廊坊衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院
賈云波 杜惠蘭△ 姚穎玉(廊坊 065001)
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腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥大鼠造模方法的建立與評價(jià)*
廊坊衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院
賈云波 杜惠蘭△姚穎玉(廊坊 065001)
目的:研制腎陽虛血瘀證子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)病證結(jié)合大鼠模型,以供EMT中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用。方法:模擬婦科“冒雨涉水,感受寒邪”的病因,依據(jù)“寒邪傷陽”的中醫(yī)理論,與傳統(tǒng)的“自體移植”EMT動(dòng)物模型相結(jié)合,建立病證結(jié)合的腎陽虛血瘀證EMT動(dòng)物模型。依據(jù)冷凍時(shí)間長短及前后順序行3種不同的造模模式。冷凍1個(gè)月,行EMT造模,再冷凍1個(gè)月設(shè)為“冷凍+造模+冷凍”組;冷凍1個(gè)月,行EMT造模后不冷凍為“冷凍+模型”組;先不冷凍,行EMT造模后,再冷凍1個(gè)月,設(shè)為“造模+冷凍”組,另設(shè)假手術(shù)組。用理化檢驗(yàn)指標(biāo)評價(jià)該模型的臨床符合度。結(jié)果:與冷凍+模型組、造模+冷凍組、假手術(shù)組比較,冷凍+造模+冷凍組EMT的大鼠模型能反映腎陽虛血瘀證的中醫(yī)基本證候特征,與EMT的疾病特點(diǎn)相符合。結(jié)論:冷凍+造模+冷凍方法是理想的腎陽虛血瘀證EMT實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?/p>
腎陽虛血瘀證;子宮內(nèi)膜異位癥;大鼠模型; 痛經(jīng); 月經(jīng)不調(diào); 不孕; 癥瘕; 寒邪傷陽
子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)簡稱內(nèi)異癥,是指子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜以外的部位出現(xiàn)、生長、浸潤、反復(fù)出血,可形成結(jié)節(jié)及包塊,引起疼痛和不育等,是臨床常見病、多發(fā)病,目前該病的發(fā)病機(jī)制尚未明確。中醫(yī)無EMT的病名,根據(jù)EMT的臨床表現(xiàn),本病應(yīng)屬于“痛經(jīng)”“不孕”“癥瘕”“月經(jīng)不調(diào)”等疾病范疇。中醫(yī)證候動(dòng)物模型的建立與研究是連接中醫(yī)基礎(chǔ)和臨床的橋梁與紐帶,對臨床研究及治療具有重要的指導(dǎo)作用。[1]本課題模擬婦科“冒雨涉水,感受寒邪”的致病因素和感邪途徑,依據(jù)“寒邪傷陽”的中醫(yī)理論,運(yùn)用徐丁潔[2]“延長冰箱冷凍加冰水浸泡”結(jié)合EMT“自體移植法”建立腎陽虛血瘀證EMT大鼠造模,根據(jù)造模后大鼠宏觀表現(xiàn)及理化指標(biāo)檢測結(jié)果,選擇理想的腎陽虛血瘀證EMT的模型,以供臨床實(shí)驗(yàn)研究用。本實(shí)驗(yàn)于2014年3月至2014年7月在河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物:選取40只健康SD大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):1407014),雌性,清潔級,鼠齡3個(gè)月,體質(zhì)量(200±20)g,大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)室通風(fēng)良好,飼養(yǎng)期間給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料,自由飲水。
1.1.2 試劑、儀器:睪酮放免試劑盒(TRG41409,天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)、孕酮放免試劑盒(TRG51409,天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)、雌二醇放免試劑盒(TRG61409,天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司);慶大霉素(批號(hào):1405081,天津金耀有限公司)、 PRECIL普利生(北京普利生儀器有限公司)、LBY-N7500B全自動(dòng)血液流變儀(北京普利生儀器有限公司)、 BCD-257SL B 4℃海爾冰箱;歐姆龍電子體溫計(jì)MC-145;三洋SANYO SIM-F140AY65制冰機(jī)(上海啟步生物科技有限公司)、普通光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)、稱重儀。
1.2 分組與造模
1.2.1 分組:40只健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為4組,每組10只。設(shè)實(shí)驗(yàn)組3組,分別為冷凍+造模+冷凍(冷造冷)、冷凍+造模(冷造)、造模+冷凍(造冷)組;另設(shè)假手術(shù)組(對照組)。
1.2.2 虛寒型大鼠造模:用冷凍方法造模,大鼠5只一籠,每組2籠,籠中加0~1℃冰水,深度為150 mm,置于4℃冰箱中,2次/d(固定時(shí)間9:00 am及9:00 pm),20 min/次,共30 d。冷造組大鼠,先行冷凍,然后子宮內(nèi)膜移植造模;冷造冷組先行冷凍,然后子宮內(nèi)膜移植造模,再行冷凍;造冷組先行子宮內(nèi)膜移植造模,再行冷凍;假手術(shù)組大鼠常規(guī)飼養(yǎng),未行任何方法造模。造模大鼠從冰水中取出后獨(dú)籠飼養(yǎng),觀察二便情況,并用涂有凡士林的歐姆龍電子體溫計(jì)探頭插入直腸約1 cm測溫,待體溫計(jì)顯示數(shù)字后取出,記錄數(shù)據(jù)。當(dāng)大鼠體溫降低(范圍36.8~37.6 ℃,低于對照組,差異并有顯著性)、陰道細(xì)胞涂片顯示動(dòng)情周期紊亂時(shí),提示虛寒型大鼠造模成功。
1.2.3 子宮內(nèi)膜移植造模:待統(tǒng)一的動(dòng)情間期(陰道涂片以白細(xì)胞為主),冷造冷組、冷造組、造冷組大鼠行“自體移植法”EMT造模,[3]將實(shí)驗(yàn)3組大鼠分別稱重后,3%水合氯醛麻醉,待麻醉滿意后,將大鼠仰臥位,頭部及四肢固定在手術(shù)板上,取下腹部5×4 cm大小的皮膚備皮,腹部剪毛。在無菌條件下開腹,取下腹正中切口長 1.5 cm,進(jìn)入腹腔后分離子宮,結(jié)扎子宮系膜上的血管,再結(jié)扎需要切除子宮的兩端,取中間段 2 cm,將切下的子宮組織迅速放入裝有PBS溶液的玻璃皿中,再將其縱向切開,縱行剪開宮腔,剝離宮內(nèi)膜,將剝離的宮內(nèi)膜剪成等大的兩塊,分別縫合于左側(cè)卵巢、左側(cè)腹膜壁層,檢查腹腔內(nèi)無出血,逐層縫合腹壁及皮膚,關(guān)腹前腹腔內(nèi)注射慶大霉素0.1 mL。將剩余的內(nèi)膜組織進(jìn)行組織學(xué)檢查,以證實(shí)移植物為子宮內(nèi)膜。術(shù)后讓大鼠自然蘇醒,分籠單放,常規(guī)飼養(yǎng)不冷凍。術(shù)后3 d連續(xù)肌肉注射慶大霉素,0.1 mL/只,1次/d。術(shù)后第4 d開始冷凍,冷造冷、造冷組的大鼠連續(xù)冷凍30 d,方法同前。假手術(shù)組僅行開腹手術(shù),但不移植子宮內(nèi)膜。冷造組及假手術(shù)組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。
1.3 觀察指標(biāo)與方法 每天上午、下午各做陰道涂片1次以確定動(dòng)情周期,待統(tǒng)一動(dòng)情間期,禁食24 h后,待麻醉滿意后,處死大鼠。行股動(dòng)脈取血3 mL,分離血清,-20℃冰箱保存待測。冰浴條件下剖腹觀察異位內(nèi)膜生長的情況,無菌操作迅速取下胸腺、脾臟、子宮,去掉脂肪組織,吸去血跡后稱重待測。
1.3.1 大鼠一般情況:肉眼觀察大鼠外觀變化。
1.3.2 大鼠盆腔改變:大體肉眼觀察。外觀、毛色、精神、反應(yīng)、二便情況。
1.3.3 性激素檢測:放射免疫分析法(用放射性核素標(biāo)記待檢測物質(zhì),通過儀器對放射性物質(zhì)的接收對待測物質(zhì)進(jìn)行定量檢測)檢測血孕酮、雌二醇、睪酮。
1.3.4 血液黏度的檢測:應(yīng)用北京普利生儀器有限公司LBY-N7500B全自動(dòng)血流變儀直接檢測(一種血液臨床檢測儀器,直接對血液樣本進(jìn)行檢測)。
1.3.5 臟器指數(shù)的計(jì)算:冰浴條件下剖腹觀察異位內(nèi)膜生長的情況,無菌操作迅速取下胸腺、脾臟、子宮,去掉脂肪組織,吸去血跡后稱重,計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重(mg) /體質(zhì)量(g) 。
2.1 一般狀況比較 實(shí)驗(yàn)過程中,假手術(shù)組大鼠的外觀無明顯差異,毛色白,有光澤,精神佳,活潑,反應(yīng)靈敏,飲食、二便均正常,輔料3天更換1次,不濕。冷造冷組大鼠身臟毛污明顯,反應(yīng)遲鈍,懶動(dòng),行動(dòng)緩,寒戰(zhàn),爪色白,呼吸弱,被毛無光,飲水少,大便溏。冷造組及造冷組大鼠出現(xiàn)身臟毛污,反應(yīng)遲鈍,蜷縮懶動(dòng),后肢行動(dòng)遲緩、寒戰(zhàn),扎堆怕冷、爪尾部蒼白,尾部皮下瘀紫、耳色蒼白,呼吸微弱,被毛無光澤,飲水量少,大便稀溏等,實(shí)驗(yàn)3組的輔料2天更換1次,較濕。根據(jù)臨床上EMT患者表現(xiàn)為經(jīng)行腹痛,月經(jīng)先后不定,經(jīng)量或多或少,經(jīng)色黯,或有血塊,不孕,盆腔結(jié)節(jié)包塊,面色晦黯,腰膝酸軟,性欲減退,畏寒等癥狀,冷造冷組大鼠的表現(xiàn)與臨床患者癥狀接近。
2.2 各組盆腔異位灶觀察比較 肉眼見冷造冷組移植物生長良好,體積明顯增大,呈隆起黯紅色或透亮的小囊狀,內(nèi)部充滿積液,表面血管清晰可見,異位組織周圍血管豐富,有些異位組織與周圍組織黏連;冷造及造冷組移植物體積較小,表面血管細(xì),異位組織周圍血流差。
2.3 各組大鼠體溫、體質(zhì)量情況比較 大鼠行虛寒型造模30 d,冷造冷組、冷造組大鼠體溫較造冷組及假手術(shù)組大鼠體溫降低,統(tǒng)計(jì)處理后,冷造冷組大鼠體溫與冷造組、造冷組、假手術(shù)組大鼠比較差異有顯著性(P<0.05)。行EMT造模后,繼續(xù)虛寒造模30 d,冷造冷組與造冷組大鼠體溫比較差異無顯著性(P>0.05),冷造冷組與冷造組、假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05);大鼠行虛寒型造模30 d,各組大鼠體質(zhì)量有所增加,但冷造冷組、冷造組、造冷組大鼠上體質(zhì)量升緩慢,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后,冷造冷組與造冷組、冷造組、假手術(shù)組大鼠體質(zhì)量差異有顯著性(P<0.05);行EMT造模成功后,從術(shù)后第4 d開始繼續(xù)虛寒造模30 d,冷造冷組與造冷組、冷造組、假手術(shù)組差異有顯著性(P<0.05)。詳見表1。
組別n體溫(℃) 凍30d 凍60d體質(zhì)量(g) 凍30d 凍60d假手術(shù)組1038 22±0 2438 15±0 31211 6±3 58216 9±2 48冷造冷組1037 43±0 2337 21±0 30199 4±3 70206 1±2 07造冷組1037 84±0 2637 38±0 24204 4±4 17211 5±4 01冷造組1038 15±0 2438 11±0 20206 9±4 99211 3±4 19F值-22 0128 4515 0317 65P值-<0 05<0 05<0 05<0 05
2.4 各組大鼠血清性激素水平比較 實(shí)驗(yàn)取血后即進(jìn)行激素水平檢測。冷造冷組、造冷組、冷造組大鼠的雌二醇、孕酮、睪酮水平較假手術(shù)組大鼠均有降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后,冷造冷組雌二醇水平與其余各組比較差異均有顯著性(P<0.05),冷造冷組、造冷組、冷造組、假手術(shù)組間睪酮、孕酮水平兩兩比較差異均有顯著性(P<0.05)。詳見表2。
組別n雌二醇(pg/mL)孕酮(ng/dL)睪酮(ng/dL)假手術(shù)組1033 56±3 1234 65±3 0636 58±2 36冷造冷組1022 02±3 2514 94±1 4310 46±0 97造冷組1026 16±3 9019 93±3 6917 2±34 11冷造組1029 05±2 5230 76±5 7129 18±5 04F值-28 2958 574 61P值-<0 05<0 05<0 05
2.5 各組大鼠血液黏度的比較 實(shí)驗(yàn)取血后即進(jìn)行檢測。4組大鼠全血黏度的低切、中切及高切間兩兩比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后,差異均有顯著性(P<0.05); 還原黏度的低切冷造冷組與其他3組兩兩比較差異有顯著性(P<0.05),冷造冷組與造冷組、假手術(shù)組中切比較差異有顯著性(P<0.05),冷造冷組與冷造組、對照組高切比較差異有顯著性(P<0.05)。 詳見表3。
2.6 大鼠臟器指數(shù)的比較 術(shù)中取組織即進(jìn)行稱重。冷造冷組大鼠脾臟指數(shù)與造冷組、冷造組、假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05);冷造冷組大鼠胸腺指數(shù)與造冷組、冷造組、假手術(shù)組比較差異有顯著性(P<0.05);冷造冷組、造冷組大鼠的子宮指數(shù)差異無顯著性(P>0.05),冷造冷組與冷造組、假手術(shù)組間子宮指數(shù)差異有顯著性(P<0.05),詳見表4。
EMT是婦科常見疾病之一 。以月經(jīng)失調(diào)、不孕、盆腔包塊、盆腔疼痛為主要臨床癥狀,育齡婦女中的發(fā)病率約為15%。[4]EMT是一種性激素依賴性和自身免疫反應(yīng)性疾病。病證結(jié)合動(dòng)物模型是探究疾病發(fā)生機(jī)制以及篩選有效治療方法的關(guān)鍵途徑和手段, 是深化證候物質(zhì)基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)的方法。由于倫理學(xué)等方面的原因,很難在EMT患者身上觀察EMT發(fā)病的全過程,不能對人類進(jìn)行對照研究,也不能進(jìn)行損傷性研究。因此,建立理想的動(dòng)物模型模擬人類EMT,以便進(jìn)行反復(fù)的、可控的實(shí)驗(yàn),在動(dòng)物身上進(jìn)行病因病理、藥物治療等的研究,才能有助于盡快地攻克疾病。[5]EMT動(dòng)物模型的研究始于上世紀(jì)20年代。中醫(yī)證候模型的研制始于20世紀(jì)60年代,至今已經(jīng)進(jìn)行了大量、多方面的探索,在近半個(gè)世紀(jì)的時(shí)間里,我國科研工作者共研制出了30余類100多種中醫(yī)證候動(dòng)物模型。[6]病證結(jié)合動(dòng)物模型同時(shí)具有西醫(yī)疾病和中醫(yī)證候特征。[7]單純的疾病動(dòng)物模型缺乏中醫(yī)證候在模型中的表達(dá)。[8]劉氏等[9]提出病證結(jié)合動(dòng)物模型,具有客觀性強(qiáng)、可信度高以及更貼近臨床等特點(diǎn),是證候動(dòng)物模型發(fā)展的必然趨勢。陳氏等[10]認(rèn)為病證結(jié)合模型在中醫(yī)臨床與基礎(chǔ)之間架起了橋梁,有助于中藥、方劑作用機(jī)制的研究和滿足新藥開發(fā)的需要。用微觀量化的指標(biāo)去驗(yàn)證模型的證候?qū)傩跃哂锌陀^性、可靠性,并且可以進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測,因此成為了當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。[11]
組別n全血黏度低切(mpa s)全血黏度中切(mpa s)全血黏度高切(mpa s)還原黏度低切還原黏度中切還原黏度高切假手術(shù)組106 18±0 484 50±0 284 06±0 2211 32±1 069 63±0 628 76±0 26冷造冷組1011 41±1 216 29±0 235 28±0 1623 07±2 9112 69±0 569 97±0 38造冷組108 60±0 405 74±0 195 08±0 1417 17±0 5310 64±0 989 88±0 39冷造組107 72±0 515 23±0 364 59±0 2714 31±1 5610 54±0 789 35±0 35F值- 91 21 78 12 71 38 89 30 29 79 25 61P值-<0 05<0 05<0 05<0 05<0 05<0 05
組別n脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)子宮指數(shù)假手術(shù)組101 54±0 091 76±0 051 53±0 16冷造冷組101 15±0 271 51±0 171 11±0 13造冷組101 41±0 131 62+0 141 21±0 20冷造組101 44±0 081 72±0 051 49±0 14F值-10 599 3416 75P值-<0 05<0 05<0 05
通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn),多數(shù)學(xué)者認(rèn)為“瘀血內(nèi)阻沖任、胞宮”為EMT基本病機(jī),然究其成因最終又與陽氣不足,失于溫化、沖任不暢有直接關(guān)系。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“審證求因”的方法論,分析本病患者病程長,“久病及腎”容易導(dǎo)致腎虛;患者多表現(xiàn)為腹部畏寒喜暖、甚至腰以下冰冷,當(dāng)屬虛寒。腎陽不足,虛寒內(nèi)生,陽氣不足血運(yùn)遲滯,寒蘊(yùn)沖任胞宮,惡血凝集,致使沖任氣血失調(diào),離經(jīng)之血凝集而發(fā)病,因此,筆者認(rèn)為“瘀血阻滯沖任、胞宮”是EMT的基本病機(jī),腎虛血瘀是本病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)。[12]陳氏等[13]通過臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示:虛寒證發(fā)病影響最大的危險(xiǎn)因素為房勞多產(chǎn),其余依次是虛寒體質(zhì)、感受寒邪、飲食失宜、情志所傷、過度勞累。因此,感受寒邪是婦科虛寒證發(fā)病的重要因素之一。本課題采用婦科“冒雨涉水,感受寒邪”的病因,依據(jù)“寒邪傷陽”的中醫(yī)理論,運(yùn)用“延長冰箱冷凍加冰水浸泡”結(jié)合“自體移植法”行腎陽虛血瘀證EMT的模型。近年來的研究顯示,EMT患者存在血液黏度流變學(xué)的改變和免疫紊亂。血液黏度流變學(xué)改變及細(xì)胞和體液免疫功能的異常,引起子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、種植、侵襲、新生血管的形成等,最終導(dǎo)致內(nèi)膜組織在腹腔中種植、增生。
目前EMT的病證結(jié)合模型有:肖氏等創(chuàng)建肝郁型EMT大鼠模型。[14]冉氏等[15]采用使孕鼠流產(chǎn)、產(chǎn)褥期受寒、夾尾致痛等因素綜合施加,結(jié)合EMT“自體移植法”疾病造模,建立腎虛血瘀證EMT不孕癥動(dòng)物模型。本課題采用多因素造模的方法,不僅使模型的制備符合中醫(yī)理論,并且使模型的可靠性和穩(wěn)定性更強(qiáng)。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):實(shí)驗(yàn)組大鼠的免疫功能受到影響,觀察大鼠的宏觀表現(xiàn),結(jié)合檢測臟器指數(shù)、激素水平的結(jié)果符合虛寒證的一般癥狀,與臨床報(bào)道相符?!梆觥笔钱a(chǎn)生EMT系列癥狀及體征的主要原因。近年來研究表明:EMT存在不同程度的凝血機(jī)制障礙,血液指標(biāo)的結(jié)果,符合血瘀證,與臨床研究血瘀證患者的血液黏度指標(biāo)會(huì)發(fā)生明顯改變相一致,該模型從宏觀大鼠表現(xiàn)及微觀血液大鼠血液黏度指標(biāo)兩方面均符合腎虛血瘀證EMT。
綜上所述,本研究所采用的“延長冰箱冷凍加冰水浸泡”的方法結(jié)合“自體移植法”創(chuàng)建的模型,成功模擬了虛寒證的病因和致病特點(diǎn),且符合EMT的一般臨床特點(diǎn),通過綜合的評價(jià)方法驗(yàn)證證候的客觀存在,從而為病證結(jié)合動(dòng)物模型建立提供新方法,為中醫(yī)藥治療EMT的研究提供可靠的方法。
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(2017-04-06 收稿)
Establishment and Evaluation of Molding Method for Rats with Endometriosis of Kidney yang Deficiency and Blood Stasis Syndrome
Langfang Health Vocational College
JIAYun-boDUHui-lanYAOYing-yu(Langfang 065001)
Objective: to develop the models with endometriosis (EMT) of kidney yang deficiency and blood stasis syndrome for the study and application of EMT in TCM. Methods: simulating the cause of “wading in the rain and getting the cold evil” in gynecology, EMT models with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome were established on the basis of TCM theory “pathogenic cold impairing yang”, in combination with traditional “autotransplantation” EMT animal model. Three different models were set up according to the time and the sequence of freezing time. Frozen for 1 month, EMT models were made before being frozen for another month for “freezing+molding+freezing” group; frozen for 1 month, EMT models were made for “freezing+molding” group; EMT models were directly made before being frozen for 1 month for “molding+freezing” group; and the sham-operated group was also established. Physical and chemical indexes were used to evaluate the clinical compliance of the models. Results: compared to the other three groups, the models of “freezing+molding+freezing” group could reflect the TCM syndrome characteristics of kidney yang deficiency and blood stasis syndrome, which was consistent with the disease characteristics of EMT. Conclusion: freezing+molding+freezing method is the ideal experimental models for EMT with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome.
kidney yang deficiency and blood stasis syndrome; EMT; rat model; dysmenorrhea; irregular menstruation; infertility; abdominal mass; pathogenic cold impairing yang
*河北省科技廳資助項(xiàng)目:No.132777155;河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目:No.2014027
R271.11+3
A
1007-5615(2017)03-0009-05
△河北中醫(yī)學(xué)院(石家莊 050200)通訊作者:姚穎玉,男,中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院中醫(yī)科。