大口黑鱸對(duì)飼料中酵母硒的耐受性研究

李 寧 鄭銀樺 吳秀峰 王 鑫 薛 敏* 吳立新

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連116023；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京100081)

大口黑鱸對(duì)飼料中酵母硒的耐受性研究

李 寧1,2鄭銀樺2吳秀峰2王 鑫2薛 敏2*吳立新1

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連116023；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，國家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京100081)

本試驗(yàn)旨在通過研究酵母硒對(duì)大口黑鱸生長性能、血漿生化指標(biāo)、組織抗氧化指標(biāo)及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響，評(píng)價(jià)大口黑鱸對(duì)飼料中酵母硒的耐受性。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(Y0)、0.5(Y0.5)、2.5(Y2.5)、5.0 mg/kg(Y5.0)(以硒計(jì))酵母硒，其中0.5 mg/kg是硒的最高推薦劑量，2.5和5.0 mg/kg分別是最高推薦劑量(0.5 mg/kg)的5和10倍?；A(chǔ)飼料本底硒含量為0.76 mg/kg。選用初始體重為(12.99±0.01) g大口黑鱸，隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾，試驗(yàn)期為10周。結(jié)果表明：Y0組增重率和攝食率最低，同時(shí)其飼料系數(shù)也最低，均顯著低于其余各組(P<0.05)。Y0組血漿中堿性磷酸酶活性顯著高于其余各組(P<0.05)。Y0.5組血漿中高密度脂蛋白膽固醇含量顯著高于其余各組(P<0.05)。Y2.5組血漿中尿素氮含量顯著高于其余各組(P<0.05)。Y2.5組、Y5.0組血漿中免疫球蛋白M含量顯著高于Y0組、Y0.5組(P<0.05)。與Y0組相比，酵母硒的添加顯著降低了血漿中丙二醛的含量(P<0.05)，且顯著提高了血漿中谷胱甘肽過氧化物酶的活性(P<0.05)。Y5.0組肝臟硒含量顯著高于Y0組、Y0.5組(P<0.05)，與Y2.5組無顯著差異(P>0.05)。硒日攝入量和肝臟硒含量呈顯著線性相關(guān)(P<0.05)，肝臟硒含量隨硒日攝入量的提高呈線性增加。各組大口黑鱸的肝臟都有不同程度的損傷，但添加0.5 mg/kg酵母硒對(duì)肝臟損傷有緩減作用。由上述結(jié)果可知，飼料中添加0.5 mg/kg酵母硒(總硒含量為1.29 mg/kg)對(duì)大口黑鱸具有一定的脂肪代謝促進(jìn)作用和抗氧化保護(hù)功能，且對(duì)大口黑鱸是安全的。本試驗(yàn)條件下，綜合生長性能、血漿生化指標(biāo)、組織抗氧化指標(biāo)及肝臟組織結(jié)構(gòu)，飼料本底硒含量為0.76 mg/kg時(shí)，大口黑鱸對(duì)飼料中酵母硒的耐受劑量為0.5 mg/kg(以硒計(jì))，即為硒的最高推薦劑量，安全系數(shù)為1。魚粉、磷蝦粉等動(dòng)物蛋白質(zhì)源中含有較高水平的硒元素，因此在高魚粉水產(chǎn)動(dòng)物飼料中補(bǔ)充硒要慎重。

大口黑鱸；酵母硒；耐受性；生長；抗氧化；組織學(xué)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，俗稱加州鱸，隸屬鱸形目(Perciformes)，太陽魚科(Certrarchidae)，黑鱸屬(Micropterus)。自20世紀(jì)80年代從美國加利福尼亞州引入我國后，現(xiàn)已成為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。大口黑鱸是一種廣溫性、肉食性魚類，對(duì)飼料氧化十分敏感[1]。因此，為了防止飼料氧化對(duì)魚體健康產(chǎn)生危害，需要在飼料中添加外源性的抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用大口黑鱸于2015年6月購自佛山市三水白金種苗有限公司。試驗(yàn)正式開始前，試驗(yàn)魚在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間投喂未添加酵母硒的基礎(chǔ)飼料。

1.2 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)依據(jù)農(nóng)業(yè)部《飼料原料和飼料添加劑水產(chǎn)靶動(dòng)物耐受性評(píng)價(jià)試驗(yàn)指南(試行)》設(shè)計(jì)。在大口黑鱸的基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.5、2.5和5.0 mg/kg(以硒計(jì))酵母硒(由法國樂思福公司提供，硒含量為2 g/kg)制成4種試驗(yàn)飼料，依次命名為Y0、Y0.5、Y2.5、Y5.0。其中，0.5 mg/kg為硒的最高推薦劑量(農(nóng)業(yè)部1224公告)，而2.5和5.0 mg/kg分別是它的5和10倍。將試驗(yàn)飼料制成直徑為2 mm的膨化顆粒飼料(大豆磷脂溶解在魚油中在制粒前添加)，自然晾干后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料Y0、Y0.5、Y2.5、Y5.0中硒含量分別為0.76、1.29、3.50、6.35 mg/kg。在正式試驗(yàn)開始后，模擬實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境條件，將飼料存放在室溫下，避光保存。試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

續(xù)表1項(xiàng)目Items飼料DietsY0Y0.5Y2.5Y5.0粗灰分Ash7.497.157.457.46粗脂肪Crudelipid14.3014.7114.7413.95總能Grossenergy/(MJ/kg)20.4020.2020.1020.00硒Selenium/(mg/kg)0.761.293.506.35

1)魚油的過氧化值為1.9 g/kg，丙二醛含量為6.20 mg/kg。The peroxide value and malondialdehyde content in fish oil were 1.9 g/kg and 6.20 mg/kg, respectively.

2)預(yù)混料為每千克飼料提供The premix provided the following per kg of diets:VA 20 mg,VB110 mg,VB215 mg,VB615 mg,VB128 mg，VE 400 mg,VK320 mg,VD310 mg,煙酸胺 niacinaminde 100 mg,維生素C醋酸酯 vitamin C acetate 1 000 mg,肌醇 inositol 200 mg,泛酸鈣 calcium pantothenate 40 mg,生物素 biotin 2 mg,葉酸 folic acid 10 mg,玉米蛋白粉 corn gluten meal 150 mg,CuSO4·5H2O 10 mg,FeSO4·H2O 300 mg,ZnSO4·H2O 220 mg,MnSO4·H2O 25 mg,KIO33 mg,CoCl2·6H2O 5 mg,MgSO44 000 mg,沸石粉 powdered zeolite 4 637 mg。

3)酵母硒按照劑量添加在預(yù)混料中。Selenium yeast was added in premix with gradient.

1.3 試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在國家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地(北京南口)室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體均勻的大口黑鱸[平均體重為(12.99±0.01)g ]，分配到24個(gè)容積為0.26 m3的圓錐形養(yǎng)殖桶中。按照投喂試驗(yàn)飼料的不同，試驗(yàn)魚共分為4個(gè)組，每組6個(gè)養(yǎng)殖桶(重復(fù))，每桶20尾魚。試驗(yàn)期為10周。試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，分別對(duì)各桶魚稱重并取樣。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 生長性能

各指標(biāo)計(jì)算公式如下:

存活率(survival rate,SR,%)=100×Nt/N0；

增重率(weight gain rate,WGR,%)=

100×(Wt-W0+Wd)/W0；

特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=

100×(lnW0-lnWt)/t；

飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)=

C/(Wt-W0+Wd)；

攝食率[feeding rate,FR,%/(kg BW·d)]=

100×C/[(W0+Wt+Wd)/2]/t；

硒日攝入量[daily selenium intake,mg/

(kg BW·d)]=攝食率×B；

式中：N0為初始魚數(shù)量(尾)；Nt為終末魚數(shù)量(尾)；W0為初始魚體總重(g)；Wt為終末魚體總重(g)；Wd為死亡魚體總重(g)；C為攝食量(g)；B為飼料中硒的含量；t為試驗(yàn)天數(shù)。

1.4.2 形體指標(biāo)

每桶隨機(jī)取3尾魚測(cè)量體長、體重、肝臟重、內(nèi)臟重并計(jì)算形體指標(biāo)，計(jì)算公式如下：

肥滿度(condition factor,CF,g/cm3)=

100×平均體重/平均體長3；

肝體比(hepatosomatic index,HSI,%)=

100×肝臟重/體重；

臟體比(viscerasomatic index,VSI,%)=

100×內(nèi)臟重/體重。

1.4.3 化學(xué)分析

飼料中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、水分、粗灰分含量和總能分別采用凱氏定氮法、酸水解全脂肪測(cè)定法、105 ℃常壓干燥法、550 ℃灼燒法和氧彈儀燃燒法測(cè)定；飼料和肝臟組織中硒含量檢測(cè)參考GB/T 13883—2008中方法。

1.4.4 血漿生化指標(biāo)及組織抗氧化指標(biāo)

每桶隨機(jī)取6尾魚，用80 mg/L三氯叔丁醇麻醉后尾靜脈取血，采用氟化鈉-草酸鉀(2%氟化鈉+4%草酸鉀)抗凝，在4 ℃、4 000 r/min的條件下離心10 min，取上層血漿，分裝后保存于-80 ℃的冰箱中，待測(cè)總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、總蛋白(total protein,TPRO)、白蛋白(albumin,ALB)、葡萄糖(glucose,GLU)、尿素氮(urea nitrogen,UN)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)、總膽紅素(total bilirubin,TBILI)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)含量及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)活性，上述指標(biāo)測(cè)定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

每桶再隨機(jī)取4尾魚，取出肝臟、心臟和肌肉后保存于-80 ℃冰箱中，待測(cè)抗氧化指標(biāo)：丙二醛(malonaldehyde,MDA)、總抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、GSH-Px、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)?？寡趸笜?biāo)測(cè)定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.5 組織切片

每桶隨機(jī)取2尾魚，每尾魚取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝臟組織，用0.7%的生理鹽水沖洗后，在4%的多聚甲醛固定液中固定24 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋組織后，用組織切片機(jī)切厚度為7 μm的切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色法染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照(Leica DM2500,Leica,德國)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏多重比較法檢驗(yàn)組間差異的顯著性，P<0.05為差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母硒對(duì)大口黑鱸生長性能及形體指標(biāo)的影響

由表2可知，雖然各酵母硒添加組大口黑鱸的增重率相對(duì)較高，但各組之間終末均重、增重率和特定生長率均無顯著差異(P>0.05)。各酵母硒添加組大口黑鱸的攝食率和飼料系數(shù)均顯著高于Y0組(P<0.05)，其他各組間無顯著差異(P>0.05)。各組大口黑鱸的肥滿度、肝體比和臟體比無顯著差異(P>0.05)，但各酵母硒添加組的肝體比較Y0組有下降趨勢(shì)。

表2 酵母硒對(duì)大口黑鱸生長性能及形體指標(biāo)的影響Table 2 Effects of Se-yeast on growth performance and morphometric parameters of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 酵母硒對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

由表3可知，各組大口黑鱸血漿中LDL-C、TBA、GLU、ALB、TBILI含量，AST、ALT活性以及HDL-C/TC、LDL-C/TC均無顯著差異(P>0.05)。Y0.5組血漿中TG和TC含量顯著高于其余各組(P<0.05)，但均在文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的參考范圍內(nèi)，并且該組血漿中HDL-C含量顯著高于其余各組(P<0.05)。血漿中AKP活性隨酵母硒添加量的增加而降低，除Y2.5組與Y0.5組和Y5.0組差異不顯著(P>0.05)外，其他組間差異顯著(P<0.05)。Y5.0組血漿中TPRO含量顯著高于Y0組(P<0.05)，與Y0.5組、Y2.5組無顯著差異(P>0.05)。Y2.5組血漿中UN含量顯著高于其他各組(P<0.05)，但各組的數(shù)值都在文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道的參考范圍內(nèi)。Y2.5組、Y5.0組血漿中IgM含量顯著高于Y0組、Y0.5組(P<0.05)。

表3 酵母硒對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of Se-yeast on plasma biochemical indices of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

2.3 酵母硒對(duì)大口黑鱸抗氧化功能的影響

2.3.1 酵母硒對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，Y2.5組肝臟中MDA含量顯著高于其余各組(P<0.05)，但總體來看各組MDA含量均低于參考范圍[14-17]，Y0.5組MDA含量與Y0組、Y5.0組無顯著差異(P>0.05)。Y0.5組肝臟中T-AOC及SOD和GST活性與Y2.5組肝臟中T-AOC及SOD、CAT、GST和GSH-Px活性均顯著高于Y0組(P<0.05)，而Y5.0組肝臟中GSH-Px和GST活性則較Y0組顯著降低(P<0.05)。

2.3.2 酵母硒對(duì)大口黑鱸肌肉抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，各組大口黑鱸肌肉中SOD、CAT活性以及MDA含量無顯著差異(P>0.05)。Y2.5組肌肉中T-AOC顯著高于Y5.0組(P<0.05)，與Y0組、Y0.5組無顯著差異(P>0.05)。肌肉組織中未檢出GSH-Px、GST。

2.3.3 酵母硒對(duì)大口黑鱸心臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，各組大口黑鱸心臟中T-AOC以及SOD、CAT、GSH-Px活性與MDA含量均無顯著差異(P>0.05)。心臟組織中未檢出GST。

2.3.4 酵母硒對(duì)大口黑鱸血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由表7可知，各組大口黑鱸血漿中CAT活性無顯著差異(P>0.05)。Y0組血漿中MDA含量顯著高于其他各組(P<0.05)。Y5.0組血漿中T-AOC顯著低于其他各組(P<0.05)，但其SOD活性則顯著高于其他各組(P<0.05)。Y2.5組血漿中GSH-Px、GST活性顯著高于Y0組和Y0.5組(P<0.05)，與Y5.0組無顯著差異(P>0.05)。

表4 酵母硒對(duì)大口黑鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of Se-yeast on antioxidant indices in liver of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

表5 酵母硒對(duì)大口黑鱸肌肉抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of Se-yeast on antioxidant indices in muscle of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

“—”代表未檢測(cè)出。下表同。

“—”indicated not detected. The same as below.

表6 酵母硒對(duì)大口黑鱸心臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of Se-yeast on antioxidant indices in heart of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

2.4 酵母硒對(duì)大口黑鱸硒日攝入量和肝臟硒含量的影響

本試驗(yàn)中考慮本底硒含量(0.76 mg/kg)，用總硒含量計(jì)算硒日攝入量。由表8可知，各組大口黑鱸硒日攝入量無顯著差異(P>0.05)。Y5.0組肝臟硒含量顯著高于Y0組、Y0.5組(P<0.05)，與Y2.5組無顯著差異(P>0.05)。對(duì)硒日攝入量和肝臟硒含量的關(guān)系做線性回歸分析，如圖1所示。由圖1可知，硒日攝入量和肝臟硒含量呈顯著線性相關(guān)(P<0.05)，肝臟硒含量隨硒日攝入量的提高呈線性增加。

表7 酵母硒對(duì)大口黑鱸血漿抗氧化指標(biāo)的影響Table 7 Effects of Se-yeast on antioxidant indices in plasma of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

表8 酵母硒對(duì)大口黑鱸硒日攝入量和肝臟硒含量的影響Table 8 Effects of Se-yeast on daily selenium intake and selenium content in liver of largemouth bass (Micropterus salmoides) (n=6)

圖1 硒日攝入量和肝臟硒含量的關(guān)系Fig.1 Relationship between daily selenium intake and liver selenium content

2.5 大口黑鱸肝臟組織切片

如圖2所示，各組肝臟均出現(xiàn)不同程度的損傷。對(duì)照組(Y0組)觀察了12尾魚，6尾正常，6尾出現(xiàn)肝臟細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞間隙不清，細(xì)胞崩解；Y0.5組觀察了12尾魚，10尾正常，2尾出現(xiàn)細(xì)胞間隙不清，細(xì)胞崩解；Y2.5組觀察了12尾魚，10尾正常，2尾出現(xiàn)肝臟細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞崩解；Y5.0組觀察了12尾魚，4尾正常，8尾出現(xiàn)肝臟細(xì)胞膜消失，細(xì)胞崩解。

3 討 論

3.1 酵母硒對(duì)大口黑鱸生長的影響

本試驗(yàn)中，雖然各組增重率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但未添加酵母硒的Y0組大口黑鱸的增重率、特定生長率和終末均重均最低；飼料中添加0.5、2.5和5.0 mg/kg酵母硒對(duì)大口黑鱸的生長性能稍有改善，但飼料系數(shù)也隨之提高。目前，關(guān)于酵母硒對(duì)動(dòng)物生長性能影響結(jié)果的報(bào)道并不一致。許友卿等[11]報(bào)道，飼料中添加0.77 mg/kg的酵母硒能顯著提高鱤魚的增重率、特定生長率，降低飼料系數(shù)。常仁亮等[18]研究發(fā)現(xiàn)，以10%硒酵母(含硒量0.6 mg/kg)替代魚粉飼喂中國對(duì)蝦后顯著降低飼料系數(shù)。Lin[6]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.8 mg/kg的硒代蛋氨酸顯著提高了石斑魚的增重率。這些關(guān)于硒對(duì)生長性能影響的研究結(jié)果均與本試驗(yàn)有所不同，表明動(dòng)物的種類、發(fā)育階段不同，對(duì)硒的吸收能力及機(jī)體自身的抗氧化能力等方面存在很大差異。有關(guān)于硒日攝入量對(duì)大鼠體內(nèi)蓄積毒性的研究得出，含納米硒、無機(jī)硒及高硒蛋白的3種飼料中硒含量為4和5 mg/kg時(shí)，雌鼠體重顯著下降[19]。在大鼠的飲水中加入一定濃度的亞硒酸鈉進(jìn)行6個(gè)月的試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硒含量為6 mg/kg時(shí)，體重下降，當(dāng)濃度為15 mg/kg時(shí)，體重下降更顯著且影響存活率[20]。本研究中，飼料本底硒含量(0.76 mg/kg)已超出農(nóng)業(yè)部公告中硒元素的最高推薦劑量(0.5mg/kg)。飼料中添加酵母硒對(duì)大口黑鱸生長性能無顯著影響，可能是由于飼料本底硒(0.76 mg/kg)已經(jīng)可以滿足大口黑鱸生長的需求量，雖然有進(jìn)一步提高增重率和特定生長率的趨勢(shì)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。魚粉、磷蝦粉等動(dòng)物蛋白質(zhì)源中含有較高水平的硒元素，因此在高魚粉水產(chǎn)動(dòng)物飼料中補(bǔ)充硒元素要慎重。

A：正常肝細(xì)胞；B：綠色箭頭顯示肝臟細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞崩解。右圖為左圖紅框部位的放大圖。

A: the normal hepatic cells; B: the green arrow showed the cell damage, cell membrane dissolution and cell disruption. Right figure was the enlarged drawing of red frame part in left figure.

圖2 大口黑鱸肝臟組織切片

Fig.2 Hepatic histological slices of largemouth bass (Micropterussalmoides)

3.2 酵母硒對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)檢測(cè)為魚類營養(yǎng)水平、機(jī)體代謝及疾病診斷提供重要信息，是衡量魚類健康狀況的重要參考依據(jù)[21]。TPRO包括ALB和球蛋白(GLB)，其中ALB是由肝臟合成的機(jī)體蛋白質(zhì)來源之一，主要功能是維持血液中膠體滲透壓，用于提供能量和修復(fù)組織[22]。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，飼料中添加酵母硒對(duì)大口黑鱸血漿中ALB含量沒有產(chǎn)生顯著影響，但使TPRO含量顯著增加，TPRO含量反映了機(jī)體蛋白質(zhì)合成與代謝的強(qiáng)弱程度，說明酵母硒對(duì)蛋白質(zhì)的組織沉積有增加作用，有助于組織器官的生長。TC和TG是血液脂肪的組成成分，反映體內(nèi)膽固醇以及飼料中脂類在動(dòng)物體中的吸收與代謝狀況。HDL-C是將各組織中的膽固醇運(yùn)送回肝臟進(jìn)行代謝，血漿中HDL-C含量下降不利于膽固醇的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和清除，將影響肝臟的正常脂肪代謝[23]。飼料中添加2.5、5.0 mg/kg酵母硒時(shí)，大口黑鱸血漿中HDL-C含量低于參考范圍[14-16]，且TC和TG含量在參考范圍[14-16]內(nèi)，說明膽固醇的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和清除可能受到抑制，將導(dǎo)致脂肪代謝受阻。本試驗(yàn)中，0.5 mg/kg酵母硒的添加使血漿中TC和TG含量在參考范圍[14-16]內(nèi)，同時(shí)顯著提高HDL-C的含量，這與在泥鰍[24]、大鼠[25]中得出的結(jié)果相似，說明適量的酵母硒能改善大口黑鱸血液中脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，有利于維持魚體健康。AKP、AST和ALT活性主要反映動(dòng)物肝臟受損程度，正常生理?xiàng)l件下魚體血漿中AKP、AST和ALT活性很低，當(dāng)動(dòng)物肝細(xì)胞受損時(shí)其活性會(huì)顯著升高，升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致[26]。此外，血漿中AKP活性和TBA含量顯著升高是動(dòng)物膽汁淤積癥的主要癥狀，本試驗(yàn)中，各組大口黑鱸血漿中TBA含量沒有顯著差異，但酵母硒的添加顯著降低了大口黑鱸血漿中AKP活性，說明酵母硒對(duì)肝臟的保護(hù)作用也可能和促進(jìn)膽汁酸循環(huán)有關(guān)[27]。血漿IgM是魚體特異性體液免疫應(yīng)答和抵抗力的重要指標(biāo)，且是研究最廣泛的一種免疫球蛋白[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加2.5、5.0 mg/kg酵母硒時(shí)，大口黑鱸血漿中IgM含量達(dá)到最高，硒攝入過量激活大口黑鱸免疫系統(tǒng)，可能引發(fā)炎癥反應(yīng)，說明高劑量酵母硒的添加對(duì)大口黑鱸有一定的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 酵母硒對(duì)大口黑鱸肝臟、肌肉、心臟和血漿抗氧化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著酵母硒添加量的增加，大口黑鱸血漿中GSH-Px、SOD活性升高及MDA含量下降，CAT、GST活性沒有顯著變化。有研究表明，適量硒的添加能提高鯽魚[31]血漿和鱸魚[10]血清中GSH-Px的活性，降低肉雞[33]血漿、大鼠[34]血清中MDA含量，這與本研究結(jié)果一致。SOD能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，對(duì)過氧化和噬菌作用造成的組織損傷起防御保護(hù)作用。本試驗(yàn)中，隨著酵母硒添加量的增加，大口黑鱸血漿中SOD活性逐漸升高，說明機(jī)體清除自由基的能力增強(qiáng)[35]。T-AOC是衡量機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)，研究報(bào)道，硒在較低濃度時(shí)以消除自由基為主，表現(xiàn)為有益的生理效應(yīng)，而在較高濃度下以產(chǎn)生ROS為主，ROS的增加導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成不同器官和組織的細(xì)胞損害[36]，說明產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。飼料中添加5.0 mg/kg酵母硒使大口黑鱸血漿中T-AOC顯著降低，這表明硒的過量添加可能對(duì)大口黑鱸產(chǎn)生了毒害作用。

3.4 酵母硒對(duì)大口黑鱸肝臟組織學(xué)的影響

目前，在集約化養(yǎng)殖模式下，大口黑鱸仍以冰鮮魚為主要食物來源，全程飼喂配合飼料的模式仍在探索中[37]。長期飼喂人工配合飼料的大口黑鱸在生產(chǎn)中的主要病理反應(yīng)即為肝膽損傷，其主要原因與飼料碳水化合物水平、脂質(zhì)氧化等因素有關(guān)[38]。本研究對(duì)各組大口黑鱸的肝臟組織進(jìn)行了病理學(xué)分析，從大口黑鱸的肝臟組織切片可以看出，各組的肝臟均出現(xiàn)了不同程度的損傷，尤其是未添加酵母硒的Y0組和添加最高推薦劑量10倍的Y5.0組，出現(xiàn)較高比例肝臟細(xì)胞膜消失、細(xì)胞間隙不清和細(xì)胞崩解等病變的樣本。Y0.5組和Y2.5組的大口黑鱸肝臟病灶得到相應(yīng)改善，但Y2.5組的大口黑鱸肝臟中MDA含量和血漿中IgM含量達(dá)到最高，硒攝入過量導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和激活免疫系統(tǒng)，可能引發(fā)炎癥反應(yīng)，說明高劑量硒的添加對(duì)大口黑鱸有一定的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)實(shí)施過程模擬大口黑鱸野外飼喂模式，飼料在夏季高溫、高濕、自然光照的環(huán)境下儲(chǔ)存，10周內(nèi)飼料會(huì)發(fā)生一定程度的氧化變質(zhì)，大口黑鱸對(duì)脂質(zhì)氧化較為敏感[39]，長期攝食氧化油脂會(huì)導(dǎo)致組織受損。雖然飼料會(huì)發(fā)生一定程度的氧化變質(zhì)，但本試驗(yàn)所使用的魚油已經(jīng)提前添加200 mg/kg特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)作為抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)TBHQ的評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，200 mg/kg TBHQ對(duì)大口黑鱸飼料中的魚油可以起到很好的保鮮作用[40]。肝臟出現(xiàn)損傷也有可能與飼料中含有相對(duì)較高的碳水化合物有關(guān)。徐祥泰等[38]報(bào)道，飼料中淀粉含量高于10%，即有可能導(dǎo)致大口黑鱸肝臟病變。譚肖英等[41]報(bào)道，大口黑鱸飼料中碳水化合物15%～23%的主要影響大口黑鱸內(nèi)臟器官的相對(duì)質(zhì)量及肝臟的營養(yǎng)成分組成。同時(shí)，過高水平的硒對(duì)魚類也具有一定的肝細(xì)胞毒性[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加0.5 mg/kg的酵母硒(總硒含量為1.29 mg/kg)可有效緩解肝臟組織損傷，但飼料中僅添加酵母硒仍未能完全抵御大口黑鱸因氧化油脂所造成的組織損傷。

4 結(jié) 論

① 飼料中添加0.5 mg/kg酵母硒(總硒含量為1.29 mg/kg)對(duì)大口黑鱸具有一定的脂肪代謝促進(jìn)作用和抗氧化保護(hù)功能，且對(duì)大口黑鱸是安全的。

② 本試驗(yàn)條件下，綜合生長性能、血漿生化指標(biāo)、組織抗氧化指標(biāo)及肝臟組織結(jié)構(gòu)，飼料本底硒含量為0.76 mg/kg時(shí)，大口黑鱸對(duì)飼料中酵母硒的耐受劑量為0.5 mg/kg(以硒計(jì))，即為硒的最高推薦劑量，安全系數(shù)為1。

③ 魚粉、磷蝦粉等動(dòng)物蛋白質(zhì)源中含有較高水平的硒元素，因此在高魚粉水產(chǎn)動(dòng)物飼料中補(bǔ)充硒要慎重。

[1] YUN B,XUE M,WANG J,et al.Effects of lipid sources and lipid peroxidation on feed intake,growth,and tissue fatty acid compositions of largemouth bass (Micropterussalmoides)[J].Aquaculture International,2013,21(1):97-110.

[2] ZENG H W,COMBS G F,Jr.Selenium as an anticancer nutrient:roles in cell proliferation and tumor cell invasion[J].The Journal of Nutritional Biochemistry,2008,19(1):1-7.

[3] K?HRL J,BRIGELIUS-FLOHé R,B?CK A,et al.Selenium in biology:facts and medical perspectives[J].Biological Chemistry,2000,381(9/10):849-864.

[4] KORHOLA M,VAINIO A,EDELMANN K.Selenium yeast[J].Annals of Clinical Research,1986,18(1):65-68.

[5] BROWN K M,PICKARD K,NICOL F,et al.Effects of organic and inorganic selenium supplementation on selenoenzyme activity in blood lymphoctyes,granulocytes,platelets and erythrocytes[J].Clinical Science,2000,98(5):593-599.

[6] LIN Y H.Effects of dietary organic and inorganic selenium on the growth,selenium concentration and meat quality of juvenile grouperEpinephelusmalabaricus[J].Aquaculture,2014,430:114-119.

[7] POSTON H A,COMBS G F,Jr,LEIBOVITZ L.Vitamin E and selenium interrelations in the diet of Atlantic salmon (Salmosalar):gross,histological and biochemical deficiency signs[J].The Journal of Nutrition,1976,106(7):892-904.

[8] GATLIN D M Ⅲ,WILSON R P.Dietary selenium requirement of fingerling channel catfish[J].The Journal of Nutrition,1984,114(3):627-633.

[9] GABER M M.Efficiency of selenium ion inclusion into common carp (CyprinuscarpioL.) diets[J].African Journal of Agricultural Research,2008,4(4):348-353.

[10] 梁萌青,王家林,常青,等.飼料中硒的添加水平對(duì)鱸魚生長性能及相關(guān)酶活性的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2006,13(6):1017-1022.

[11] 許友卿,李太元,丁兆坤,等.添加酵母硒對(duì)鳡魚消化酶活性與飼料轉(zhuǎn)化率的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2013,32(7):391-395.

[12] BELL J G,PIRIE B J,ADRON J W,et al.Some effects of selenium deficiency on glutathione peroxidase (EC 1.11.1.9) activity and tissue pathology in rainbow trout (Salmogairdneri)[J].British Journal of Nutrition,1986,55(2):305-311.

[13] HAMILTON S J,HOLLEY K M,BUHL K J,et al.Toxicity of selenium and other elements in food organisms to razorback sucker larvae[J].Aquatic Toxicology,2002,59(3/4):253-281.

[14] 于利莉,薛敏,王嘉,等.大口黑鱸對(duì)飼料中丁基羥基茴香醚的耐受性評(píng)價(jià)[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28(3):747-758.

[15] 袁瑞敏,劉永堅(jiān),王貴平,等.氧化魚油飼料中添加維生素C對(duì)大口黑鱸幼魚生長及抗氧化能力的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,43(1):136-144.

[16] 張露露.膽汁酸在大口黑鱸飼料中有效性及耐受性評(píng)價(jià)[D].碩士學(xué)位論文.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2015:23-28.

[17] 劉金桃,艾立川,王嘉,等.大口黑鱸對(duì)飼料中乙氧基喹啉的耐受性評(píng)價(jià)[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(4):1152-1162.

[18] 常仁亮,韓保平,顧潤潤.硒酵母的培養(yǎng)及其養(yǎng)蝦效果[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2000,24(5):458-462.

[19] JIA X,LI N,CHEN J.A subchronic toxicity study of elemental Nano-Se in Sprague-Dawley rats[J].Life Sciences,2005,76(17):1989-2003.

[20] CRESPO A M,NEVE J,PINTO R E.Plasma and liver selenium levels in the rat during supplementation with 0.5,2,6,and 15 ppm selenium in drinking water[J].Biological Trace Element Research,1993,38(2):139-147.

[21] SILVEIRA-COFFIGNY R,PRIETO-TRUJILLO A,ASCENCIO-VALLE F.Effects of different stressors in haematological variables in culturedOreochromisaureusS.[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacology,2004,139(4):245-250.

[22] AHMED A F,CONSTABLE P D,MISK N A.Effect of feeding frequency and route of administration on abomasal luminal pH in dairy calves fed milk replacer[J].Journal of Dairy Science,2002,85(6):1502-1508.

[23] 石桂城,董曉惠,陳剛,等.飼料脂肪水平對(duì)吉富羅非魚生長性能及其在低溫應(yīng)激下血清生化指標(biāo)和肝臟脂肪酸組成的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2012,24(11):2154-2164.

[24] HAO X F,LING Q F,HONG F S.Effects of dietary selenium on the pathological changes and oxidative stress in loach (Paramisgurnusdabryanus)[J].Fish Physiology and Biochemistry,2014,40(5):1313-1323.

[25] 馮潤荷,王鵬華.不同劑量有機(jī)硒對(duì)大鼠血脂代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,15(4):729-730.

[26] NYBLOM H,BERGGREN U,BALLDIN J,et al.High AST/ALT ratio may indicate advanced alcoholic liver disease rather than heavy drinking[J].Alcohol and Alcoholism,2004,39(4):336-339.

[27] CHIANG J Y L.Bile acid metabolism and signaling[J].Comprehensive Physiology,2013,3(3):1191-1212.

[28] ESTENSORO I,CALDUCH-GINER J A,KAUSHIK S,et al.Modulation of the IgM gene expression and IgM immunoreactive cell distribution by the nutritional background in gilthead sea bream (Sparusaurata) challenged withEnteromyxumleei(Myxozoa)[J].Fish & Shellfish Immunology,2012,33(2):401-410.

[29] ATENCIO L,MORENO I,JOS,et al.Effects of dietary selenium on the oxidative stress and pathological changes in tilapia (Oreochromisniloticus) exposed to a microcystin-producing cyanobacterial water bloom[J].Toxicon,2009,53(2):269-282.

[30] DAVID M,MUNASWAMY V,HALAPPA R,et al.Impact of sodium cyanide on catalase activity in the freshwater exotic carp,Cyprinuscarpio(Linnaeus)[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2008,92(1):15-18.

[31] ZHOU X X,WANG Y B,GU Q,et al.Effects of different dietary selenium sources (selenium nanoparticle and selenomethionine) on growth performance,muscle composition and glutathione peroxidase enzyme activity of crucian carp (Carassiusauratusgibelio)[J].Aquaculture,2009,291(1/2):78-81.

[32] SURAI P F.Effect of selenium and vitamin E content of the maternal diet on the antioxidant system of the yolk and the developing chick[J].British Poultry Science,2000,41(2):235-243.

[33] MOORE M A,WANDER R C,XIA Y M,et al.Selenium supplementation of Chinese women with habitually low selenium intake increases plasma selenium,plasma glutathione peroxidase activity,and milk selenium,but not milk glutathione peroxidase activity[J].The Journal of Nutritional Biochemistry,2000,11(6):341-347.

[34] 李鋒,李宣海,程五鳳,等.補(bǔ)充VE、Se對(duì)大鼠肝纖維化和抗氧化功能影響的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào),2003,25(1):60-64.

[36] MéNDEZ-ARMENTA M,NAVA-RUIZ C,FERNNDEZ-VALVERDE F,et al.Histochemical changes in muscle of rats exposed subchronically to low doses of heavy metals[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2011,32(1):107-112.

[37] 吳銳全,黃樟翰,盧邁新.大口黑鱸營養(yǎng)研究及配合飼料發(fā)展前景[J].廣東飼料,2004,13(2):38-39.

[38] 徐祥泰,陳乃松,劉子科,等.飼料中不同淀粉源及水平對(duì)大口黑鱸肝臟組織學(xué)的影響[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2016,25(1):61-70.

[39] YUAN Y,CHEN Y J,LIU Y J,et al.Dietary high level of vitamin premix can eliminate oxidized fish oil-induced oxidative damage and loss of reducing capacity in juvenile largemouth bass (Micropterussalmoides)[J].Aquaculture Nutrition,2014,20(2):109-117.

[40] 劉金桃.大口黑鱸(Micropterussalmoides)對(duì)乙氧基喹啉和特丁基對(duì)苯二酚的耐受性研究[D].碩士學(xué)位論文.青島:中國海洋大學(xué),2015:33-39.

[41] 譚肖英,劉永堅(jiān),田麗霞,等.飼料中碳水化合物水平對(duì)大口黑鱸Micropterussalmoides生長、魚體營養(yǎng)成分組成的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,44(增刊1):258-263.

*Corresponding author, professor, E-mail： xuemin@cass.cn

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Tolerance of Selenium-Yeast in Diets of Largemouth Bass(Micropterussalmoides)

LI Ning1,2ZHENG Yinhua2WU Xiufeng2WANG Xin2XUE Min2*WU Lixin1

(1.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116023,China; 2.NationalAquafeedSafetyAssessmentStation,FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China)

A 10-week growth trail was conducted to evaluate the tolerance of selenium (Se)-yeast in diets of largemouth bass (Micropterussalmoides) by studying the effects of Se-yeast on growth performance, plasma biochemical indices, tissue antioxidant indices and hepatic histology of largemouth bass. Four experimental diets were prepared with Se-yeast supplemental levels at 0 (Y0), 0.5 (Y0.5), 2.5 (Y2.5) and 5.0 mg/kg (calculated in Se) (Y5.0) based on a basal diet, in which 0.5 mg/kg was designed as the maximum recommended level, and the 2.5 and 5.0 mg/kg were 5 and 10 folds of the maximum recommended level, respectively. The background Se content in the basal diet was 0.76 mg/kg. Each diet was fed to 6 replicates with 20 largemouth bass with the initial body weight of (12.99±0.01) g. The results showed as follows: fish in Y0 group showed the lowest weight gain rate, feeding rate and feed conversion ratio, which were significantly lower than those of fish in other groups (P<0.05). Plasma alkaline phosphatase (AKP) activity in Y0 group was significantly higher than that in other groups (P<0.05). The content of plasma low density lipoprotein cholesterol (HDL-C) in Y0.5 group was significantly higher than that in other groups (P<0.05). The content of plasma urea nitrogen (UN) in Y2.5 group was significantly higher than that in other groups (P<0.05). Plasma immunoglobulin M (IgM) content in Y2.5 and Y5.0 groups was significantly higher than that in Y0 and Y0.5 groups (P<0.05). Compared with Y0 group, plasma malondialdehyde (MDA) content was significantly decreased (P<0.05), and plasma glutathione peroxidase (GSH-Px) activity was significantly increased by Se-yeast supplementation (P<0.05). Liver selenium content in Y5.0 group was significantly higher than that in Y0 and Y0.5 groups (P<0.05), but had no significant difference compared with Y2.5 group (P>0.05). Daily selenium intake had a significant linear correlation with liver selenium content (P<0.05), and the liver selenium content showed a linear increase with the daily selenium intake increasing. Different degrees of liver histological damage were observed in all groups, and fish fed diets with 0.5 mg/kg Se-yeast relieved the symptom. The present study shows that the diet with 0.5 mg/kg Se-yeast (total Se content is 1.29 mg/kg) can enhance the lipid metabolism and antioxidant response of largemouth bass, and it is safe for largemouth bass. Growth performance, plasma biochemical indices, tissue antioxidant indices and hepatic histology are considered synthetically, the tolerance dose of Se-yeast in diet with 0.76 mg/kg background Se for largemouth bass is 0.5 mg/kg (calculated in Se), that is the maximum recommended level of Se, and the safety margin is 1. Animal protein sources such as fish meal and krill meal contain high level of Se element, which need to be cautiously considered when exogenic Se sources are used in high fish meal diets for aquatic animals.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(6)：1649-1960]

largemouth bass (Micropterussalmoides); Se-yeast; tolerance; growth; antioxidant; histology

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.06.016

2016-12-07

國家自然科學(xué)基金(31372539，31572631)；北京市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(SCGWZJ 20171103-1)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014CB138600)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFF0201800)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(1610382016010)

李 寧(1990—)，女，黑龍江綏化人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。E-mail: liningmanian1990@163.com

*通信作者:薛 敏，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail: xuemin@cass.cn

S963

A

1006-267X(2017)06-1949-12