)，獲得的重組蛋白以可溶性蛋白和包涵體兩種形式表達(dá)，且可溶性蛋白稍多于包涵體，而IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)重組蛋白僅以包涵體形式表達(dá)(圖2)。

2.3 重組蛋白的純化與鑒定 將Ni-NTA親和層析純化過程中收集的上清、穿透液、2次洗滌液、5次蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，目的蛋白與Ni-NTA親和層析柱結(jié)合良好；含70 mmol/L咪唑的wash buffer可洗滌部分雜蛋白，達(dá)到洗滌目的；含250 mmol/L咪唑的Elution Buffer可以洗脫全部目的蛋白(圖3A)。Western-Blot鑒定透析后洗脫蛋白的His標(biāo)簽(圖3B)，說明成功獲得MAVS重組蛋白。

圖2 SDS-PAGE分析重組菌pET-MAVS220表達(dá)的MAVS

圖3 純化MAVS重組蛋白的SDS-PAGE分析

A：純化MAVS重組蛋白的SDS-PAGE分析 B：Western-Blot鑒定純化的MAVS重組蛋白 M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：重組菌裂解后上清中的MAVS蛋白；2：穿透液； 3、4：70 mmol/L咪唑洗滌液； 5-9：250 mmol/L咪唑洗脫液回收的MAVS蛋白； 10：純化后的MAVS重組蛋白

2.4 豬MAVS多克隆抗體與重組蛋白的反應(yīng)性 將小鼠三免血清按不同比例稀釋與MAVS重組蛋白反應(yīng)進(jìn)行Western-Blot，結(jié)果表明，MAVS多克隆抗體與MAVS重組蛋白的反應(yīng)性很好，可達(dá)1∶16 000稀釋(圖4)。

2.5 多克隆抗體與真核細(xì)胞表達(dá)蛋白MAVS的特異性 收集轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-MAVS真核表達(dá)載體的BHK-21細(xì)胞蛋白和Poly(I∶C)處理的PK-15細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western-Blot，成功檢測(cè)到BHK-21細(xì)胞表達(dá)的MAVS蛋白(圖5A)和PK-15細(xì)胞表達(dá)的MAVS蛋白(圖5B)，多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶1 000，表明制備的抗豬MAVS多克隆抗體特異性良好。

圖4 Western-Blot檢測(cè)MAVS多克隆抗體與MAVS重組蛋白的反應(yīng)性

圖5 Western-Blot檢測(cè)MAVS多克隆抗體與真核細(xì)胞表達(dá)MAVS蛋白的特異性

3 討論

豬MAVS基因ORF編碼一個(gè)由524個(gè)氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白，其N端含有一個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域。RIG-Ⅰ和MDA5識(shí)別入侵病毒的RNA后，通過CARD結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白MAVS直接相互作用，將信號(hào)傳遞到下游。由此可見MAVS在RLR信號(hào)。通路中的作用至關(guān)重要。本研究對(duì)豬MAVS基因編碼蛋白的抗原指數(shù)和親水性以及線性表位等指標(biāo)進(jìn)行了分析，同時(shí)考慮到原核表達(dá)系統(tǒng)中長(zhǎng)片段外源基因的插入可能導(dǎo)致目的蛋白不表達(dá)或表達(dá)量低，故選取豬MAVS基因序列1 018～1 677共660 bp作為目的基因。片段與表達(dá)載體上的6×His-tag融合，表達(dá)出一個(gè)約43 kD的硫氧還原融合蛋白，從而提高可溶性蛋白的產(chǎn)量，同時(shí)利于Ni-NTA親和層析純化蛋白。

豬MAVS與人MAVS的氨基酸同源性很低，只有48.8%，而生物市場(chǎng)上又缺乏商品化的抗豬MAVS抗體。本研究成功對(duì)豬MAVS基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，并制備出具有較高特異性的小鼠抗豬MAVS多克隆抗體，該抗體與大腸桿菌表達(dá)的重組MAVS蛋白反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1∶16 000，與真核細(xì)胞PK-15和BHK-21表達(dá)的MAVS蛋白反應(yīng)效價(jià)可達(dá)1∶1 000，為進(jìn)一步研究豬MAVS與豬病毒性疾病之間的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Antigenic specificity ofswine MAVS by prokaryotic expression and its preparation of polyclonal antibody

ZHAO Qian-nan1,2，YING Xue1,2，LI Xiao-quan1,2，ZHANG Ke1,2，LI Xiao-ning1,2，LIANG Jing-jing1,2，LUO Ting-rong2

(1.Laboratory of Animal Infectious Diseases， College of Animal Science and Technology, Guangxi University，Nanning 530004， China； 2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Guangxi University， Nanning 530004， China)

The MAVS gene was amplified from PK-15 cells by RT-PCR and was then subcloned into the prokaryotic expression vector to construct pET-MAVS220.The pET-MAVS220 was transfected into anE.coliRosetta(DE3) to express the recombinant MAVS via IPTG induction.The recombinant MAVS was purified and used to immunize the four-week Kunming mice to prepare anti-MAVS polyclonal antibody.The constructed recombinant vector pET-MAVS220 was transformed intoE.coliRosetta(DE3) cells and the MAVS was expressed by induction of 0.05 mM IPTG at 37 ℃ for 6 h.The recombinant MAVS was identified in two forms of soluble protein and/or inclusion body.The purified MAVS was used to immunize the four-week Kunming mice to prepare a polyclonal antibody.The reactivity of the anti-MAVS polyclonal antibody with prokaryotic expressed MAVS was identified to reach a high dilution of 1：16000，and reach a dilution of 1:1000 with MAVS expressed in eukaryotic PK-15 cells by poly(I:C) and in BHK-21 cells transfected with the eukaryotic vector pcDNA3.0-MAVS.The anti-swine MAVS polyclonal antibody showed a high reactivity and specificity.

Swine MAVS; Prokaryotic expression; Polyclonal antibody

LUO Ting-rong

2015-10-21

廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2012GXNSFDA053009)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460653)

趙倩楠(1989-)，女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病防治與分子病毒學(xué)，E-mail：524656052@qq.com

羅廷榮，E-mail：129478375@qq.com

S858.28

A

0529-6005(2017)04-0039-03