厄貝沙坦對大鼠梗死心肌組織中HGFmRNA和蛋白水平的影響*

于俊民， 張小波， 李大鶴， 王慧冬

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院老年病科一病房，黑龍江 哈爾濱 150001)

厄貝沙坦對大鼠梗死心肌組織中HGFmRNA和蛋白水平的影響*

于俊民△， 張小波， 李大鶴， 王慧冬

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院老年病科一病房，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的： 通過觀察厄貝沙坦對大鼠心肌梗死模型中缺血心肌肝細胞生長因子(HGF) mRNA和蛋白水平的影響，探討厄貝沙坦減輕心肌纖維化的可能機制。方法: 采用雄性Wistar大鼠建立心肌梗死模型，術(shù)后24 h將存活大鼠隨機分為模型組和厄貝沙坦組，另設(shè)假手術(shù)組，每組9只大鼠。厄貝沙坦組予以厄貝沙坦50 mg·kg-1·d-1灌胃，模型組及假手術(shù)組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次。4周后心臟取材，測量各組大鼠體重及左室重量，HE染色法觀察缺血心肌病理改變，RT-qPCR和Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中HGF mRNA及蛋白水平的表達。結(jié)果: HE染色可見假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，模型組及厄貝沙坦組心肌結(jié)構(gòu)紊亂，藥物組病理改變較模型組減輕； 4周后各組大鼠體重?zé)o顯著差異，各組間左心室重量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，厄貝沙坦組及模型組左室重量高于假手術(shù)組(P<0.05)，同時厄貝沙坦組低于模型組(P<0.05)；各組大鼠心肌組織中均檢測到HGF的mRNA及蛋白水平，厄貝沙坦組及模型組HGF的mRNA與蛋白含量均高于假手術(shù)組(P<0.05)，厄貝沙坦組HGF的mRNA與蛋白水平低于模型組(P<0.05)。結(jié)論: 心肌梗死模型大鼠應(yīng)用厄貝沙坦治療4周時左室重量明顯減輕，心肌組織病理變化得到改善，心肌組織中HGF的mRNA與蛋白水平降低。

HGF； 厄貝沙坦； 心肌梗死

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)通路是影響心肌纖維化、細胞凋亡及心室重構(gòu)關(guān)鍵的信號通路之一[1]。HGF 是一種心肌營養(yǎng)因子，在心肌梗死后心肌修復(fù)中起著至關(guān)重要作用。已證明在心肌缺血條件下，HGF 可提高心肌細胞的存活率[2]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重塑是遠期發(fā)生心臟性死亡最重要的危險因素之一，因此心室重塑的臨床治療非常重要[3]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶受體拮抗劑可改善心肌纖維化及心室重構(gòu)，而其對心肌梗死后 HGF 通路的影響報道較少。實驗通過應(yīng)用厄貝沙坦治療心肌梗死大鼠4周，觀察大鼠梗死心肌 HGF mRNA及蛋白表達變化，為厄貝沙坦的心肌保護作用及改善心室重構(gòu)尋找新的理論基礎(chǔ)及證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與材料

Wistar大鼠(長春億思實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供)。小動物呼吸機(哈佛大學(xué)制造，55-705B型)；病理切片機(Leica 2135)；圖像采集系統(tǒng)(Moticam 3000)；實時PCR儀(ABI 7500)；超速低溫離心機(Thermo)；電子天平(Sartorius)；電泳儀(Bio-Rad)?？笻GF抗體(Abcam)；抗GAPDH抗體(CST)；HGF及GAPDH引物(TaKaRa)；RT試劑盒(Promega)；裂解液Trizol reagent(Invitrogen)；HRP標記的 II 抗(碧云天)；RIPA組織細胞快速裂解液(Solarbio)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；NC膜(Millipore)；厄貝沙坦(商品名：安博維；德國賽諾菲制藥公司)。

2 方法

2.1 心肌梗死模型的制備 選擇雄性Wistar大鼠(體重200～300 g)，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，氣管插管后用小動物呼吸機有氧正壓通氣。于左側(cè)胸腔第4肋間逐層開胸，開放心包后擠壓右側(cè)胸腔使心臟暴露于胸腔外，用絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支后，將心臟放回正常位置，并逐層縫合胸腔[4]。恢復(fù)自主呼吸后拔管，保溫待其清醒。假手術(shù)組，采用相同的方法開胸、穿線，僅在冠狀動脈下留置絲線，不結(jié)扎，余與制模組相同。

2.2 實驗分組 選擇建模后24 h存活大鼠隨機分為厄貝沙坦組(irbesartan組)及模型組，另設(shè)假手術(shù)組(sham組)。厄貝沙坦組給予藥物50 mg·kg-1·d-1，連續(xù)4周，模型組及假手術(shù)組予以等體積生理鹽水灌胃，每天1次， 4周后處死。

2.3 大鼠左心室重量的測定 實驗終點大鼠稱重后，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔麻醉，心腔內(nèi)注射10%氯化鉀使心臟停跳于舒張期，取出心臟，去除心房、大血管及心臟外結(jié)締組織等，磷酸鹽緩沖液沖洗，濾紙吸干后稱取左心室重量。沿心臟長軸將左心室分為兩部分，靠近心尖一側(cè)心肌制作病理切片，用于形態(tài)學(xué)檢測；余下部分組織置于-80 ℃液氮中保存。

2.4 梗死大鼠心肌病理改變的觀察 切片脫蠟，二甲苯透明，HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封固，光鏡觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5 RT-qPCR檢測缺血心肌組織HGF的mRNA表達 將各組大鼠心肌組織100 mg轉(zhuǎn)移至5 mL玻璃試管中，每管加入1 mL預(yù)冷的Trizol提取液，依次勻漿、離心，按照Trizol試劑盒操作步驟進行RNA提??；將經(jīng)過稀釋后的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4 μL、oligo(dT)0.5 μL、dNTPs 0.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μL、DEPC處理水 10 μL、RNA模板 4 μL至20 μL，37 ℃孵育1 h，95 ℃孵育5 min，滅活MMLV；將制備好的cDNA進行qPCR擴增。數(shù)據(jù)采用儀器自帶ABI Prism 7300 SDS Software分析。實時定量PCR的數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔΔCt方法計算。HGF的上游引物序列為5’-CAGAGGTACGCTACGAAGTCTGTGA-3’，下游引物序列為5’-CATGTCTTGCCTGATTCTGTGTGA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。

2.6 Western blot法檢測心肌組織HGF的蛋白水平 將新鮮組織剪成細小的碎片，按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清，進行蛋白質(zhì)定量，采用半干式轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜，甲醇活化后用TBST洗后進行封閉。封閉后進行 I 抗孵育，根據(jù)說明書HGF 1∶2 000稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2 h。孵育I 抗的膜用TBST洗滌5 min×3次。隨后根據(jù)用量，按照1∶1 000稀釋HRP標記的 II 抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌5 min×3次。最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測顯色條帶強弱。以目的蛋白條帶的強度與內(nèi)參照蛋白強度的比值代表目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 心肌的病理改變觀察

光鏡下觀察HE染色后缺血心肌組織，可見假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，模型組及厄貝沙坦組心肌結(jié)構(gòu)排列紊亂，心肌細胞斷裂，核溶解，可見炎性細胞。梗死區(qū)與非梗死區(qū)邊界清楚。厄貝沙坦組大鼠缺血心肌組織病理變化較模型組明顯減輕,見圖1。

Figure 1.The histomorphological observation of the rat myocardial tissue with HE staining (×400).

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色

2 大鼠左心室重量的改變

各組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，左心室重量各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，厄貝沙坦組及模型組的左室重量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且厄貝沙坦組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠體重、左心室重量和HGF的表達情況

*P<0.05vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vssham group.

3 大鼠心肌組織HGF的mRNA及蛋白表達

大鼠心肌組織中均可檢測到HGF的mRNA及蛋白水平，厄貝沙坦組及模型組的HGF mRNA與蛋白含量均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，厄貝沙坦組HGF的mRNA與蛋白水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

Figure 2.The image of Western blot for determining the protein expression of HGF in ischemic myocardium of the rats.

圖2 大鼠缺血心肌HGF蛋白表達

討 論

心肌梗死后，壞死心肌細胞不能再生而由纖維組織代替，由此可產(chǎn)生左心室重塑、心律失常和心力衰竭[5]。心室重塑伴隨著心肌梗死后心肌損傷修復(fù)的整個過程，是心肌梗死后心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。心肌纖維化作為心室重塑的主要病理生理基礎(chǔ)，是心肌組織中膠原纖維過量沉積，膠原濃度和膠原容積分數(shù)顯著增加，各型膠原比例失調(diào)以及排列紊亂的結(jié)果。不同程度的心肌纖維化可引起心肌順應(yīng)性降低，使心臟舒張、收縮功能受損，同時可使心肌細胞間距增大，阻礙生物電信號的正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致惡性心律失常，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。因此，緩解心肌纖維化，遏制心室重塑的進程，在心肌梗死后心力衰竭的治療中尤為重要。

有文獻報道AT1受體拮抗劑能夠改善心肌纖維化及延緩心室重塑，在給予厄貝沙坦治療大鼠心肌梗死模型中，我們觀察到厄貝沙坦組大鼠左心室重量較模型組明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，在心肌梗死4周時觀察HE染色后的大鼠缺血心肌組織，假手術(shù)組心肌細胞排列整齊，而模型組心肌結(jié)構(gòu)排列紊亂，細胞核溶解消失，大量成纖維細胞聚集，梗死區(qū)與非梗死區(qū)邊界清楚，厄貝沙坦組較模型組病理改變明顯減輕，證實了厄貝沙坦的心肌保護作用。

心肌梗死后心肌損傷、心肌纖維化過程伴有多種細胞因子的表達。HGF對心肌梗死后缺血心肌的血管新生、心臟功能改善發(fā)揮著不可或缺的作用[6]。HGF是c-Met配體，可通過激活c-Met 及其下游信號通路誘導(dǎo)細胞發(fā)生多種生物學(xué)行為，例如增殖、分化、侵襲、遷移等[7]。

Gallo 等[8]證實心肌梗死后外周血循環(huán)中 HGF 水平明顯增高，HGF 可以促進心肌梗死后心肌組織的損傷修復(fù)[9]，臨床實驗中我們亦觀察到心肌梗死患者血清中存在HGF水平的高表達[10]，與上述文獻報道結(jié)果一致。同時實驗中發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦對梗死大鼠缺血心肌組織中HGF水平亦產(chǎn)生影響，厄貝沙坦組及模型組大鼠缺血心肌中HGF mRNA及蛋白水平均較假手術(shù)組明顯增高，但厄貝沙坦組心肌組織中HGF的mRNA及蛋白水平均低于模型組。表明厄貝沙坦應(yīng)用4周可使大鼠缺血心肌組織中HGF水平降低，已明確厄貝沙坦能夠減輕梗死后心肌纖維化，因此推測HGF 水平變化可直接或間接反映 MF 的病理生理過程。

目前 HGF 作為一種心血管保護因子已試驗性用于治療缺血性心臟病[11]。Koudstaal 等[12]通過新型的UPy水凝膠載體將IGF-1/HGF傳遞用于治療心肌梗死，4周后發(fā)現(xiàn) UPy-IGF-1/HGF治療可明顯改善病理性心室重構(gòu)，激活、增加epCSCs數(shù)量，促進心肌細胞與毛細血管的新生。Zhang 等[13]發(fā)現(xiàn)通過外源性注射HGF-MSCs能夠起到抗心律失常作用，減少心肌梗死后細胞凋亡，改善心肌缺血。Zhang 等[14]在體外實驗中觀察到HGF能夠顯著加強BMSCs的心肌分化，并能夠促進BMSCs遷移，明顯改善左心室重構(gòu)與心臟功能。

心肌梗死后心肌修復(fù)、心室重構(gòu)的過程十分復(fù)雜，其中涉及多種細胞因子、多種信號通路等共同參與其中。HGF 在機體各種組織細胞中均有廣泛表達，以旁分泌或自分泌的方式作用于靶細胞，其生物學(xué)活性與心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。HGF已被證明具有抗纖維化、促血管生成等保護作用，但因其不穩(wěn)定性及制造價格昂貴，阻礙其臨床應(yīng)用[15]。因此通過外源性手段干預(yù)機體內(nèi) HGF 水平，而達到治療目的顯得尤為重要。本實驗樣本量較小，尚需進一步實驗觀察證實。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍, 羅 森)

Effects of irbesartan on expression of HGF at mRNA and protein levels in rats with myocardium infarction

YU Jun-min, ZHANG Xiao-bo, LI Da-he, WANG Hui-dong

(TheFirstDepartmentofGeriatrics,TheFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China.E-mail:yjmvip1@126.com)

AIM: To investigate the effects of irbesartan on the expression of hepatocyte growth factor (HGF) at mRNA and protein levels in rats with myocardial infarction (MI), and to explore the mechanisms of irbesartan attenuating myocardial fibrosis.METHODS: The male Wistar rat model of MI was successfully established. The surviving rats 24 h after the operation were randomly divided into 3 groups: model group， irbesartan group and sham group, with 9 rats in each group. The rats in irbesartan group were treated with the solution of irbesartan (50 mg·kg-1·d-1) by intragastric administration, while the rats in model group and sham group

the equal volume of saline by the same way. The body weight and left ventricle mass (LVM) of the rats were measured at the 4th week after operation, and the pathological changes of the ischemic myocardium were observed with HE staining. Meanwhile, the expression of HGF at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot.RESULTS: HE staining showed that the myocardial cells in sham group were in neat arrangement, while the cardiac structure in model group and irbesartan group was in disorder. The pathological changes in irbesartan group were less than that in model group. No difference in the body weight at the 4th week after operation was observed, while the LVM was significantly different among the 3 groups (P<0.01). The LVM in model group was higher than that in sham group (P<0.01), and that in irbesartan group was higher than that in sham group (P<0.05). The LVM in irbesartan group was lower than that in model group (P<0.05). The expression of HGF at mRNA and protein levels was detected in each group. The expression of HGF at mRNA and protein levels in irbesartan group was higher than that in sham group (P<0.05), and that in model group was higher than that in sham group (P<0.01). Moreover, the mRNA and protein levels of HGF in irbesartan group were lower than those in model group (P<0.05). CONCLUSION: The LVM of MI rats with the treatment of irbesartan was reduced obviously at the 4th week after operation, and the pathological changes were also improved. At the 4th week after the operation, the treatment of irbesartan inhibited the expression of HGF at mRNA and protein levels.

Hepatocyte growth factor; Irbesartan; Myocardial infarction

1000- 4718(2017)06- 1134- 04

2016- 12- 05

2017- 02- 10

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(No. H201389)

R542.2+2； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.029

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