聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩中的表達研究

趙競伊　靳小雷　宗憲磊等

[摘要]目的：探討聚集蛋白多糖（Aggrecan）在瘢痕疙瘩中的表達和意義。方法：臨床收集瘢痕疙瘩及正常皮膚組織標本各10例，采用免疫組織化學技術及蛋白印跡方法檢測其中Aggrecan的表達，并對結果進行統(tǒng)計學分析。結果：Aggrecan在瘢痕疙瘩及正常皮膚組織中皆有表達，但在瘢痕疙瘩中表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩組織中表達增高，提示其可能參與瘢痕疙瘩形成過程。

[關鍵詞]聚集蛋白多糖；瘢痕疙瘩；細胞外基質；表達

[中圖分類號]R619⁺.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）03-0077-03

瘢痕疙瘩（Keloid，KD）是一種特殊病理性瘢痕，具有腫瘤侵襲性、生長超出原始損傷范圍、不易自行消退、單純切除易復發(fā)等特點，影響美觀的同時伴隨著瘙癢、疼痛等不適，給患者身心帶來巨大痛苦。目前瘢痕疙瘩發(fā)病機制尚未完全明確，缺乏可靠有效的治療手段，是各學者研究的熱點和難點。其中瘢痕疙瘩特異性蛋白及分子標志物，因其既可作為探討病理性瘢痕發(fā)生發(fā)展機制的突破點，又可作為其診治療效的檢測指標，受到了廣泛的關注。本研究團隊前期通過采用蛋白質組學技術對瘢痕疙瘩蛋白進行定量標記檢測研究，分析其與正常皮膚的表達差異，建立了瘢痕疙瘩差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)聚集蛋白多糖（Aggrecan）在瘢痕疙瘩中表達上調較明顯，現(xiàn)采用免疫組織化學技術及蛋白印跡（Western blot）進行驗證，報道如下。

1材料和方法

1.1一般資料：所有標本取自我科2014年-2015年門診及住院患者整形手術切除的組織。瘢痕疙瘩患者，男4例，女6例；年齡24～56歲，平均37歲；患處分別為胸部4例，肩部4例，下頜2例；病程10個月～19年，平均6.3年。診斷標準為：①病程超過9個月而無自發(fā)消退征象；②皮膚損害超過原有損傷范圍并向周圍正常皮膚侵犯；③以前曾行手術切除或冷凍、激光、激素封閉或放療等而又復發(fā)者。所有患者均已依靠臨床表現(xiàn)及病理檢查確診。正常皮膚標本取自整形外科手術中切取的正常皮膚組織（Normal skin，NS），男3例，女7例；年齡28～54歲，平均32歲；取樣部位分別為面部6例，四肢4例。所有組織切取后分成兩部分，一份經(jīng)液氮速凍，-80℃保存；一份加入福爾馬林溶液固定。所有患者均簽署科研知情同意書。

1.2實驗儀器與試劑：倒置相差顯微鏡（Nikon公司）、組織切片機RM2135（Leice公司）、PHY-IU病理組織漂烘處理儀（常州中威電子儀器廠）、“Tissue-Tek”TEC組織包埋機、2U2-EO型臺式干燥箱（南通科學儀器廠）、組織勻漿機、分光光度計（德國Eppendorf生物公司）。二步法免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）、蛋白裂解液（碧云天生物技術研究所）、鼠抗人Aggrecan一抗（英國Abcam公司）、鼠抗人β-Actin一抗（北京中杉金橋技術有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1免疫組織化學染色：將福爾馬林固定后的瘢痕疙瘩及正常皮膚組織取材，切成約1cm×0.5cm×0.2cm的小塊后包埋，組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，無水乙醇逐步水化，抗原修復，采用二步法免疫組化染色，嚴格按說明書進行操作。Aggrecan一抗按1：100稀釋，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。Aggrecan染色以細胞核或細胞質出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。

1.3.2 Western Blot檢測：用總蛋白提取試劑盒分離蛋白，-80℃儲存，備用。以BCA方法檢測蛋白含量：50 μg總蛋白量在10%SDS-PAGE中電泳分離，并電轉至PVDF膜，加入Aggrecan一抗，4℃孵育過夜，以辣根過氧化物酶結合的抗小鼠二抗（1：10000）室溫孵育1h后，采用Super-signalWest Picokit（Pierce）化學發(fā)光試劑盒和X線膠片顯示特異性蛋白條帶，以β-actin蛋白為內參對樣本的蛋白含量進行校準和半定量分析。

1.4統(tǒng)計學方法：采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，用獨立樣本t檢驗對檢測結果進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1免疫組化學染色：兩組樣品染色后，顯微鏡下觀察，瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織的表皮層、真皮層細胞都有Aggrecan表達，其主要表達于細胞核中，表皮細胞、真皮成纖維細胞、毛囊細胞、汗腺細胞及血管內皮細胞的細胞核都有表達（圖1）。比較瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織免疫組化染色陽性灰度值（Integrated option density，IOD），瘢痕疙瘩組織陽性灰度值與正常組織相比顯著增高（P<0.05）。

2.2 Western Blot檢測：檢測結果顯示，瘢痕疙瘩組織中Aggrecan蛋白表達水平明顯高于正常皮膚對照組，進行半定量分析顯示其蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖2）。

3討論

瘢痕疙瘩組織學特點為大量成纖維細胞（Fibroblast，F(xiàn)B）增生，細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積、膠原纖維排列紊亂。大量研究表明，瘢痕疙瘩組織中ECM的數(shù)量和成分較正常皮膚組織有明顯改變。ECM能夠影響FB的形態(tài)、遷移、增生、分化和代謝，與細胞因子相互作用影響FB生物學功能，對瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展有明顯的調節(jié)作用。

蛋白多糖作為ECM的重要成分之一，在皮膚創(chuàng)傷愈合、組織修復、腫瘤發(fā)生等方面都起著至關重要的作用，目前蛋白多糖家族中的多種因子作為病理性瘢痕特異性分子標志物研究受到了廣泛關注。

細胞外基質中蛋白多糖主要包括兩大家族成員——大分子聚合硫酸軟骨素蛋白聚糖（the Large Aggregating Chondroitin Sulfate Proteoglycans，Lecticans）和小富亮氨酸蛋白聚糖（Small Leucine-rich Proteoglycans，SLRPs）。其中，小分子蛋白多糖家族中的核心蛋白多糖（decorin）、雙糖鏈蛋白多糖（biglycan）等都已經(jīng)被研究證實與瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展相關。而Lecticans家族的多功能蛋白聚糖（versican）也是目前研究較為深入的一類細胞外基質蛋白多糖，它通過TGF-β₁相關調控途徑參與了病理性瘢痕的發(fā)生過程，促進了成纖維細胞的生長、增殖及膠原合成。與正常皮膚相比，versican在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕的真皮網(wǎng)狀層中顯著高表達。

聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是Lecticans家族的經(jīng)典成員之一，是主要表達于透明軟骨組織中的一種軟骨素硫酸化蛋白多糖。目前對Aggrecan的研究主要集中于其在骨、軟骨發(fā)育中的作用以及其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關系上，探討其在皮膚增生性疾病中的表達及意義方面的研究很少。其主要特性是能夠在連接蛋白的幫助下牢固結合細胞外基質重要分子透明質酸（Hyaluronic Acid，HA），從而形成大分子Aggrecan聚合體。早有研究證明HA在瘢痕疙瘩成纖維細胞及表皮中表達顯著升高，這可能與Aggrecan形成大分子聚合體有關。Shih B的研究也發(fā)現(xiàn)了Aggrecan在瘢痕疙瘩內部組織中的表達顯著高于其與正常皮膚交界部位的皮膚，從另一個方面也證實了Aggrecan可能與瘢痕疙瘩的增生有關。

瘢痕疙瘩作為一種發(fā)病機制尚未明確的皮膚疾病，其發(fā)生發(fā)展過程中存在各種表達異常，過表達或表達不足的細胞因子相互影響，形成復雜的蛋白質相互作用網(wǎng)絡，參與了瘢痕疙瘩的發(fā)病，因此開展對瘢痕疙瘩相關因子及標志物的深入研究，進一步明確其內部的聯(lián)系，篩選出某種或某類對瘢痕疙瘩具有高度特異性的標志物應用于臨床，對瘢痕疾病早期快速診斷及有效治療均有重要意義。本文在前期采用蛋白質組學技術對瘢痕疙瘩蛋白進行定量標記檢測研究發(fā)現(xiàn)聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩中表達上調較明顯的基礎上，采用免疫組織化學技術及蛋白印跡進行驗證，進一步證實了聚集蛋白聚糖在瘢痕疙瘩組織中表達水平明顯高于正常皮膚對照組，提示聚集蛋白多糖在瘢痕疙瘩發(fā)病中具有一定的作用，為深入開展瘢痕疙瘩發(fā)病機制的研究增加了新的內容。