棘腹蛙I型干擾素基因的克隆與原核表達

向 勤，羅 潔，吳金芋 ，肖朝新，李 顏，樊汶樵，楊 帆

(重慶文理學院林學與生命科學學院重慶珍稀瀕危水產資源保護與開發(fā)研究中心，重慶永川402168)

棘腹蛙I型干擾素基因的克隆與原核表達

向 勤，羅 潔，吳金芋 ，肖朝新，李 顏，樊汶樵，楊 帆

(重慶文理學院林學與生命科學學院重慶珍稀瀕危水產資源保護與開發(fā)研究中心，重慶永川402168)

干擾素(IFN)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能，具備較好的臨床應用前景。為了解棘腹蛙干擾素的基因信息，本試驗明確了棘腹蛙I型IFN基因ORF編碼長度為561 bp，編碼的蛋白質含有1個信號肽和103aa的保守功能結構域。遺傳進化分析顯示，棘腹蛙I型IFN進化相對保守；其蛋白質結構主要由α螺旋構成，細胞表面受體結合能力相對保守。將目的片段裝入原核表達載體pET32a并轉化BL21(DE3)進行蛋白表達與純化，獲得了預期蛋白。本研究證實了棘腹蛙I型IFN屬于相對保守的典型I型干擾素；為后期深入挖掘棘腹蛙IFN的生物學功能、促進廣譜抗病毒生物制劑研發(fā)提供了參考。

棘腹蛙 ； 干擾素 ； 克隆，序列分析，表達

干擾素(IFN)具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能，在機體免疫應答的過程中具有重要意義，也是首個成功應用于臨床治療的基因工程產品[1-2]。根據其抗原活性的差異，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型；其中，Ⅰ型干擾素為先天免疫細胞分泌的IFN-α、IFN-β和IFN-ω，能夠識別位于同一類細胞膜的受體[3]；Ⅱ型干擾素僅有IFN-γ，可輔助T細胞釋放白細胞介素，若表達異常會導致自身免疫性疾病[4]；Ⅲ型干擾素信號轉導機制與Ⅰ型干擾素類似，但能夠調節(jié)NK細胞發(fā)揮最佳活性[5-6]。

棘腹蛙(Paaboulengeri)，隸屬于兩棲綱無尾目蛙科棘蛙屬，是我國特有的分布于西南地區(qū)的土著大型蛙類。本課題組前期對棘腹蛙皮膚轉錄組進行序列測定，首次獲得了其Ⅰ型干擾素的注釋信息；通過對棘腹蛙Ⅰ型干擾素基因(IFN-Pb)進行驗證、分析和原核表達，為進一步研究其生物學功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和耗材 2歲齡健康棘腹蛙，飼養(yǎng)于本實驗室兩棲動物流水養(yǎng)殖系統(tǒng)。TRIZol、DEPC，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；cDNA合成試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒，購自Promega公司；凝膠回收試劑盒，購自OMEGA公司；Trans2K DNA Marker、EcoRI和XhoI，購自TaKaRa公司。pET32a與BL21(DE3)為本實驗室保存，Ni NTA Beads 為常州天地人和有限公司生產(貨號：SA004010)；其余培養(yǎng)基及蛋白表達與純化相關試劑為國產分析純。

1.2 特異引物的設計 IFN-Pb序列來自于本實驗室自測的棘腹蛙皮膚轉錄組數(shù)據，利用Primer 5.0軟件設計基因特異性引物(上游引物序列為：5′-GAGCCCACAGAGCAGAACATCCCTT -3′；下游引物序列為：5′-CAGGCTCCTTCATCGCGTCCAATCA -3′)。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 序列驗證 小心摘取棘腹蛙皮膚組織，立即放入液氮中。隨后按試劑盒說明書抽提總RNA，并利用cDNA合成試劑盒說明書完成cDNA的制備。利用DNATaq酶進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用凝膠回收試劑盒進行回收。陽性產物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 生物信息學分析 使用SMART，SignalP 3.0，BoxShade Server軟件分別進行功能結構域、信號肽、同源比對。在GenBank數(shù)據庫中檢索IFN同源序列，利用ClustalX 1.83進行多重序列比對，隨后利用MEGA 5.0軟件對IFN家族基因進行鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹，取1 000次重復檢驗以估算各分枝的置信值。

1.5 重組表達蛋白的分離及純化 將1.3中驗證后的重組質粒進行亞克隆，引物分別加上EcoRI和XhoI限制性內切酶位點后獲得去除信號肽的ORF序列(上下游引物序列分別為：5′-CCGGAATTCCAAACTTGCAAATGGCTCCACCGAA-3′和5′-GGCGAGCTCTTAGTCATGTGACTTCTGTTTTCTC-3′)，酶切后裝入大腸桿菌表達載體pET32a。

陽性重組表達載體pET32a-IFN-Pb轉入大腸桿菌表達感受態(tài)細胞BL21(DE3)。經抗性篩選出轉化成功的菌株，在37 ℃下用終濃度為0.5mmol/L IPTG進行誘導表達，經SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況。收集表達后的菌體進行超聲破碎，檢測蛋白的表達形式，最后根據蛋白的表達形式選擇相應的方法通過鎳柱親和層析純化目的蛋白。

2 結果

2.1IFN-Pb基因的擴增 以棘腹蛙皮膚組織的cDNA為模板，利用RT-PCR方法擴增出了長約650 bp的目的片段(圖1)。測序結果如圖2顯示，IFN-Pb全長序列包含一個ORF為561 bp，共編碼186個氨基酸，其中，酸性氨基酸為48個，遠遠大于堿性氨基酸的數(shù)目(27個)，暗示該蛋白可能受到選擇壓力影響。

圖1 IFN-Pb基因擴增結果

M：Marker； IFN：陽性樣品； C：陰性對照

圖2 IFN-Pb的基因編碼序列及氨基酸序列

2.2IFN-Pb基因的序列相似性分析 對IFN-Pb同源序列構建遺傳進化樹，結果顯示(圖3)IFN-Pb與爪蟾單獨聚為一枝，與硬骨魚較為近緣，而與偶蹄類、食肉類、食蟲類、嚙齒類和靈長類動物親緣關系較遠。其中，與已發(fā)布的爪蟾的I型干擾素氨基酸序列同源性為65%，置信值為43%，親緣關系最近，進一步說明棘腹蛙IFN-Pb的遺傳進化相對穩(wěn)定而保守。

將帶有重組質粒pET32a-IFN-Pb的BL21(DE3)在37 ℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L時以可溶蛋白和包涵體形式均可表達(圖4A)。而后經過Ni NTA Beads親合層析柱進行目的蛋白的純化。結果顯示(圖4B)，在濃度為20 mmol/L、60 mmol/L和300 mmol/L咪系統(tǒng)進化樹構建所用的物種及GenBank登錄號：鼩鼱，XP_012787224.1；東北虎，ALJ03295.1；獵豹，XP_014923397.1；地松鼠，XP_005335983.1；維德爾海豹，XP_006745530.1；太平洋海象，XP_004405712.1；雪貂，XP_004761833.1；刺猬，XP_007533180.1；小耳大嬰猴，XP_003782904.1；克氏冕狐猴，XP_012520479.1；川金絲猴，XP_010371759.1；眼鏡猴，XP_008069815.1；馬，XP_005605088.1；驢，XP_014686764.1；家犬，AEI30864.1；南非爪蟾，AHN05532.1；熱帶爪蟾，CAO03087.1；虹鱒魚，ACJ03565.1；大西洋鮭, XP_014059915.1；嚙齒目動物包括：XP_001053250.1, XP_003750022.1, CAA25091.1, XP_578466.2, XP_008756430.1, XP 578467.1, XP_003750023.1. 分枝上的數(shù)字代表置信值唑均可將IFN-Pb重組蛋白洗脫出來，其中最佳咪唑洗脫濃度為300 mmol/L。

圖3 棘腹蛙IFN同源序列的系統(tǒng)進化分析

3 結論

動物領域的新型干擾素研究起步相對較晚，開展兩棲類動物干擾素研究對于動物傳染病防控和臨床醫(yī)學研究都有一定的促進作用。前期對棘腹蛙的遺傳特性研究發(fā)現(xiàn)，棘腹蛙種群屬于一個單系分支[7-8]，在進化過程中相對獨立[9-10]；其機體免疫系統(tǒng)針對傳染性疾病的應答機制并無報道。本試驗以棘腹蛙的cDNA為模板，獲得了IFN-Pb的全基因序列，其氨基酸序列以酸性氨基酸占主導地位，可能嚴格遵循自然選擇規(guī)則。與已知兩棲類動物進行多重序列比對結果顯示，與已知兩棲模式動物相比，該基因在N端存在較多的氨基酸位點突變，C端則明顯簡縮，但該蛋白含有1個信號肽和103aa的保守功能結構域，暗示該基因的功能相對保守。遺傳進化分析進一步說明，棘腹蛙IFN-Pb與爪蟾單獨聚為一枝，與硬骨魚相對近緣，進化地位相對保守。而蛋白質結構預測顯示，IFN-Pb與人的干擾素α相似度為31%，主要由α螺旋構成，說明該蛋白盡管與人的同源蛋白存在較大分化；但是，其細胞表面受體結合能力相對保守。

原核表達結果顯示，IFN-Pb在大腸桿菌中使用pET32a作為載體進行原核表達時，目的蛋白可以以包涵體沉淀和可溶上清兩種形式，可溶上清使用Ni-NTA beads進行純化，目的蛋白在300 mmol/L咪唑下洗脫得到了高純度的蛋白，這為進一步對IFN的生物活性研究提供了扎實的基礎。

圖4 棘腹蛙IFN重組蛋白質表達及純化的SDS-PAGE分析

注：箭頭所示為IFN原核表達重組蛋白

綜上所述，棘腹蛙IFN-Pb的結構和功能相對保守，僅N-和C-端序列存在一定分化，原核表達可獲得預期蛋白。深入挖掘棘腹蛙的干擾素的生物學功能，將對我們了解該類細胞因子是如何介導的高等動物的免疫系統(tǒng)調節(jié)，以及生產廣譜抗病毒生物制劑奠定前期基礎。

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Clone and expression of typeⅠinterferon fromPaaboulengeri

XIANG Qin, LUO Jie, WU Jin-yu,XIAO Chao-xin,LI Yan,FAN Wen-qiao,YANG Fan

(College of Forestry & Life Science Chongqing University of Art & Science Chongqing Chongqing Research Centers of Conservation and Development on Rare & Endangered Aquatic Resources, Chongqing 402168, China)

Interferons have the functions of anti-virus, anti-tumor and immune regulation. For better understanding of the interferon encoding genes, we have studied the full length sequence of typeⅠinterferon fromPaaboulengeriby RT-PCR. The results showed that,IFN-Pb, was 649bp long, encoding 186 aa protein and containing a signal peptide and a conserved interferon functional domain, especially consisting of an alpha helix composition and a cell surface receptor binding domain. Besides, phylogenic analysis illustrated that it had a closer relationship withXenopus, and was clustered into aquatic branches. TheIFN-Pbwas inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+) by restriction enzyme digestion and then the plasmids was transformed inE.coliBL21(DE3). The protein was induced with IPTG and the fusion protein was purified successfully with Ni-sepahrose.

Paaboulengeri; Interferon ; Cloning ; Sequence analysis ; Expression

YANG Fan

2016-08-10

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510642064)；重慶市科技計劃重點專項(cstc2015jcyjBX0013)；重慶市科技計劃項目 (cstc2014jcyjA80042)；重慶文理學院人才引進項目(R2013LS13, R2014LX07)

向勤(1993-)，女，本科生，就讀于生物科學專業(yè)，E-mail: 846857730@qq.com

楊帆，E-mail: yfan4103@163.com

S947

A

0529-6005(2017)04-0023-04