HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地龍血竭中3種黃酮類成分

李 竣，朱功俊，陳 素，劉向明，李蕓芳，楊光忠

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074 )

HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地龍血竭中3種黃酮類成分

李 竣1，朱功俊1，陳 素2，劉向明2，李蕓芳1，楊光忠1

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074 )

為建立HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地龍血竭中3種黃酮類成分的方法，選擇了廣西、云南產(chǎn)9個(gè)批次的龍血竭，測(cè)定了其中龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B的含量. 采用Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-1%冰醋酸，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm.3個(gè)藥效成分在45 min內(nèi)達(dá)到基線分離，線性關(guān)系良好.9個(gè)批次龍血竭中龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B的平均含量分別為：0.47%，0.96%，0.44%；平均加樣回收率分別為：99.6%，103.2%，100.5%；RSD分別為：1.20%，0.65%，1.30%.該實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可為龍血竭的質(zhì)量控制提供參考.

龍血竭；龍血素A；龍血素B；劍葉龍血素B ；HPLC法

龍血竭是百合科龍血樹(shù)屬劍葉龍血樹(shù)Dracaenacochinchinensis(Lour.) S. C. Chen的含脂的木材經(jīng)提取得到的樹(shù)脂[1]，主要產(chǎn)于東南亞和我國(guó)西南地區(qū)包括云南、廣西等地.其富含有查爾酮、黃酮、高異黃烷和二苯乙烯類等成分[2]，具有活血化瘀、止血、止痛，生肌等功效，臨床上用于治療外傷出血、瘡瘍不斂、跌打損傷、淤滯作痛等癥[3].在對(duì)龍血竭研究的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)龍血素A，B和劍葉龍血素B的配伍組合是其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用藥效物質(zhì)[4].

為了確定其3種藥效物質(zhì)在龍血竭中的比例關(guān)系，使用HPLC法測(cè)定其含量.目前，采用HPLC法對(duì)龍血竭進(jìn)行含量測(cè)定方法有單一化合物的含量測(cè)定[5,6]，也有多個(gè)化合物的含量測(cè)定[7,8].本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定龍血竭中3種藥效成分龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的含量，對(duì)3個(gè)廠家和9個(gè)批次的龍血竭中3種藥效成分進(jìn)行了分析比較，為龍血竭質(zhì)量控制方法提供參考依據(jù).

1 材料

1.1 試藥

龍血素A對(duì)照品(批號(hào)111660-200402)、龍血素B對(duì)照品(批號(hào)111558-201407)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，劍葉龍血素B對(duì)照品(自制，純度≥98%).乙腈為色譜純(Tedia company)，水為超純水，其他試劑均為分析純.

9批龍血竭分別購(gòu)自于西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)120127、111015、150702、100420)、廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠(批號(hào)20131002、20131003、20140707)和云南普洱丹州制藥股份有限公司(批號(hào)20150303、20140801).

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Ultimate 3000型, 美國(guó)戴安)，粉碎機(jī)(YB-2000A型, 浙江永康市速峰工貿(mào)),電子天平(AUW120D型,島津)，超聲波清洗器(KQ-500E型, 昆山市超聲儀器)，分光光度計(jì)(UEC1312028型, 上海美譜達(dá)儀器).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A)-1%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～10 min，20%～35%A；10～35 min，35%～36%A；35～45 min，36%～37%A；流速1.0 mL·min-1；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm.按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，3個(gè)檢測(cè)指標(biāo)與其他峰分離良好，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于1萬(wàn).依據(jù)對(duì)3個(gè)對(duì)照品，在供試品溶液的色譜圖中找到3個(gè)對(duì)照品相應(yīng)的色譜峰(見(jiàn)圖1).

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B對(duì)照品3.71，3.05，3.86 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加適量無(wú)水乙醇超聲使其溶解，并定容至刻度線，搖勻，即得到混合對(duì)照品溶液.

2.3 供試品溶液的制備

取龍血竭粉末(過(guò)60目篩)，約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密封，稱定質(zhì)量，室溫下超聲(250 W，40 kHz)提取30 min，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得龍血竭供試品溶液.

1) 劍葉龍血素B；2) 龍血素A；3) 龍血素B圖1 龍血竭供試品(a)和對(duì)照品(b)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Resina Draconis and reference substances

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取2.2項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1，2，3，5，7，9，10 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積.以對(duì)照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 對(duì)照品的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5 精密度考察

精密吸取2.3項(xiàng)下同一濃度的供試品溶液20 μL，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定龍血素A、龍血素B、劍葉龍血素B的色譜峰峰面積，計(jì)算其RSD分別為0.65%, 0.27%, 0.58%，表明儀器精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表2.

2.6 穩(wěn)定性考察

取龍血竭供試品溶液，分別于0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 h進(jìn)樣20 μL，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，并記錄峰面積.龍血竭供試品溶液中的龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B峰面積的RSD分別為0.62%, 0.37%, 1.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表3.

表2 儀器精密度考察

表3 供試品穩(wěn)定性考察

2.7 重復(fù)性考察

取同一批龍血竭樣品，按照2.3項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的含量，RSD分別為1.84%, 1.61%, 1.65%，表明該方法重復(fù)性良好，見(jiàn)表4.

表4 供試品重復(fù)性考察

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取已知含量的龍血竭樣品6份，每份約12.5 mg，精密稱定，置于具塞錐形瓶中.取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液15 mL于50 mL容量瓶中，并用無(wú)水乙醇定容至刻度線，取該溶液6份，每份5 mL，溶解上述6份龍血竭樣品.室溫下超聲30 min后，放冷，再稱定質(zhì)量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足失重，取該液體用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量10 μL，記錄對(duì)應(yīng)各峰峰面積，計(jì)算3個(gè)藥效成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 龍血竭中3個(gè)藥效成分的加樣回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同廠家和批次的龍血竭，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量20 μL、平行測(cè)3次，龍血竭中龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 不同廠家和批次龍血竭中3個(gè)藥效成分的測(cè)定

3 討論

本文建立了用HPLC法同時(shí)測(cè)定龍血竭中3種藥效成分的含量，該方法能使3個(gè)成分獲得基線分離(分離度大于1.5)，具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn).實(shí)驗(yàn)使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別對(duì)3個(gè)對(duì)照品溶液在190～700 nm進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示：龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B的最大吸收波長(zhǎng)分別為278,278,287 nm；龍血素A、龍血素B最大吸收波長(zhǎng)一致，且劍葉龍血素B的最大吸收波長(zhǎng)和278 nm相近，選擇278 nm作為檢測(cè)器的波長(zhǎng).

龍血素A、龍血素B具有較強(qiáng)的抗血栓、抗凝血等活血化瘀藥理作用[9,10]，是龍血竭中重要的藥效組成成分.龍血素B有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B有協(xié)同效應(yīng)[11,12].因此本實(shí)驗(yàn)選擇以龍血素A、龍血素B和劍葉龍血素B為考察指標(biāo).

龍血素A、B和劍葉龍血素B的聯(lián)合使用與龍血竭有相同的藥效作用[13]，明確這3種有效成分的含量對(duì)龍血竭質(zhì)量控制十分重要.文中HPLC法測(cè)定龍血竭中3種藥效成分，可為龍血竭的質(zhì)量控制提供參考，保證龍血竭的臨床治療效.不同廠家和批次的龍血竭中龍血素A、B和劍葉龍血素B含量存在差異，9批龍血竭藥材龍血素A、B和劍葉龍血素B的平均含量分別為0.47%,0.96%,0.44%，3種成分協(xié)同作用下治療疼痛的比例關(guān)系，為龍血竭在藥物的二次開(kāi)發(fā)提供一定思路.

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Simultaneous Determination of Three kinds of Flavonoids inResinaDraconisfrom Different regions by HPLC

LiJun1,ZhuGongjun1,ChenSu2,LiuXiangming2,LiYunfang1,YangGuangzhong1

(1 College of Pharmaceutical Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China；2 College of Biomedical Engineering, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China )

To establish a method for the determination of loureirin A, loureirin B and cochinchinenin B inResinaDraconisfrom Guangxi and Yunnan Province in China, HPLC testing was performed on a Thermo BDS Hypersil C18column (4.6 mm×250 mm) with mobile phases of acetonitrile-1% acetic acid solution in a gradient mode, with a flow rate of 1.0 mL·min-1, column temperature of 40℃, and detection wavelength of 278 nm. The three components were baseline separated in 45 mins and showed good linear relationship. The average content of loureirin A, loureirin B and cochinchinenin B in the nine batches ofResinaDraconiswere 0.47%, 0.96%, 0.44%, and the average recover rates were 99.6% (RSD=1.20%), 103.2% (RSD=0.65%), 100.5% (RSD=1.30%), respectively. This method was convenient, accurate and reliable, which could provide reference for the quality control ofResinaDraconis.

ResinaDraconis; loureirin A; loureirin B; cochinchinenin B; HPLC

2016-11-02

李 竣(1975-)，男，副教授，博士，研究方向：天然藥物化學(xué)成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：lijun-pharm@hotmail.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81403186)，湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助項(xiàng)目(T201220)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(3212015CZW15029, 3212015YCZW15095)，中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放與技改資助項(xiàng)目(KF2016005, JG2016004)

TQ460.7+2;R927.2

A

1672-4321(2017)02-0045-04