microRNA20b調(diào)節(jié)PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

盧 悅，王晶晶，梁廣彬，胡 喆，張良清,

microRNA20b調(diào)節(jié)PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

盧 悅1，王晶晶1，梁廣彬1，胡 喆2，張良清1,2

目的:觀察microRNA20b對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVECs）建立缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVECs隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Normal組）、缺氧后陰性對(duì)照組（HR+NC組）、缺氧后microRNA20b過(guò)表達(dá)組（HR+20b組）、缺氧后陰性對(duì)照抑制組（HR+IN NC組）和缺氧后microRNA20b抑制組（HR+IN 20b組）。缺氧前24 h采用lipofectamine2000將Negative Control、microRNA20b mimics、inhibitor Negative Control、microRNA20b inhibitor分別轉(zhuǎn)染入后四組細(xì)胞，然后缺氧培養(yǎng)12 h后復(fù)氧4 h。采用免疫熒光檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增值物受體γ(PPARγ)蛋白的變化，AnnexinV-FITC/PI流式雙染法檢測(cè)細(xì)胞的早晚期凋亡率，Western blot檢測(cè)PPARγ以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與Normal組相比，缺氧/復(fù)氧損傷后各轉(zhuǎn)染組PPARγ蛋白表達(dá)升高，凋亡率升高。與HR+NC組相比，HR+20b組的PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)降低、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)升高，凋亡率降低[(7.70+0.85)%vs(18.20+ 1.05)%,P＜0.05]。與HR+IN NC組相比，HR+IN 20b組的PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)升高、抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)降低，凋亡率升高[(18.9+3.05)%vs(13.0+2.25)%,P＜0.05]。結(jié)論：microRNA20b靶向作用于PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

microRNA20b；過(guò)氧化物酶體增值物受體γ；缺氧/復(fù)氧損傷；凋亡

缺血再灌注損傷是臨床冠脈搭橋手術(shù)、冠脈支架以及心臟移植等常見的病理生理現(xiàn)象[1]。由于目前缺血再灌注損傷的整體動(dòng)物模型受體內(nèi)神經(jīng)、體液的影響，不能確切反映受試藥物對(duì)損傷組織的保護(hù)作用，而體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷是模擬缺血再灌注損傷的有用模型[2-3]。多項(xiàng)研究表明過(guò)氧化物酶體增殖物受體γ（peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma，PPARγ）可以通過(guò)不同途徑減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，縮小缺血再灌注后梗死面積，提示其在這一過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-6]。microRNAs具有在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)的作用。作者前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)引起microRNA20b等6個(gè)microRNAs的顯著變化。通過(guò)前期生物信息學(xué)、雙熒光素酶等實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)microRNA20b與PPARγ之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。但是，microRNA20b是否通過(guò)PPARγ影響缺血再灌注所致的細(xì)胞凋亡，未見國(guó)內(nèi)外報(bào)道。本研究旨在通過(guò)體外建立缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞模型，觀察microRNA20b對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PPARγ表達(dá)及凋亡的影響，探討microRNA20b在調(diào)節(jié)PPARγ抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PPARγ（美國(guó)CST公司，2443），Bcl-2抗體(英國(guó)abcam公司，ab32124)，Bax抗體(英國(guó)abcam公司，ab32503)，β-actin(Santa公司，sc-477 78)，兔抗（Earthox，E030120），鼠抗（Earthox,E030110），lipofectamine2000（Invitrogen公司），Trizol（Invitrogen公司，11668027），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，RR716）, NegativeControl,microRNA20b mimics,inhibitor Negative Control,microRNA20b inhibitor，(蘇州吉瑪公司)，AnnexinV/PI雙染試劑盒（BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC細(xì)胞株，廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供），復(fù)蘇后加入含l0%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVECs隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Normal組）、缺氧后陰性對(duì)照組（HR+NC組）、缺氧后microRNA20b過(guò)表達(dá)組（HR+ 20b組）、缺氧后陰性對(duì)照抑制組（HR+IN NC組）和缺氧后microRNA20b抑制組（HR+IN 20b組）。Normal組不做處理正常培養(yǎng)，后四組分別外源轉(zhuǎn)入Negative Control 50nM、microRNA20b mimics 50nM、inhibitor Negative Control 100nM、microRNA20b inhibitor 100nM，轉(zhuǎn)染試劑使用 lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染方法：分別使用 Opti-MEM孵育 lipofectamine2000和microRNAs 5min，混合后共同孵育20 min形成絡(luò)合物后加入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染所用的培養(yǎng)基為不含血清和抗生素的培養(yǎng)基，8 h后換成完全培養(yǎng)基。繼續(xù)有氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。

1.4 缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h以后，建立缺氧/復(fù)氧細(xì)胞模型。缺氧前，將HR+NC組、HR+ 20b組、HR+IN NC組和HR+IN 20b組細(xì)胞的完全培養(yǎng)液改為不含糖和血清的培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、95%N2密閉缺氧培養(yǎng)12 h，之后換完全培養(yǎng)基，復(fù)常氧培養(yǎng)4 h；Normal組用完全培養(yǎng)基常氧培養(yǎng)相同的時(shí)間。

1.5 免疫熒光 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVECs種在鋪有22 mm×22 mm蓋玻片的六孔板中。待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，按上述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染及缺氧損傷處理。對(duì)處理之后的細(xì)胞進(jìn)行染色。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定、打孔、封閉、孵育一抗及熒光二抗后封片，4℃保存。Leica TCS SP5Ⅱ激光掃描共聚焦顯微鏡，標(biāo)記每個(gè)標(biāo)本PPARγ的熒光值，并采用IMAGE-PRO PLUS 6.0軟件計(jì)算100個(gè)細(xì)胞中PPAR γ小點(diǎn)的平均個(gè)數(shù)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù) 按上述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染及缺氧損傷處理。消化細(xì)胞，200 μL緩沖液稀釋收集各組細(xì)胞，然后各組分別加入5 μLAnnexin-V和5 μL PI進(jìn)行避光染色，再加入300 μL緩沖液混勻，冰上放置10 min即刻流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.8 Western blot 按上述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染及缺氧損傷處理。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)定量蛋白濃度，70 μg上樣，10%SDS-PAGE電泳（60 V/50 min,100 V直到蛋白分離），轉(zhuǎn)膜100 V/ 100 min。封閉1 h,然后使用Bax、Bcl-2、PPARγ及β-actin抗體按1∶1000稀釋（稀釋液為1%脫脂奶），放于4℃冰箱孵育過(guò)夜。二抗1∶10000稀釋室溫孵育2 h后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPARγ的表達(dá) 與Normal組相比，缺氧/復(fù)氧損傷各組PPARγ表達(dá)增多；缺氧/復(fù)氧損傷后，HR+ 20b組與HR+NC組相比，PPARγ表達(dá)明顯減少，HR+IN 20b組與HR+IN NC組相比，PPARγ表達(dá)明顯增多（P＜0.05）。提示microRNA20b可以抑制缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的PPARγ的表達(dá)。見圖1。

2.2 細(xì)胞早晚期凋亡率 Normal組細(xì)胞早晚期凋亡率為(3.50±0.85)%，HR+NC組為(18.20±1.05)%，HR+20b組、HR+IN NC組和HR+IN 20b組分別為(7.70±0.85)%、(13.80±2.25)%和(18.90±3.05)%。缺氧/復(fù)氧損傷各組與Normal組相比，細(xì)胞早晚期凋亡率增加；HR+20b組與HR+NC組相比，凋亡率降低（P＜0.05）；與HR+IN NC組相比，HR+IN 20b組凋亡率升高（P＜0.05）。說(shuō)明microRNA20b可以抑制缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。見圖2。

圖1 各組細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后PPARγ的表達(dá)

2.3 PPARγ、Bax和Bcl-2的表達(dá) 與Normal組相比,缺氧/復(fù)氧損傷各組PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低；與HR+ NC組相比，HR+20b組PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量升高(P＜0.05)；與HR+IN NC組相比，HR+IN 20b組PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低(P＜0.05)。提示microRNA20b可以抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)。見圖3。

3 討論

圖2 各組細(xì)胞凋亡率

業(yè)已證實(shí)，PPARγ在缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，因而深入探討PPARγ的表達(dá)調(diào)控有助于闡明其在缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制。microRNA調(diào)節(jié)是基因表達(dá)調(diào)控最為重要的一種調(diào)節(jié)方式[8-10]。本研究中，作者采用免疫熒光技術(shù)分別觀察過(guò)表達(dá)和抑制microRNA20b對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的PPARγ蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)microRNA20b可以減弱PPARγ的表達(dá)，而抑制microRNA20b可產(chǎn)生相反的變化，證實(shí)microRNA20b對(duì)PPARγ的調(diào)控作用。microRNA383也可靶向抑制PPARγ保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前腦缺血損傷，提示PPARγ表達(dá)可以受多種microRNAs的調(diào)控[11-13]。而研究報(bào)道PPARγ可以通過(guò)不同途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]，那么miroRNA20b是否可以通過(guò)調(diào)控PPARγ的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響呢？本研究采用流式細(xì)胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)microRNA20b可以明顯的降低缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞早晚期凋亡率，而抑制microRNA20b的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示microRNA20b可能通過(guò)PPARγ調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

圖3 各組凋亡相關(guān)蛋白及PPARγ的表達(dá)

細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主的程序性死亡，Bcl-2和Bax是凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2家族的兩個(gè)重要成員,二者可通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax比值升高，抑制細(xì)胞凋亡，反之，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中，外源轉(zhuǎn)入microRNA20b mimics，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，Bcl-2升高，Bax降低，Bcl-2/Bax比值升高，抑制了細(xì)胞凋亡，這與前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示microRNA20b是通過(guò)影響B(tài)cl-2/Bax而減輕細(xì)胞凋亡；而有研究發(fā)現(xiàn)[15]沉默PPARγ可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡。本研究中，轉(zhuǎn)染microRNA20b后PPARγ表達(dá)降低，Bcl-2升高，Bax降低，再次證實(shí)這一現(xiàn)象。由此可見，microRNA20b可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PPAR γ影響B(tài)cl-2/Bax復(fù)合物來(lái)影響細(xì)胞凋亡。

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（收稿：2016-12-22 修回：2017-05-18）

（責(zé)任編輯 張淑坤 余劍波）

microRNA20b Inhibits Apoptosis induced by Hypoxia/reoxygenation Injury in Endothelial Cells via Nu?clear Receptor PPARγ

LU Yue,WANG Jing-jing,LIANG Guang-bin,et al.
Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College and Key Laboratory of Organ Damage and Protection of Zhanji?ang City,Zhanjiang(524001),China

Objective To investigate the mechanism of microRNA20b reducing apoptosis induced by hypox?ia/reoxygenation injury.MethodsThe hypoxia/reoxygenation model was created use human umbilical vein en?dothelial cells(HUVECs).HUVECs were divided into 5 groups randomly as normal control group(Normal group), anoxic Negative Control group(HR+NC group),anoxic microRNA20b mimics group(HR+20b group),anoxic in?hibitor Negative Control group(HR+IN NC group)and anoxic microRNA20b inhibitor group(HR+IN 20b group). The last four groups were transfected with Negative control,microRNA20b mimics,inhibitor Negative Control or microRNA20b inhibitor respectively for 24 h.Then the transfected cells were treated with 12 hours hypoxia fol?lowed by 4 hours reoxygenation.Immunofluorescence was used to detect the expression of PPARγ.Annex?inV-FITC/PI double staining apoptosis detection was used to test the apoptosis rate of HUVECs.The expression of Bax、Bcl-2 and PPARγ were determined by western blot.ResultsThe expression of PPARγ was increased after hypoxia/reoxygenation injury compared with Normal group.Compared to HR+NC group,the expression of PPARγ and the apoptosis-related protein Bax were lower in HR+20b group,but the expression of anti-apopto?sis-related protein Bcl-2 was higher.And the apoptosis rate of HR+20b group was lower[(7.70+0.85)%vs (18.20+1.05)%,P＜0.05].Conversely,the cells in HR+IN 20b group expressed higher PPARγ protein and the apoptosis-related protein Bax but lower anti-apoptosis-related protein Bcl-2,also had higher apoptosis rate than HR+IN NC group[(18.9+3.05)%vs(13.0+2.25)%,P＜0.05].ConclusionmicroRNA20b could prevent the hypoxia/reoxygenation injury-induced apoptosis by regulating the expression of PPARγ.

microRNA20b;peroxisome prolif?erative activated receptor gamma;hypoxia/reoxygen?ation injury;apoptosis

R329.2+5

A

1007-6948(2017)03-0283-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.03.016

國(guó)家自然科學(xué)基金（81470405）

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科（湛江 524001）

2.廣東省湛江市器官功能損傷與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

張良清，E-mail:zhanglq1970@163.com