地榆、地榆炭對(duì)小鼠止血作用影響的實(shí)驗(yàn)研究※

張向陽(yáng) 趙如同 劉春燕 張文立 田河林

(河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，河北 邯鄲 056002)

地榆、地榆炭對(duì)小鼠止血作用影響的實(shí)驗(yàn)研究※

張向陽(yáng) 趙如同 劉春燕 張文立 田河林

(河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，河北 邯鄲 056002)

目的 探討地榆及地榆炭止血作用機(jī)制。方法 將240只昆明種小鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組60只，雌雄各半，各組再隨機(jī)分為空白組、云南白藥組、地榆大劑量組、地榆小劑量組、地榆炭大劑量組、地榆炭小劑量組，每組10只，比較地榆炭和地榆對(duì)小鼠凝血時(shí)間、出血時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)及活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的影響。結(jié)果 云南白藥組、地榆大劑量組、地榆小劑量組、地榆炭大劑量組小鼠出血時(shí)間較空白組均縮短(P<0.01，P<0.05)。地榆炭小劑量組出血時(shí)間與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組與地榆炭大劑量組出血時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，地榆小劑量組與地榆炭小劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。云南白藥組、地榆大劑量組、地榆炭大劑量組小鼠凝血時(shí)間較空白組均縮短(P<0.01)。地榆小劑量組、地榆炭小劑量組凝血時(shí)間與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組與地榆炭大劑量組凝血時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，地榆小劑量組與地榆炭小劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組、地榆小劑量組、地榆炭大劑量組小鼠血小板計(jì)數(shù)較空白組均升高(P<0.01，P<0.05)。云南白藥組、地榆炭小劑量組血小板計(jì)數(shù)與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組血小板計(jì)數(shù)高于地榆炭大劑量組(P<0.01)；地榆小劑量組血小板計(jì)數(shù)高于地榆炭小劑量組(P<0.05)。云南白藥組、地榆大劑量組、地榆炭大劑量組小鼠PT、TT及APTT較空白組均縮短(P<0.05，P<0.01)。地榆小劑量組、地榆炭小劑量組PT、TT及APTT與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組與地榆炭大劑量組PT、TT及APTT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，地榆小劑量組與地榆炭小劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 地榆和地榆炭的止血機(jī)制存在差異，但炒炭與否對(duì)止血作用沒有顯著影響。

地榆；止血；動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)

地榆為薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.或長(zhǎng)葉地榆SanguisorbaofficinalisL. var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，其性微寒，味苦、澀、酸，歸肝、大腸經(jīng)，具有解毒斂瘡、涼血止血的作用[1]。中藥炭化的目的為緩和藥物藥性，降低藥物毒性，增強(qiáng)或產(chǎn)生收斂、止瀉、止血作用[2]，有些中藥炒炭后止血作用明顯增強(qiáng)，也有些中藥炒炭后止血作用反而減弱。地榆和地榆炭止血機(jī)制未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)地榆和地榆炭的止血機(jī)制研究，為地榆、地榆炭的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品 地榆和地榆炭藥材購(gòu)自北京同仁堂藥店，經(jīng)河北省邯鄲市藥品檢驗(yàn)所專家鑒定為薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.的干燥根。按照水煎劑的制備方法[3]，將地榆和地榆炭制備成1 g/mL的水煎液。云南白藥(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020798，批號(hào)ZFA1316)。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠240只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g，許可證編號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003，動(dòng)物合格證編號(hào)：1303141，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 分組及給藥 將240只昆明種小鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組60只，雌雄各半，各實(shí)驗(yàn)組再隨機(jī)分為6組，分別為空白組、云南白藥組、地榆大劑量組、地榆小劑量組、地榆炭大劑量組、地榆炭小劑量組，每組10只，雌雄各半。給藥：云南白藥組0.667 g/kg，地榆大劑量組8.000 g/kg，地榆小劑量組2.000 g/kg，地榆炭大劑量組8.000 g/kg，地榆炭小劑量組2.000 g/kg，每日灌胃1次，連續(xù)3 d。

1.4 儀器 START-4半自動(dòng)血凝儀(法國(guó)倍肯公司)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司)；202-3型電熱恒溫干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；B203LED型生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 出血時(shí)間 實(shí)驗(yàn)1組第3次給藥1 h后，每只小鼠在距尾尖3 mm處將其剪斷，自斷尾處有血液溢出開始計(jì)時(shí)，每間隔30 s用濾紙輕輕吸去血滴，在斷尾處吸不到血時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為小鼠出血時(shí)間。

1.5.2 凝血時(shí)間 實(shí)驗(yàn)2組第3次給藥1 h后摘小鼠左側(cè)眼球，舍棄第1滴血液，迅速在潔凈載玻片滴約直徑8 mm左右的血滴，立即計(jì)時(shí)，每間隔30 s從血滴邊緣用大頭針向中間輕挑1次，能挑起絲狀纖維蛋白時(shí)終止計(jì)時(shí)，即為凝血時(shí)間。

1.5.3 血小板計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)3組第3次給藥1 h后從小鼠內(nèi)眥球后靜脈叢吸血20 μL,放入380 μL血小板稀釋液中，立即混勻，然后取懸液1滴加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡40倍數(shù)下對(duì)小鼠血小板計(jì)數(shù)。

1.5.4 小鼠凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT) 實(shí)驗(yàn)4組第3次給藥1 h后，用眼科鑷摘除小鼠眼球，舍去第1滴血液，在含3.8%枸櫞酸鈉0.1 mL的eppendorf管中加入0.9 mL血，混勻后離心，3 000 r/min，15 min，取上層血漿，在2 h內(nèi)測(cè)定PT、TT、APTT。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠出血時(shí)間比較 見表1。

表1 各組小鼠出血時(shí)間比較 ±s

與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01

由表1可見，云南白藥組、地榆大劑量組、地榆小劑量組、地榆炭大劑量組小鼠出血時(shí)間較空白組均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。地榆炭小劑量組出血時(shí)間與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組與地榆炭大劑量組出血時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，地榆小劑量組與地榆炭小劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組小鼠凝血時(shí)間比較 見表2。

表2 各組小鼠凝血時(shí)間比較 ±s

與空白組相比，**P<0.01

由表2可見，云南白藥組、地榆大劑量組、地榆炭大劑量組小鼠凝血時(shí)間較空白組均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。地榆小劑量組、地榆炭小劑量組凝血時(shí)間與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組與地榆炭大劑量組凝血時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，地榆小劑量組與地榆炭小劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠血小板計(jì)數(shù)比較 見表3。

表3 各組小鼠血小板計(jì)數(shù)比較

組 別n血小板計(jì)數(shù)空白組10657.40±108.29云南白藥組10754.70±120.12地榆大劑量組10972.10±186.44**△△地榆小劑量組10797.70±126.89*#地榆炭大劑量組10787.40±89.54*地榆炭小劑量組10663.10±94.58

與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01；與地榆炭大劑量組比較，△△P<0.01;與地榆炭小劑量組比較，#P<0.05

由表3可見，地榆大劑量組、地榆小劑量組、地榆炭大劑量組小鼠血小板計(jì)數(shù)較空白組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。云南白藥組、地榆炭小劑量組血小板計(jì)數(shù)與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑組血小板計(jì)數(shù)高于地榆炭大劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；地榆小劑量組血小板計(jì)數(shù)高于地榆炭小劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組小鼠PT、TT及APTT比較 見表4。

由表4可見，云南白藥組、地榆大劑量組、地榆炭大劑量組小鼠PT、TT及APTT較空白組均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。地榆小劑量組、地榆炭小劑量組PT、TT及APTT與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。地榆大劑量組與地榆炭大劑量組PT、TT及APTT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，地榆小劑量組與地榆炭小劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組小鼠PT、TT及APTT比較

組 別nPTTTAPTT空白組1018.48±1.5136.71±4.0527.33±1.53云南白藥組1017.03±1.45*29.40±2.36**24.58±1.78**地榆大劑量組1017.20±1.16*32.11±3.19**25.44±1.18**地榆小劑量組1017.81±1.3334.29±3.9426.50±1.66地榆炭大劑量組1017.15±1.41*33.41±2.82*25.66±1.45*地榆炭小劑量組1017.92±1.6434.91±3.2926.81±1.89

與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

正常凝血和止血機(jī)制包括血小板、凝血因子和血管壁三方面的作用，凝血因子止血作用又分為內(nèi)源性、外源性和共同途徑3條途徑[4]。PT能反映出外源性凝血系統(tǒng)活性，其時(shí)間長(zhǎng)短與外源性凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的活性相關(guān)；TT反映出纖維蛋白原的利用度；APTT反映出內(nèi)源性凝血系統(tǒng)中凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ等因子的活性[5]。

地榆根部鞣質(zhì)類化合物的含量約17%[6]，鞣質(zhì)具有降低毛細(xì)血管通透性，收縮微血管的作用[7]，鞣質(zhì)還能與蛋白質(zhì)結(jié)合在血管破損處形成硬塊，血液外流受阻而達(dá)到止血目的。地榆中鞣質(zhì)的單體沒食子酸及d-兒茶素，能增強(qiáng)血小板的聚集和黏附功能，沒食子酸單體還能增高Az-巨球蛋白含量，競(jìng)爭(zhēng)性抑制纖溶酶原活化素及纖溶酶的活力，導(dǎo)致纖溶活力的降低，從而起到止血作用[8]。地榆中還含有總皂苷，具有促骨髓細(xì)胞增殖作用，對(duì)血小板數(shù)量、外周血白細(xì)胞和紅細(xì)胞有明顯的改善作用[9]?？梢?，地榆通過凝血因子、血小板及血管壁三方面因素的作用，最終達(dá)到止血效果。

地榆中大量的鈣以草酸鈣晶體的形式存在，通過制炭過程的高溫可釋放出可溶性鈣離子。鈣離子為凝血因子，對(duì)血小板、內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)有激活作用，轉(zhuǎn)化纖維素蛋白原為纖維蛋白，起到促進(jìn)凝血、止血的作用[10]。地榆炒炭過程中會(huì)產(chǎn)生大量炭素，血液遇炭素后可釋放一種使平滑肌緊張性加強(qiáng)的物質(zhì)，能促進(jìn)血管收縮而止血，同時(shí)炭素可以促進(jìn)釋放血小板因子、血漿凝血因子激活及血小板裂解，促進(jìn)血液凝固[11]；但同時(shí)，地榆炒炭過程中，由于時(shí)間和溫度參數(shù)不易控制，導(dǎo)致部分地榆發(fā)生灰化，致使地榆中總皂苷、鞣質(zhì)等止血成分減少，減弱止血作用[12]。另外，地榆炭與地榆相比，由于制炭過程發(fā)生的化學(xué)、物理變化，地榆炭中的鐵、鋁、錳、鋅、銅等19種微量元素含量均高于地榆[13]，而以上這些微量元素都是血液中不可或缺的物質(zhì)，它們或通過影響血液成分，或間接作用于凝血因子，或參與激素和酶的活動(dòng)，從而對(duì)全身性和局部性的凝血、出血過程產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果表明，地榆和地榆炭均能縮短小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；地榆和地榆炭均能升高小鼠血小板，地榆作用更強(qiáng)；與空白組相比，地榆和地榆炭能縮短小鼠PT、TT和APTT，二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，地榆炒炭后，成分發(fā)生變化，導(dǎo)致地榆和地榆炭的止血機(jī)制存在差異，但從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，二者的止血作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于止血作用是多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，而中藥成分復(fù)雜，影響因素比較多，對(duì)于地榆制炭后止血作用機(jī)制的變化還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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(本文編輯：李珊珊)

Experimental study on hemostatic function of Radix Sanguisorbae and Charred Radix Sanguisorbae in mice

ZHANGXiangyang,ZHAORutong,LIUChunyan,etal.

DepartmentofBiochemistryandofMolecularBiologyLaboratory,MedicalcollegeofHebeiUniversityofEngineering,Hebei,HanDan056002

Objective To explore the hemostasis mechanisms of Radix Sanguisorbae and charred Radix Sanguisorbae. Methods 240 Kunming mice were randomly divided into 4 groups, 60 mice in each group with half males and half females. The rats in each group were randomly divided into blank group, Yunnanbaiyao group, high dose of Radix Sanguisorbae group, low dose of Radix Sanguisorbae group, high dose of charred Radix Sanguisorbae group, low dose of charred Radix Sanguisorbae group, 10 mice in each group. The effects of clotting time, bleeding time, platelets count, thrombin time (TT), prothrombin time (PT) and activated partialthromboplastin time (APTT) were compared between the Radix Sanguisorbae and charred Radix Sanguisorbae in mice. Results The bleeding time in Yunnanbaiyao group, high dose of Radix Sanguisorbae group, low dose of Radix Sanguisorbae group and high dose of charred Radix Sanguisorbae group were shorter than those in blank group (P<0.01,P<0.05). There was no statistical difference on bleeding time between low dose of Radix Sanguisorbae group and blank group (P>0.05), high dose of Radix Sanguisorbaeand high dose of charred Radix Sanguisorbae group(P>0.05), low dose of Radix Sanguisorbae group and low dose of charred Radix Sanguisorbae group(P>0.05). The clotting time in Yunnanbaiyao group, high dose of Radix Sanguisorbae group and high dose of charred Radix Sanguisorbae group was shorter than that in blank group (P<0.01). There was no statistical difference on clotting time among low dose of charred Radix Sanguisorbae group, low dose of charred Radix Sanguisorbae group and blank group (P<0.05). There was no statistical difference on clotting time between high dose of Radix Sanguisorbae high and dose of charred Radix Sanguisorbae group(P>0.05), low dose of Radix Sanguisorbae group and low dose of charred Radix Sanguisorbae group(P>0.05). The platelets count in high dose of Radix Sanguisorbae group, low dose of Radix Sanguisorbae group and high dose of charred Radix Sanguisorbae group was higher than that in blank group (P<0.01,P<0.05). There was no statistical difference on platelets count among Yunnanbaiyao group, low dose of charred Radix Sanguisorbae group and blank group (P>0.05). The platelets count in high dose of Radix Sanguisorbae was higher than that in high dose of charred Radix Sanguisorbae group (P<0.01), and which in low dose of charred Radix Sanguisorbae group was higher than that in low dose of charred Radix Sanguisorbae group (P<0.05). The PT, TT and APTT in Yunnanbaiyao group, high dose of Radix Sanguisorbae group and high dose of charred Radix Sanguisorbae group were shorter than that in blank group (P<0.05,P<0.01). There was no statistical difference on PT, TT and APTT among low dose of Radix Sanguisorbae group, low dose of charred Radix Sanguisorbae group and blank group (P>0.05). There was no statistical difference on PT, TT and APTT between high dose of Radix Sanguisorbae group and high dose of charred Radix Sanguisorbae group(P>0.05), low dose of Radix Sanguisorbae group and low dose of charred Radix Sanguisorbae group(P>0.05). Conclusion Radix Sanguisorbae and charred Radix Sanguisorbae have different hemostasis mechanisms, but frying charcoal or not have no significant effect on the hemostasis function.

Radix Sanguisorbae; Hemostasis; Animal; Experiment

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.05.023

※ 項(xiàng)目來源：河北省邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(編號(hào)：1523108076-8)

張向陽(yáng)(1970—)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士。主要從事基礎(chǔ)中醫(yī)藥學(xué)方面的研究。

R973.1

A

1002-2619(2017)05-0735-04

2016-11-23)