基于改進(jìn)的DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)現(xiàn)NOD2基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

李揚(yáng)，楊熹，田小利

基于改進(jìn)的DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)現(xiàn)NOD2基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性

李揚(yáng)，楊熹，田小利

目的：本研究改進(jìn)基于脫氧核糖核酸（DNA）連接酶的中低通量基因分型方法，并用此方法進(jìn)行核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體基因NOD1和NOD2與冠心病的關(guān)聯(lián)分析。

方法：通過多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）預(yù)擴(kuò)增增加連接模板分子數(shù)量，提高特異性連接效率，優(yōu)化DNA探針設(shè)計，摸索連接反應(yīng)溫度、時間、循環(huán)圈數(shù)及連接酶種類實現(xiàn)等位基因特異性連接，通過熒光摻入PCR和毛細(xì)管電泳實現(xiàn)多種等位基因特異性產(chǎn)物一次性檢測。Sanger測序驗證此方法準(zhǔn)確性后，利用此方法對NOD1和NOD2基因上的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)在1 555例冠心病患者和1887例對照受試者中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。

結(jié)果：通過優(yōu)化反應(yīng)條件和等位基因特異性探針設(shè)計原則，實現(xiàn)10 ng DNA樣本一次性分型30個等位基因多態(tài)性位點(diǎn)?；诟倪M(jìn)的DNA連接酶中低通量基因分型方法，NOD1、NOD2基因與冠心病的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，NOD2基因上rs1861759和rs751271位點(diǎn)在非高血壓條件下與冠心病相關(guān)（P均＜0.05），經(jīng)Bonferroni多重檢驗校正后，相關(guān)性仍然顯著（P均＜0.05）。

結(jié)論：本研究優(yōu)化了DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在設(shè)計上的關(guān)鍵點(diǎn)，聯(lián)合使用多重PCR和毛細(xì)管電泳，建立了一種高準(zhǔn)確性、低成本、滿足基于中低通量位點(diǎn)分型的臨床分子診斷和科研需求的基因分型新方法，并用該方法發(fā)現(xiàn)NOD2基因上的位點(diǎn)rs1861759和rs751271在非高血壓條件下與冠心病相關(guān)。

冠狀動脈疾??；基因分型；DNA連接酶類；多態(tài)性，單核苷酸

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:569.)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療理念的推廣，基因分型在臨床診斷、個體化用藥指導(dǎo)等方面的應(yīng)用需求與日劇增[1]。基因分型方法需兼顧人力、物力及時間成本，同時需要一個合適的通量符合對應(yīng)的要求。常見的單一位點(diǎn)基因檢測手段有Sanger測序、限制性片段長度多態(tài)性[2]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析[3]、等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[4]、TaqMan[5]、連接酶檢測反應(yīng)（LDR）[6]等。雖然這些方法精確度高，但如果需要檢測比較多的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，速度慢，成本高。高通量基因分型的手段有二代測序、雜交芯片等，可以一次分型百萬或更多的位點(diǎn)，但涉及復(fù)雜的生物信息學(xué)分析，得到較多冗余信息，成本昂貴[7,8]。如果需要分型的位點(diǎn)達(dá)不到如此通量，高通量基因分型手段也不是很好的選擇。本研究擬建立一種基于脫氧核糖核酸（DNA）連接酶的基因分型新方法，可高準(zhǔn)確性、低成本、快速分型十幾個甚至幾十個位點(diǎn)，滿足基于中低通量位點(diǎn)分型進(jìn)行的臨床分子診斷和科研需求。

模式識別受體是一類能特異識別病原微生物的某些結(jié)構(gòu)、進(jìn)化上保守的分子，其募集接頭蛋白并激活下游的相關(guān)信號通路，從而啟動機(jī)體的免疫應(yīng)答，在宿主的先天性免疫中發(fā)揮著重要作用。目前已報道的模式識別受體主要包括Toll 樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體、維甲酸誘導(dǎo)基因（RIG）樣受體等[9]。炎癥和先天性免疫在動脈粥樣硬化病理過程中起非常重要的作用，Toll樣模式識別受體與動脈粥樣硬化性疾病如冠心病的密切關(guān)系已經(jīng)逐漸被大家所認(rèn)識[10,11]。與Toll樣受體不同，NOD樣受體主要識別細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌產(chǎn)物。目前，NOD樣受體與冠心病的關(guān)系還不清楚。NOD樣受體家族中，NOD1和NOD2是最早被發(fā)現(xiàn)的兩類分子。NOD1在多種細(xì)胞中表達(dá)，而NOD2主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[12]。本研究將利用建立的基因分型新方法進(jìn)行NOD1和NOD2與冠心病的關(guān)聯(lián)分析。

表1 基因位點(diǎn)rs1861759和rs751271預(yù)擴(kuò)增引物和探針序列

1 材料與方法

1.1 通用試劑

EasyTaq DNA聚合酶及緩沖液購自北京全式金生物公司；10 mmol dNTP購自賽百盛生物公司；DNA marker購自博邁德生物公司；T4多聚核苷酸激酶及緩沖液購自NEB公司；Taq DNA連接酶及緩沖液購自NEB公司；pIRES-neo質(zhì)粒購自Clontech公司；Hi-Di甲酰胺等片段分析試劑購自Life Technologies公司。

1.2 DNA探針及引物

DNA 探針和引物（包括熒光修飾引物）由賽百盛生物公司合成，用于擴(kuò)增的通用引物序列是：T7m: GGATACGACTCACTATAGGT；M13m: GGTAAGGACGACGGTCCAGT；M13Rm: GCGGATAACAAGTTCACACT。位點(diǎn)rs1861759和rs751271預(yù)擴(kuò)增引物和探針序列見表1。

1.3 冠心病患者和對照受試者

本研究中，1 555例冠心病患者資料來自解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，冠心病、高血壓及糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)如之前已發(fā)表文章所述[13]，1 887例對照受試者資料來自北京大學(xué)體檢中心。

1.4 多重PCR預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增引物設(shè)計使待檢測位點(diǎn)位于產(chǎn)物中部，每對引物單獨(dú)使用時，10 ng基因組模板DNA進(jìn)行35圈擴(kuò)增有明顯目的條帶，允許有少量非特異擴(kuò)增。20 μl多重PCR體系使用1 μl引物混合物（5 μmol/引物）進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。

1.5 用于連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LCR）的DNA探針設(shè)計

如圖1所示，每個SNP位點(diǎn)需要6條DNA探針進(jìn)行LCR反應(yīng)。其中，rsX-A、rsX-G、rsX-NC和rsX-NT為等位基因特異性探針，其5’或3’末端為特定等位基因。rsX-N、rsX-NC、rsX-NT序列與基因組匹配。rsX-A和rsX-G包括與基因組序列匹配的部分（黑色線）和與通用引物T7m[6-羧基熒光素（FAM）藍(lán)色熒光標(biāo)記]或M13Rm[5-六氯熒光素（HEX）綠色熒光標(biāo)記]結(jié)合序列（藍(lán)色線），其中一個等位基因的特異探針還有3個與基因組不互補(bǔ)的堿基（黃色線）以控制兩個等位基因的終產(chǎn)物有3個堿基的長度差異。rsX包括與基因組序列匹配的部分（黑色線）和與質(zhì)粒模板結(jié)合的序列（粉紅色）。質(zhì)粒序列將用于擴(kuò)增產(chǎn)生含有stuffer序列和M13m（通用引物）結(jié)合序列的長探針，同時該序列決定stuffer序列的長度，從而控制該位點(diǎn)擴(kuò)增終產(chǎn)物的大小。

1.6 DNA探針預(yù)處理和多重LCR

設(shè)計合成的rsX-N、rsX-A、rsX-G不需要處理，rs-NC和rsNT需要磷酸化處理，rsX需要磷酸化之后通過PCR產(chǎn)生長度90～250 bp的DNA單鏈探針。磷酸化使用T4多聚核苷酸激酶，DNA長探針制備為不對稱PCR（引物M13m和磷酸化的rsX比例1:20）。

對探針進(jìn)行預(yù)混合：（1）LA，未磷酸化組：rsX-A、rsX-G和rsX-N，每個終濃度為1 μmol；（2）LB，磷酸化組：Pi-rsX-NC和Pi-rsX-NT，終濃度1 μmol；（3）LC：長度特異性序列等體積混合。Taq DNA連接酶催化的多重LCR體系包括：LA，0.2 μl；LB，0.2 μl；LC，1 μl。反應(yīng)條件為94℃，20 s；48℃，150 s；循環(huán)35圈；4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.7 熒光摻入PCR

熒光引物（M13Rm-HEX／T7m-FAM）

和通用引物M13m的PCR擴(kuò)增體系10 μl，

包含10倍稀釋的連接產(chǎn)物1 μl。反應(yīng)條件：

55℃退火，30 s；72℃延伸，30 s；循環(huán)25圈。

1.8 片段分析

HiDi甲酰胺與Liz 500以60:1比例混合，

9 μl混合液加1 μl熒光摻入PCR產(chǎn)物，94℃變

性2 min后立刻冰置，冷卻后進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

片段分析結(jié)果使用GeneMarker V1.6分析。

1.9 電泳結(jié)果判讀

對于不確定峰型歸類的樣本均進(jìn)行1

代測序驗證，若不確定樣本超過5%則該位點(diǎn)視為分型失??；成功判定的樣本，也按一定的比例抽樣進(jìn)行1代測序驗證，若準(zhǔn)確率低則該位點(diǎn)也被視為分型失敗。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS軟件中二分類Logistic回歸分析每個SNP位點(diǎn)在危險因素校正和不校正情況下與冠心病的相關(guān)性。多重檢驗校正采用Bonferroni校正方法。P＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 基因分型流程圖

2 結(jié)果

2.1 總體基因分型流程（圖1）

該方法分為四步：（1）基因組DNA預(yù)擴(kuò)增，使包含待分型位點(diǎn)的基因組區(qū)域得以富集；（2）等位基因特異性連接反應(yīng)，只有與模板完全匹配的探針可以高效完成連接反應(yīng)；（3）熒光摻入PCR，通過熒光標(biāo)記的通用引物往連接產(chǎn)物中摻入熒光，同時擴(kuò)增富集連接產(chǎn)物；（4）產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分析，同一位點(diǎn)的不同等位基因有3個堿基（黃色標(biāo)記）的差異可以被毛細(xì)管電泳分辨，不同位點(diǎn)設(shè)計不同的填充序列長度（建議差異大于10 bp），也可被分辨。考慮到毛細(xì)管電泳的分辨率和電泳效果，終產(chǎn)物最好100 ～250 bp。因此，單色熒光可一次分型約15個位點(diǎn)，設(shè)置兩種熒光不相互干擾的通用引物可使通量加倍。

2.2 預(yù)擴(kuò)增PCR

比較理想的多重引物預(yù)擴(kuò)增結(jié)果在100～200 bp之間有一條較粗的明亮條帶。

2.3 連接酶反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)化

DNA連接酶的選擇：常見的耐熱DNA連接酶有Taq DNA連接酶以及9N DNA連接酶，通過比較我們選擇了特異性更好的Taq DNA連接酶。值得注意的是，Taq DNA連接酶緩沖液含有氧化型輔酶I，長期保存必須放在-80℃，而短期保存必須放在-20℃。LCR探針設(shè)計優(yōu)化：rsX和rsX-N探針無特異性問題，和模板配對的部分一般為19 bp。其他四條探針涉及到特異性配對的問題，需要符合以下條件：（1）SNP位點(diǎn)本身在序列一端；（2）GC含量適當(dāng)，長度在11～15個堿基，3GC+AT=24-27（不包括SNP位點(diǎn)本身）；（3）避免簡單重復(fù)序列；（4）選擇SNP兩翼的序列中更接近上述條件的做等位基因特異性探針。LCR溫度方面，經(jīng)過對比，我們發(fā)現(xiàn)48℃特異性最強(qiáng)，而且SNP之間的信號更加均一。

2.4 熒光染料的選取

熒光引物PCR中，我們嘗試了FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX多種熒光染料修飾引物。綜合考慮光譜兼容性以及引物修飾難度，最終選擇FAM和HEX兩種熒光修飾公共引物。

2.5 片段分析

熒光摻入PCR的產(chǎn)物因有熒光標(biāo)記需要避光保存并盡快上機(jī)，上機(jī)前終產(chǎn)物電泳結(jié)果在150～250 bp長度范圍內(nèi)可見連續(xù)條帶。上機(jī)毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖2所示，每一個峰代表一種終產(chǎn)物。

2.6 NOD1和NOD2基因關(guān)聯(lián)分析

我們用該方法對NOD1和NOD2基因上的8個SNP位點(diǎn)（NOD1基因位點(diǎn)包括rs41524946、rs2284358、rs17159048、rs1558068；NOD2基因位點(diǎn)包括rs2111235、rs8057341、rs1861759、rs751271）在兩個人群中進(jìn)行了分型，人群1包括784例冠心病患者和895例對照受試者；人群2包括474例冠心病患者和486例對照受試者（表2）。

圖2 毛細(xì)管電泳結(jié)果

表2 進(jìn)行NOD1和NOD2基因分型的兩個人群的基本資料比較

8個位點(diǎn)中，rs1558068位點(diǎn)因峰形圖不確定歸類的樣本超過5%被視為分型失敗，其余7個位點(diǎn)可以成功分型，每個位點(diǎn)抽檢32個樣本進(jìn)行1代測序驗證結(jié)果吻合率達(dá)到100%，認(rèn)為分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠（圖3）。

圖3 NOD的7個SNP位點(diǎn)三種基因型的分型電泳圖舉例

與冠心病關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果顯示，7個位點(diǎn)等位基因分布頻率在冠心病患者和對照受試者中無明顯區(qū)別，說明NOD1和NOD2基因與冠心病發(fā)病不相關(guān)。當(dāng)以性別進(jìn)行分層分析時，NOD2基因的兩個位點(diǎn)rs8057341和rs751271在女性中顯示出與冠心病一定的相關(guān)性，合并兩個人群后，非校正P值達(dá)到0.002和0.003，但經(jīng)過危險因素校正后并不相關(guān)。當(dāng)以是否合并高血壓進(jìn)行分層分析時，結(jié)果顯示，在合并高血壓的人群，7個位點(diǎn)與冠心病無明顯相關(guān)性。但在非高血壓人群，NOD2基因的4個位點(diǎn)都顯示出一致的相關(guān)性（表3）。

合并兩個人群并進(jìn)行危險因素校正后，其中的兩個位點(diǎn)rs1861759和rs751271的P值達(dá)到0.001和0.002，經(jīng)過多重檢驗Bonferroni校正后P值分別為0.007和0.014，仍然有統(tǒng)計學(xué)意義。另外兩個位點(diǎn)在合并人群中P值達(dá)到0.015和0.011，但經(jīng)多重檢驗Bonferroni校正后沒有統(tǒng)計學(xué)意義。我們計算了rs1861759和rs751271位點(diǎn)的統(tǒng)計檢驗效能，如果設(shè)置檢驗閾值（α）為0.05，兩位點(diǎn)的檢驗效能分別為0.944和0.766。

為了進(jìn)一步提高檢驗效能，得到更加可靠的結(jié)論，我們在另一個非高血壓人群（人群3）中用直接測序的方法檢測了目標(biāo)位點(diǎn)rs1861759和rs751271，并進(jìn)行與冠心病的關(guān)聯(lián)分析（表4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩位點(diǎn)在非高血壓人群中仍然顯示與冠心病相關(guān)（表5）。三個人群合并后，設(shè)置α為0.05，計算兩個位點(diǎn)的統(tǒng)計效能分別為0.998和0.917；如果考慮多重檢驗，以最嚴(yán)格的Bonferroni方法計算，設(shè)置α= 0.05/7，計算兩個位點(diǎn)的統(tǒng)計效能分別為0.981和0.760。

表4 非高血壓人群（人群3）的基本資料（n=803）

表3 候選基因位點(diǎn)與不合并高血壓的冠心病的關(guān)聯(lián)分析

表5 基因位點(diǎn)rs1861759和rs751271與不合并高血壓的冠心病關(guān)聯(lián)分析

3 討論

本研究優(yōu)化了DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在設(shè)計上的關(guān)鍵點(diǎn)，聯(lián)合使用多重PCR和毛細(xì)管電泳，建立了一種基于DNA連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的中低通量基因分型新方法，填補(bǔ)了中低通量位點(diǎn)分型缺乏準(zhǔn)確、快速而又低成本方法的空缺。方法創(chuàng)新點(diǎn)在于：（1）在探針上加入人工特異片段控制產(chǎn)物長度和擴(kuò)增的特異性，實現(xiàn)多個位點(diǎn)的分型在同一個反應(yīng)中進(jìn)行；（2）確定等位基因特異性探針設(shè)計原則，增加連接反應(yīng)特異性，進(jìn)而提高分型準(zhǔn)確性；（3） 摻入熒光引物，借助高分辨率毛細(xì)管凝膠電泳，實現(xiàn)多個位點(diǎn)一次性檢測，增加通量。4）與多重PCR結(jié)合，降低模板DNA用量。

由于實驗中每個位點(diǎn)涉及多種DNA探針，探針制備成本較高，步驟較多。因此，本方法對應(yīng)于中低通量位點(diǎn)、大樣本量的分型需求，這樣分型條件一旦確定可以分型大量樣本，平均到每個樣本的分型成本和工作量較低。除了經(jīng)濟(jì)成本低，本方法的樣本成本也很低。通常一代測序每個位點(diǎn)需要至少10 ng的模板DNA，而本方法平均每個位點(diǎn)僅用低于1 ng的模板DNA。第三，本方法快速而準(zhǔn)確性高，從預(yù)擴(kuò)增到拿到結(jié)果1天內(nèi)完成，且準(zhǔn)確性與一代測序相當(dāng)。

由結(jié)果可見，同一批電泳的不同位點(diǎn)的峰型圖高低并不完全一致，同一位點(diǎn)的兩個等位基因的高度也不一致，這是由于多步反應(yīng)中不同位點(diǎn)或同一位點(diǎn)的兩個等位基因反應(yīng)效率差異導(dǎo)致的。如果位點(diǎn)間差異過大，甚至有的位點(diǎn)沒有出峰，可以調(diào)整預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)引物的濃度來平衡不同位點(diǎn)產(chǎn)物量。對于同一位點(diǎn)兩個等位基因高度差異問題，只要分型結(jié)果中有明確的3種類型的峰型圖，可以準(zhǔn)確判定3種基因型，即可不必調(diào)整，否則需要調(diào)整LCR過程中探針的用量。不同位點(diǎn)3種基因型的峰型圖是有差異的，所以每做新位點(diǎn)時需要首先通過一代測序明確3種基因型的峰圖形式。

越來越多的研究揭示，細(xì)菌感染在動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的重要作用[14-16]。因此，細(xì)胞內(nèi)識別細(xì)菌產(chǎn)物的NOD樣受體有可能與冠心病的發(fā)生相關(guān)。應(yīng)用新的分型方法，我們對NOD樣受體NOD1和NOD2基因進(jìn)行了與冠心病的關(guān)聯(lián)分析。在非高血壓人群，NOD2基因的兩個位點(diǎn)rs1861759和rs751271與冠心病相關(guān)。然而，在本研究中，我們并沒有發(fā)現(xiàn)NOD1基因的多態(tài)性位點(diǎn)與冠心病的相關(guān)性。NOD1在多種細(xì)胞中表達(dá)，而NOD2主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[12]；此前的研究也發(fā)現(xiàn)NOD1和 NOD2兩基因的表達(dá)調(diào)控模式不盡相同[17]，暗示這兩個基因在動脈粥樣硬化病理過程中作用可能不同。當(dāng)然，由于我們的樣本數(shù)量是有限的，本研究并不能排除NOD1基因與冠心病的相關(guān)性。

綜上所述，本研究建立了一種基于DNA連接酶的基因分型新方法，該方法準(zhǔn)確、快速而又低成本，適用于一般實驗條件下中低通量位點(diǎn)、大樣本量的分型需求。應(yīng)用該新方法，我們完成了NOD樣受體基因NOD1和NOD2與冠心病的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)NOD2基因上位點(diǎn)rs1861759和rs751271在非高血壓條件下與冠心病相關(guān)。

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Association Study of NOD2 Gene and Coronary Artery Disease Based on Optimized DNA Ligase Chain Reaction

LI Yang, YANG Xi, TIAN Xiao-li.
Vascular Biology Laboratory, Beijing Anzhen Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing Institute of Heart, Lung and Blood Vessel Diseases, Beijing (100029), China

TIAN Xiao-li, Email: tianxiaoli@ncu.edu.cn

Objective: Based on optimized method of DNA ligase chain reaction in medium/low throughput genotyping, we assessed the relationship between NOD-like receptor genes NOD1, NOD2 and coronary artery disease (CAD) occurrence.

Methods: A multiplex PCR was conducted to enrich DNA template; probe design, annealing temperature, time and number of circulation of PCR were opfimizecl for allele specific ligation; allele specific products were identified by fluorescence PCR and capillary electrophoresis; the accuracy was verified by Sanger sequencing. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) on NOD1 gene and NOD2 gene were examined in 1555 CAD patients and 1887 control subjects; the relationship between SNPs and CAD occurrence was studied.

Results: Based on optimized PCR condition and allele specific probe design, 30 allele loci genotyping can be genotyped by 10ng DNA template at one time. Association study presented that rs751271 and rs1861759 on NOD2 gene were related to non-hypertensive CAD, all P＜0.05; with Bonferroni correction, such correlation was still significant, all P＜0.05.

Conclusion: We optimized DNA ligase chain reaction and established a novel high accuracy, low cost method for thedemand of medium/low throughput genotyping in clinical molecular diagnosis. With this method, we identified that rs1861759 and rs751271 on NOD2 gene were associated with non-hypertensive CAD.

Coronary atery disease; Genotype; DNA ligases; Polymorphism, mononucleotide

2017-01-17）

（編輯：朱柳媛）

973項目（2013CB530700）；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目（81130003）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81070262）

100029 北京市，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 北京市心肺血管疾病研究所 血管生物研究室（李揚(yáng)）；北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所（楊熹）；南昌大學(xué)人類衰老研究所 生命科學(xué)學(xué)院（田小利）

李揚(yáng) 助理研究員 博士 研究方向：心血管疾病遺傳學(xué)研究 Email: liyanganzhen@126.com 通訊作者：田小利 Email: tianxiaoli@ncu.edu.cn中圖分類號：R54 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3614（2017）06-0569-06 doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.010