玉米ZmWRKY41基因克隆及轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證

李國君，趙娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

玉米ZmWRKY41基因克隆及轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證

李國君，趙娟*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]干旱是影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量的重要因素。植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子超家族在植物的生長發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。因此，克隆分析玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子的序列特征和功能，為研究玉米耐逆分子育種提供重要抗逆基因資源。[方法]本研究以玉米自交系B73為材料提取玉米總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，克隆、分離獲得ZmWRKY41基因編碼區(qū)全長序列。DNAMAN比對發(fā)現(xiàn)，ZmWRKY41蛋白具有保守結(jié)構(gòu)域WRKYGQK和鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc-finger motif)C2HC，屬于第三類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族。利用生物信息學(xué)方法研究該基因蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析預(yù)測。利用PlantCARE在線工具預(yù)測、鑒定ZmWRKY41基因啟動(dòng)子區(qū)是否含有響應(yīng)非生物脅迫的順式作用元件。將ZmWRKY41基因編碼區(qū)全長序列構(gòu)建pGBKT7誘餌載體上，與GAL4 DNA 結(jié)合域融合，轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109驗(yàn)證ZmWRKY41轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活活性。[結(jié)果]玉米ZmWRKY41基因編碼區(qū)全長774 bp，含有長度分別為221 bp、126 bp、427 bp 3個(gè)外顯子，共編碼257個(gè)氨基酸序列。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ZmWRKY41蛋白包含2個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)和5個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)，不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。ZmWRKY41基因啟動(dòng)子元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子中含有干旱脅迫(CGGTCA)、熱脅迫(AAAAAATTTC)、低溫脅迫(CCGAAA)等非生物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。酵母轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，將含有pGBKT7-ZmWRKY41融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，能在單缺、三缺培養(yǎng)基正常生長且能使α-半乳糖苷酶底物分解顯藍(lán)色，表明ZmWRKY41基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性。[結(jié)論]玉米ZmWRKY41基因是WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員之一，在酵母體內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可能參與響應(yīng)非生物逆境脅迫，為進(jìn)一步研究該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非生物逆境脅迫奠定基礎(chǔ)。

玉米； WRKY轉(zhuǎn)錄因子； 非生物脅迫； 酵母； 轉(zhuǎn)錄激活

植物在生長發(fā)育過程中會受到多種因素的影響，而干旱、高鹽等非生物逆境脅迫是影響植物代謝調(diào)控的主要因素。當(dāng)受到非生物脅迫時(shí)植物會啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)一套調(diào)控代謝機(jī)制，從而在一定程度上發(fā)生生理變化，而這些生理的變化很大程度上是由分子水平的調(diào)控完成的[1]。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄因子通常結(jié)合到目標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄從而對靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[2]，以響應(yīng)干旱、高溫、低溫、高鹽等各種非生物脅迫。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是廣泛存在于植物中一個(gè)超級基因家族，它是植物體信號網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，調(diào)控植物生理生化進(jìn)程[3]。在1994年，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子被首次報(bào)道[4]，Rushton等于1996年在香芹中發(fā)現(xiàn)了WRKY1、WRKY2 和WRKY3，并將它們統(tǒng)一命名為 WRKY。最初確定WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的功能是調(diào)控植物對病原菌的反應(yīng)，同時(shí)也是該轉(zhuǎn)錄因子的一大主要功能[5]。最近研究表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物逆境脅迫中也同樣發(fā)揮著重要功能。小麥TaWRKY10基因在干旱、低溫、鹽及H2O2四種脅迫處理下具有正向調(diào)控作用，因此使轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性提高[6]。玉米ZmWRKY33基因在根中特異表達(dá)，其在擬南芥中過表達(dá)增強(qiáng)了對鹽脅迫的耐受性[7]；從茶樹分離的CsWRKY2基因響應(yīng)寒冷和干旱脅迫[8]。從棉花克隆的GhWRKY基因遭受干旱、鹽、ABA脅迫時(shí)，在根、莖、葉中上調(diào)表達(dá)，說明GhWRKY基因參與響應(yīng)非生物脅迫[9]。Wu等通過轉(zhuǎn)錄組分析得出野茶樹CsWRKY基因受極端溫度的誘導(dǎo)[10]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子蛋白在結(jié)構(gòu)上有一個(gè)顯著的特點(diǎn)，在N末端都是由一個(gè)或兩個(gè)具有大約60個(gè)氨基酸殘基所組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域N端又包含一個(gè)由7個(gè)氨基酸組成的保守序WRKYGQK[11]，是其核心結(jié)構(gòu)域，C端存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。根據(jù)所含WRKY 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)域的不同，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分成三種類型：第一類是具有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為Cys2His2型；第二類是具有1個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為Cys2His2型，大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子都是屬于這種類型；第三類WRKY轉(zhuǎn)錄因子同樣只有1個(gè)WRKY 結(jié)構(gòu)域，但是鋅指結(jié)構(gòu)有所不同，是Cys2HisCys型。雖然在WRKY結(jié)構(gòu)域中WRKYGQK序列高度保守，但是在擬南芥[12]、水稻[13]、葡萄[14]、番茄[15]中也被發(fā)現(xiàn)存在變異，比如WRKYGMK、WRKYGEK、WSKYGQK、WQKYGQK等。這種差異大概是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化的過程中為適應(yīng)相應(yīng)環(huán)境條件而發(fā)生變異的結(jié)果[16]。另外，WRKY基因DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域WRKYGQK能特異性地與靶基因啟動(dòng)子中的W-box順式作用元件(T)(T)TGAC(C/T)結(jié)合，以調(diào)控目的基因[17]。

玉米作為全球主要禾谷類作物之一，在全球糧食和能源領(lǐng)域具有舉足輕重的地位。而非生物脅迫是影響玉米產(chǎn)量的主要因素[18]。作為響應(yīng)逆境脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控下游基因表達(dá)，從而改變整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使代謝路徑發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)植物抵抗非生物脅迫的作用。本研究通過對玉米ZmWRKY41進(jìn)行基因克隆，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測該轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)，分析ZmWRKY41基因啟動(dòng)子區(qū)包含的非生物逆境脅迫順式作用元件，并驗(yàn)證ZmWRKY41轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性，為玉米耐非生物逆境脅迫分子育種提供優(yōu)異抗逆基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

玉米自交系B73，所屬類群是Reid，源于BSSSC5。種子源于同一果穗，將其進(jìn)行沙培培養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure(天根生化科技有限公司)、cDNA第一鏈合成試劑盒 FastQuant RT Kit (with gDNase)(天根生化科技有限公司)。高保真DNA聚合酶KOD FX(TOYOBO)、核酸凝膠回收試劑盒Zymoclean(美國ZYMO RESEARCH公司)、同源重組試劑盒Seamless Assembly Cloning Kit(CloneSmarter)、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ(NEB公司)、質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司)、硫酸卡那霉素、Yeast Transformation System2試劑盒(TakaRa)、引物及引物接頭序列合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。名稱及序列見表1。

表1 引物序列及用途

1.1.3 菌株及載體

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)，酵母菌株AH109(實(shí)驗(yàn)室保存)，克隆載體pEASY-Blunt Clonging Kit (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，誘餌載體pGBKT7(實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 方法

選取以沙培的三葉一心期玉米幼苗，將幼苗在冰上用液氮提前預(yù)冷的剪刀將葉片分離，用于RNA的提取。提取方法見植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure(天根生化)說明書。將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，方法參見FastQuant RT Kit (with gDNase)提供的說明書。

1.2.1 玉米ZmWRKY41基因克隆

通過PlantTFDB搜索玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，獲取以玉米B73為參考的GRMZM2G063880編碼區(qū)序列，以CDS區(qū)兩端堿基序列設(shè)計(jì)引物WRKY41-F/R，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，連接到克隆載體pEASY-Blunt上，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取單克隆，菌液PCR檢測后測序，用DNAMAN軟件將測序得到的結(jié)果與參考序列進(jìn)行序列比對，檢驗(yàn)克隆序列正確性。

1.2.2 玉米ZmWRKY41的生物信息學(xué)分析

將克隆得到的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列與WRKY蛋白(XP_008656051.1)序列完全一致，且與擬南芥AtWRKY41具有高度同源性，因此將該基因命名為ZmWRKY41。通過在GenBank中查找相關(guān)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道過的關(guān)于擬南芥、短柄草、蕪菁、棉花、大豆、大麥、核桃、水稻、小麥9個(gè)物種相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列。應(yīng)用DNAMAN軟件將ZmWRKY41與以上9個(gè)物種的氨基酸序列進(jìn)行對比，分析氨基酸序列相似性，以驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子是否屬于WRKY家族，并運(yùn)用MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建ZmWRKY41與其它9個(gè)物種的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，預(yù)測其與響應(yīng)非生物脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子之間的進(jìn)化關(guān)系。

用ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析ZmWRKY41的蛋白分子量與等電點(diǎn)。使用(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分析蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)；利用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/)作跨膜預(yù)測。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽；磷酸化位點(diǎn)分析使用NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)?；虮Ｊ匦怨δ苡蝾A(yù)測使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)。啟動(dòng)子區(qū)域抗逆結(jié)合元件的分析應(yīng)用分析工具PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，從NCBI中查找相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)序列導(dǎo)入PlantCARE中，統(tǒng)計(jì)并分析非生物脅迫相關(guān)順式作用元件。

1.2.3 重組載體構(gòu)建

將EcoRⅠ、SalⅠ作為酵母誘餌載體pGBKT7的實(shí)驗(yàn)酶切位點(diǎn)，用相應(yīng)的內(nèi)切酶在適宜的溫度下進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，時(shí)間3～4 h，之后在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，并將切開的線性載體回收純化，保存于-20 ℃。

以玉米自交系B73的cDNA為模版，加接頭的特異引物WADD-F/R在DNA高保真聚合酶KOD-FX作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并將其回收純化，保存于-20 ℃。

利用同源重組的原理，通過2X Seamless Master Mix酶將切開的線性載體與目的基因產(chǎn)物連接，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含有卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基上挑取陽性單克隆，菌液PCR檢測后測序，用DNAMAN軟件將所測得的結(jié)果與參考序列進(jìn)行序列比對，選取正確核苷酸序列的單克隆菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，并保存于-20 ℃。

1.2.4 玉米ZmWRKY41的轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證

使用帶有酶切位點(diǎn)EcoRⅠ、SalⅠ的加接頭特異性引物WADD-F/R擴(kuò)增ZmWRKY41的編碼區(qū)，并與載體pGBKT7的GAL4 DNA結(jié)合域融合，即酵母表達(dá)載體pGBKT7-ZmWRKY41?？蛰d體pGBKT7作為陰性對照，分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109。將酵母的轉(zhuǎn)化菌株以4個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)重復(fù)分別滴在不同缺性固體培養(yǎng)基(SD/-Trp、SD/-Trp, His, Ade、SD/-Trp, His, Ade+x-α-gal)上篩選，并將其放置于30 ℃下2～3 d培養(yǎng)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 玉米ZmWRKY41基因克隆及其生物信息學(xué)分析

2.1.1 玉米ZmWRKY41的基因克隆

以WRKY41-F/R作為引物、cDNA為模版，在DNA聚合酶KOD-FX作用下克隆基因ZmWRKY41編碼區(qū)。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。將得到的PCR產(chǎn)物純化后與pEASY-Blunt載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在LB (kan)抗性的培養(yǎng)基上挑取陽性單克隆測序，得到該片段長度為774 bp。

M：DNA marker (D2000)；I：PCR 產(chǎn)物圖1 ZmWRKY41編碼區(qū)序列PCR 擴(kuò)增檢測Fig.1 PCR product of ZmWRKY41 coding region

2.1.2 玉米ZmWRKY41的生物信息學(xué)分析

利用克隆得到的核苷酸序列獲取相應(yīng)的氨基酸序列，將其與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過的其它9個(gè)物種擬南芥、短柄草、蕪菁、棉花、大豆、大麥、核桃、水稻、小麥共12個(gè)WRKY 蛋白序列進(jìn)行同源性對比分析，由圖2A發(fā)現(xiàn)該基因WRKY保守域具有與其它9個(gè)物種完全相同的WRKYGQK序列，但是其鋅指結(jié)構(gòu)域與擬南芥AtWRKY41、棉花GhWRKY41、大豆GmWRKY41、大麥HvWRKY28相同，屬于第三類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，即C2HC型家族特征。利用MEGA6.0對以上氨基酸序列作系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示(圖2B)：ZmWRKY41與擬南芥AtWRKY41、棉花GhWRKY41、大豆GmWRKY41、大麥HvWRKY28同源關(guān)系較近，且都屬于第三類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，即鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型。其中棉花GhWRKY41轉(zhuǎn)錄因子對高鹽、干旱脅迫起正向調(diào)控作用[19]。

2.1.3 玉米ZmWRKY41蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST確認(rèn)該基因ZmWRKY41后，由GenBank分析得出：該基因包括3段外顯子，核苷酸序列長度分別為221 bp、126 bp、427 bp?；蚩寺〖皽y序分析顯示：該基因CDS區(qū)共編碼257個(gè)氨基酸序列。生物信息學(xué)分析可知：該基因編碼的蛋白分子量為27 683.05 Da，等電點(diǎn)6.19，負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp + Glu) 30個(gè)，正電荷殘基數(shù)(Arg + Lys)26個(gè)。不穩(wěn)定系數(shù)是43.36，是一種不穩(wěn)定蛋白。該蛋白高級結(jié)構(gòu)含有2個(gè)α-螺旋，5個(gè)β-折疊(圖3)。預(yù)測發(fā)現(xiàn)ZmWRKY41 沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。對ZmWRKY41進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示(圖4),ZmWRKY41含有14 個(gè)絲氨酸(Serine), 6個(gè)蘇氨酸(Threonine)和 3個(gè)酪氨酸(Tyrosine)。蛋白質(zhì)磷酸化屬于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一部分，它能調(diào)節(jié)、控制蛋白質(zhì)活力與功能。在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用。而蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在這3種氨基酸上，酪氨酸磷酸化則是參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要氨基酸。因此，這些磷酸化位點(diǎn)的作用可能與ZmWRKY41蛋白的活性調(diào)控有關(guān)。

圖2 不同物種WRKY氨基酸保守域?qū)Ρ确治鯢ig.2 The alignment of conserved domains from WRKY amino acids in different species 注：利用DNAMAN將玉米ZmWRKY41蛋白序列(XP_008656051.1)與其它9個(gè)物種共12個(gè)WRKY蛋白序列對比，擬南芥AtWRKY28(NP_193551.1)；擬南芥AtWRKY41(NP_192845.1)；短柄草 BdWRKY3(XP_003576063.1)；蕪菁BrWRKY28(NP_001288987.1)；棉花GhWRKY31(XP_016723495.1)；棉花GhWRKY41(XP_016693189.1)；大豆GmWRKY41(XP_003530379.1)；大豆GmWRKY71(XP_003545146.1)；大麥HvWRKY28(ABI13394.1)；核桃JrWRKY3(XP_018813985.1)；水稻OsWRKY28(DAA05093.1)；小麥TaWRKY28(ACD69418.1)。Note:Alignment of motif to ZmWRKY41 from maize and other 12 of WRKY included in nine species by DNAMAN, Arabidopsis thaliana AtWRKY28 (NP_193551.1); Arabidopsis thaliana AtWRKY41 (NP_192845.1); Brachypodium distachyon BdWRKY3 (XP_003576063.1); Brassica rapa BrWRKY28 (NP_001288987.1); Gossypium hirsutum GhWRKY31 (XP_016723495.1); Gossypium hirsutum GhWRKY41 (XP_016693189.1); Glycine max GmWRKY41 (XP_003530379.1); Glycine max GmWRKY71 (XP_003545146.1); Hordeum vulgare HvWRKY28 (ABI13394.1); Juglans regia JrWRKY3 (XP_018813985.1); Oryza sativa Japonica Group OsWRKY28 (DAA05093.1); Triticum aestivum TaWRKY28 (ACD69418.1).

對該基因保守性功能域進(jìn)行預(yù)測顯示(圖5), 在95～157 氨基酸位置有一個(gè)WRKY的功能結(jié)構(gòu)域, 保守的氨基酸序列是WRKYGQK在N端，并且還存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，它特異的結(jié)合到DNA序列(T)(T)TGAC(C/T)，即所謂的W-box，它是WRKY蛋白特異的DNA結(jié)合區(qū)，該區(qū)域保守元件TGAC是WRKY功能行使的核心序列[12]。

2.1.4 玉米ZmWRKY41基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測

為研究ZmWRKY41基因表達(dá)及調(diào)控機(jī)制，使用PlantCARE分析該基因ATG前上游1 100 bp 序列的非生物脅迫相關(guān)順式作用元件。其中包含熱激響應(yīng)元件(HSE)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)，MYB是典型的耐旱脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子。此外還有防御和逆境響應(yīng)元件(TC-rich repeats)共4種非生物脅迫相關(guān)順式作用元件(表2)。其中，HSE、LTR、MBS在非生物逆境脅迫下發(fā)揮著重要作用，逆境脅迫下，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)的這些元件結(jié)合后，植物體內(nèi)會啟動(dòng)一系列的代謝調(diào)控機(jī)制，以維持其正常生長。

圖3 ZmWRKY41蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of Advanced Structure of ZmWRKY41 Protein

圖4 ZmWRKY41磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.4 Prediction of Phosphorylation Site of ZmWRKY41

圖5 ZmWRKY41蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 The analysis of conserved domain for ZmWRKY41 protein

2.2 酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7的構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ對載體pGBKT7進(jìn)行雙酶切，使之成為線性化載體，并擴(kuò)增帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物ZmWRKY41，應(yīng)用同源重組酶將兩者做連接反應(yīng)(圖6A)。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGBKT7-ZmWRKY41轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并在相應(yīng)抗性LB培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性單克隆篩選，將篩選的單克隆做菌液擴(kuò)繁以提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行目的基因ZmWRKY41的PCR擴(kuò)增檢測，結(jié)果如圖6B所示。初步證明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。再將其測序分析，與NCBI中提供的玉米B73參考序列做對比分析，將具有正確核苷酸序列的質(zhì)粒保存于-20 ℃，用于后續(xù)的酵母轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表2 ZmWRKY41基因啟動(dòng)子區(qū)非生物脅迫相關(guān)順式作用元件

圖6 pGBKT7-ZmWRKY41重組載體構(gòu)建Fig.6 The construction of pGBKT7-ZmWRKY41 recombinant vector

2.3 玉米ZmWRKY41基因的轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證

為驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性，將ZmWRKY41基因的編碼區(qū)融合到誘餌載體pGBKT7的GAL4 DNA結(jié)合域(圖7A)，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGBKT7-ZmWRKY41，加之對照組pGBKT7兩者分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，在相應(yīng)缺陷型培養(yǎng)基檢驗(yàn)ZmWRKY41的轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果如圖7B所示，pGBKT7-ZmWRKY41轉(zhuǎn)化體能夠在SD/-Trp、SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上能夠正常生長，且在SD/-Trp-His-Ade含x-α-gal培養(yǎng)基上顯藍(lán)色。而對照組轉(zhuǎn)化體pGBKT7在SD/-Trp培養(yǎng)基上能夠正常生長，在SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上不能生長，且不顯藍(lán)色。結(jié)果證明，ZmWRKY41基因能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，在酵母體內(nèi)具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖7 ZmWRKY41基因轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證分析Fig.7 The transactivation activity assay of ZmWRKY41

3 討論與結(jié)論

近年來，轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。與功能基因相比，轉(zhuǎn)錄因子主要行使調(diào)控功能，能夠激活或抑制下游多個(gè)功能基因的表達(dá)，從而提升或降低植物的耐逆性。因此，在作物品種改良的研究中已成為研究重點(diǎn)[20]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中一類特有的轉(zhuǎn)錄因子，具有龐大的家族成員。研究表明，WRKY基因是典型的誘導(dǎo)表達(dá)型基因，受多種生物(病原體[21～23]、線蟲[24]、昆蟲[25]等)、非生物脅迫(干旱、低溫、高鹽等)的誘導(dǎo)。此外還受創(chuàng)傷[26]、機(jī)械脅迫[27]、乙烯、ABA、水楊酸、茉莉酸等植物信號分子的誘導(dǎo)。本研究通過生物信息學(xué)的方法分析玉米ZmWRKY41基因啟動(dòng)子區(qū)域，共發(fā)現(xiàn)4種非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，其中包含熱激響應(yīng)元件(HSE)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)重要的逆境相關(guān)順式作用元件，推測這些順式作用元件可能參與了逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制。相關(guān)研究顯示，與耐逆相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子區(qū)都含有響應(yīng)非生物逆境脅迫的順式作用元件。厚葉懸蒴苣苔BcWRKY1啟動(dòng)子中分布著非生物逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)順式作用元件[28]MYB(干旱響應(yīng)元件)、DRE/CRT(干旱響應(yīng)元件)、MYC(ABA和低溫脅迫響應(yīng)元件)；辣椒CaWRKY5啟動(dòng)子序列含有ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、DRE/CRT非生物逆境相關(guān)順式作用元件[29]；大豆WRKY28-like基因啟動(dòng)子區(qū)段中檢測到MBS、HSE、ABRE等元件[30]。谷子SiWRKY36啟動(dòng)子區(qū)檢測到ABRE、MYB、MYC、LTR等逆境相關(guān)順式作用元件[31]。因此，初步推測玉米ZmWRKY41轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)非生物逆境脅迫，可能調(diào)控植株生長的抗逆性。

轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor, TF)又叫反式作用因子, 該蛋白能與真核生物啟動(dòng)子區(qū)特定的DNA序列結(jié)合，以激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。在Paz-Ares于20世紀(jì)80年代末期首次克隆成功玉米轉(zhuǎn)錄因子之后，調(diào)控非生物脅迫、生物脅迫及植物生長發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子都相繼被克隆[32]。這些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)通常由DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活或抑制域、寡聚化位點(diǎn),以及核定位信號等4個(gè)功能區(qū)域組成，這些正是行使轉(zhuǎn)錄因子之間或者與啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件相互作用的核心區(qū)域[33]。水稻OsWRKY71轉(zhuǎn)錄因子在玉米原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，相比較空載體效應(yīng)因子，含OsWRKY71的效應(yīng)因子其報(bào)告因子LUC活性降低，表明OsWRKY71可能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子調(diào)控下游目的基因[34]。水稻OsWRKY4轉(zhuǎn)錄因子融合到pGBKT7載體GAL4 DNA結(jié)合域并轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，含有pBD-WRKY4的菌株能在系統(tǒng)缺陷型三缺培養(yǎng)基SD/-Trp-Ade-His上正常生長，證明OsWRKY4是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子。結(jié)構(gòu)域刪除實(shí)驗(yàn)證明OsWRKY4轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活活性有效區(qū)域是位于N端和C端之間的區(qū)段[35]。擬南芥PtrWRKY73轉(zhuǎn)錄因子在Y2HGold酵母細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄激活活性[36]。本實(shí)驗(yàn)通過對ZmWRKY41轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證，證明其具有轉(zhuǎn)錄激活活性，從而為該基因功能驗(yàn)證及互作蛋白篩選的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究從玉米中分離、克隆到1個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST比對發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥AtWRKY41基因具有高度同源性，因此將該基因命名為ZmWRKY41。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因蛋白序列是由257個(gè)氨基酸組成，包含一個(gè)典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域，屬于第三類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。利用PlantCARE在線網(wǎng)站預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子區(qū)段內(nèi)含有干旱、低溫等非生物逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，推測該基因可能受到多種非生物逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)顯示，ZmWRKY41基因能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，使含有x-α-gal的三缺培養(yǎng)基上顯藍(lán)色，表明該基因在酵母體內(nèi)具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性。

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(編輯：武英耀)

Cloning and transcriptional activation ofZmWRKY41 transcription Factor from maize

Li Guojun, Zhao Juan*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]WRKY transcription factor (TF) superfamilies play an important role in responding to abiotic stresses in plants. By analyzing WRKY TF’s sequence characteristics and functions in maize, provide important gene resource for studying stress tolerance molecular breeding of maize.[Methods]The coding sequence ofZmWRKY41 gene was isolated from cDNA of maize inbred line B73 by PCR method. The physical and chemical properties of the WRKY protein were predicted and analyzed by bioinformatics methods. The identification of abiotic stress cis-acting elements in theZmWRKY41 promoter region was found out by the PlantCARE online tool. The coding DNA sequence (CDS) ofZmWRKY41 gene was fused with GAL4 DNA BD of bait vector pGBKT7, to verify whetherZmWRKY41 TF in yeast strain AH109 exhibited transactivation activity.[Results]As results, the coding DNA sequence ofZmWRKY41 was 774 bp, containing 3 of exons, which were 221 bp, 126 bp and 427 bp respectively, and encoded a polypeptide of 257 amino acid residues. The protein structure prediction found thatZmWRKY41 contained 2 α-helix and 5 β-fold, without transmembrane structure and signal peptide. ZmWRKY41 protein had a conserved domain WRKYGQK and zinc finger structure, C2HC, belonging to the third class WRKY TF family. Its promoter region contained a number of cis-acting elements that regulate and respond to abiotic stresses. Yeast transactivation activity assay suggested thatZmWRKY41 had transactivation activity.[Conclusion]ZmWRKY41 gene may be involved in the response to abiotic stresses and was one of WRKY transcription factor family members with transactivation activity. And it could be acquired significant direction to study the regulation of WRKY TF on abiotic stress.

Maize， WRKY Transcription Factor， Abiotic Stress， Yeast， Transcriptional Activation Assay

2017-03-13

2017-03-29

李國君(1992-)，男(漢)，山西大同人，碩士研究生，研究方向：植物生理與分子生物學(xué)

*通信作者：趙娟，博士，副教授，Tel:13834836658;E-mail:sxndzhaojuan@163.com

山西省青年科技研究基金項(xiàng)目(201601D202054)

S513

A

1671-8151(2017)06-0381-09