半乳糖凝集素3對內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移及炎癥反應(yīng)的影響*

仲 琳， 梁平平▲， 龔 磊， 王佳慧， 朱玉潔， 林澤潤， 楊 軍△

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院 1心內(nèi)科， 2生物芯片實驗室， 3中心實驗室，山東 煙臺 264000)

半乳糖凝集素3對內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移及炎癥反應(yīng)的影響*

仲 琳1， 梁平平1▲， 龔 磊2， 王佳慧3， 朱玉潔1， 林澤潤1， 楊 軍1△

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院1心內(nèi)科，2生物芯片實驗室，3中心實驗室，山東 煙臺 264000)

目的： 探討半乳糖凝集素3(GAL-3)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)生長、遷移及炎癥反應(yīng)的影響及其作用機制。方法: 體外培養(yǎng)HUVECs，給予GAL-3重組蛋白2 mg/L或GAL-3短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒載體處理，實驗分為正常對照組、GAL-3重組蛋白處理組、陰性對照組和GAL-3-shRNA組。通過實時熒光定量PCR檢測GAL-3、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和cyclin D1的mRNA水平；利用Western blot 檢測 GAL-3、MCP-1和IL-6的蛋白表達(dá)；利用ELISA檢測MCP-1和IL-6在培養(yǎng)基中的水平；通過CCK-8實驗和劃痕實驗檢測HUVECs的活力和遷移能力；利用Western blot檢測信號分子熱休克蛋白90(HSP90)、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白水平。結(jié)果: 首先，給予GAL-3重組蛋白處理后，GAL-3、MCP-1和IL-6的mRNA及蛋白水平，MMP-9和cyclin D1的mRNA水平，MCP-1和IL-6在培養(yǎng)基的分泌水平均明顯高于正常對照組；而GAL-3-shRNA感染細(xì)胞后，上述分子的表達(dá)水平均低于正常對照組和陰性對照組。其次，GAL-3重組蛋白處理后，細(xì)胞活力和遷移能力明顯高于正常對照組；而GAL-3-shRNA感染后，細(xì)胞活力和遷移能力均低于正常對照組和陰性對照組。此外，GAL-3重組蛋白處理組中，p-ERK1/2和HSP90 的蛋白水平高于正常對照組；而GAL-3-shRNA 組中，p-ERK1/2和HSP90 的蛋白水平均低于正常對照組和陰性對照組。p-JNK的蛋白水平在各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。結(jié)論: GAL-3促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長、遷移及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其機制可能與HSP90-ERK1/2信號通路有關(guān)。

半乳糖凝集素3； 內(nèi)皮細(xì)胞； 細(xì)胞遷移； 炎癥

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一個慢性增殖和慢性炎癥的發(fā)展過程，研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣斑塊病變部位常存在病理性新生血管的形成和炎癥因子的釋放，它們不僅可以加速AS病變的進展，還可以導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊的形成。其中血管重塑和急性炎癥是導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血和斑塊破裂重要因素，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和遷移是血管重塑的重要環(huán)節(jié)[1]。

半乳糖凝集素3(galectin-3，GAL-3)是β-半乳糖苷動物凝集素家族成員之一[2]，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，不僅參與細(xì)胞的增殖、遷移、黏附、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程，同時也在心血管疾病，如動脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、心肌缺血再灌注、急性冠脈綜合征等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。 研究發(fā)現(xiàn)，GAL-3作為一種強大的促炎癥因子，可以促使單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化及其在血管內(nèi)膜損害部位的聚集，激發(fā)炎癥因子如白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等的釋放[4]。同時，GAL-3也可作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，在活化的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中GAL-3的表達(dá)水平明顯增加，可通過促進VSMCs增殖和遷移而加速動脈斑塊的形成[5]。Mackinnon等[6]在研究ApoE缺陷鼠模型中發(fā)現(xiàn)GAL-3 能促進AS的形成。此外，F(xiàn)alcone等[7]發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛患者的GAL-3血漿水平顯著高于穩(wěn)定型心絞痛患者，進一步提示GAL-3與病變斑塊的易損性有關(guān)。但是GAL-3對內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和炎癥因子表達(dá)的影響以及可能的作用機制尚未見報道。本研究通過外源加入GAL-3重組蛋白及利用RNA干擾抑制GAL-3表達(dá)的方法，觀察GAL-3在內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及炎癥反應(yīng)中的作用和機制，為動脈粥樣硬化和不穩(wěn)定斑塊的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco；GAL-3 RNA干擾慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)有限公司；兔抗GAL-3、MCP-1和IL-6多克隆抗體購自Abcam；兔抗細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2)、p-ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p-JNK單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗和HRP標(biāo)記的兔抗鼠 II 抗購自北京中杉金橋；MCP-1和IL-6 ELISA試劑盒購自上海龍騰科技股份有限公司；人源GAL-3重組蛋白購自PeproTech；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；real-time PCR試劑盒購自Applied Biosystems；總RNA提取試劑盒、總蛋白質(zhì)提取試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo;其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成，見表1。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HUVECs以1×108/L接種于6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞每隔2 d換液1次。

表1 引物序列

F: forward； R: reverse.

2.2GAL-3基因缺陷性HUVECs的構(gòu)建及鑒定 由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司以GV248為載體，根據(jù)人GAL-3基因序列(NM_002306)設(shè)計和合成3條靶向短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA)序列 [shRNA1(5’-TGCCTCGCATGCTGATAACAA-3’)、shRNA2(5’-GAGAACAACAGGAGAGTCATT-3’)和shRNA3(5’-CCTGGAGCACCTGGAGCTTAT-3’)]和1條陰性對照(control) shRNA序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)，并包裝成慢病毒形式。將HUVECs常規(guī)培養(yǎng)至30%左右時，用GAL-3-shRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體感染HUVECs 12 h左右，感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20。以含10% FBS的1640培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，48 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)，利用 PCR和Western blot實驗驗證基因干擾效率。

2.3 實驗分組 將HUVECs分為4個組：(1)正常對照組：無處理組；(2)GAL-3重組蛋白處理組：在培養(yǎng)基中加入人源GAL-3重組蛋白至終濃度為2 mg/L，培養(yǎng)24 h；(3)陰性對照組：HUVEC感染陰性對照慢病毒載體；(4)GAL-3-shRNA組：HUVECs感染GAL-3-shRNA慢病毒載體。

2.4 實時熒光定量PCR實驗 按照TRIzol試劑盒說明書提取各實驗組總RNA，并測定其濃度。取1 μg總RNA按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，20 μL實時定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBR? Select Master Mix 10 μL， cDNA(75 ng)1 μL， 上、下游引物各0.5 μL， RNase-free water 8 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min; 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 共40個循環(huán)。利用ABI Prism 7900軟件得到每個樣品的Ct值，每組設(shè)3個復(fù)孔，取Ct平均值，以2-ΔΔCt分析實時定量PCR結(jié)果。

2.5 Western blot實驗 根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書，提取各實驗組細(xì)胞的蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE充分分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，封閉液室溫封閉1 h，加入稀釋的 I 抗(GAL-3 1∶5 000； MCP-1 1∶200； IL-6 1∶200； HSP90 1∶1 000； ERK1/2 1∶3 000； p-ERK1/2 1∶3 000； JNK 1∶200； p-JNK 1∶500)，于4 ℃過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng) II 抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL液顯影，β-actin作為內(nèi)參照，利用ImageJ軟件計算條帶灰度比，利用統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2.6 ELISA法檢測MCP-1和IL-6的水平 將正常HUVECs和慢病毒穩(wěn)定感染的HUVECs接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，棄上清，加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，其中GAL-3處理組加入人源GAL-3重組蛋白2 mg/L，繼續(xù)孵育24 h，收集上清，根據(jù)人MCP-1和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書，檢測培養(yǎng)上清的MCP-1和IL-6分泌水平，樣本及標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取均值，以pg/L表示。

2.7 CCK-8法檢測細(xì)胞活力 將對數(shù)生長期的正常HUVECs和慢病毒穩(wěn)定感染的HUVECs消化后，以每孔2×103的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)60%～70%時，其中GAL-3處理組加入人源GAL-3重組蛋白2 mg/L，處理24 h，棄上清，加入100 μL的無血清DMEM培養(yǎng)基以及10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處檢測(A)值，細(xì)胞活力=實驗組A值/對照組A值，每組設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取均值，所得比值進行統(tǒng)計分析。

2.8 細(xì)胞劃痕實驗 將正常HUVECs和慢病毒穩(wěn)定感染的HUVECs接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞融合率達(dá)90%，使用200 μL的無菌槍頭在培養(yǎng)皿中央垂直劃線，用PBS清洗2次加入無血清的DMEM培養(yǎng)液，在劃痕處拍照作為初始對照。其中GAL-3處理組加入人源GAL-3重組蛋白2 mg/L，繼續(xù)孵育24 h，于顯微鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量劃痕的距離，細(xì)胞遷移率(%)= (原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度)/原劃痕寬度×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采單因素方差分析(one-way ANOVA) ，用Bonferroni 校正的t檢驗進行各組間均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 GAL-3-shRNA慢病毒干擾效率的檢測結(jié)果

GAL-3-shRNA慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體感染HUVECs 48 h，實時定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，GAL-3-shRNA組的 GAL-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，其中GAL-3-shRNA2組的GAL-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平最低，提示在本實驗中GAL-3-shRNA2組干擾效率最好，并應(yīng)用于后續(xù)實驗中，見圖1。

Figure 1.The lentiviral vector of shRNA reduced the mRNA (A) and protein (B) expression of GAL-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsshControl.

圖1 慢病毒載體干擾GAL-3的mRNA和蛋白表達(dá)

2 GAL-3重組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自身GAL-3的表達(dá)

GAL-3重組蛋白2 mg/L處理細(xì)胞24 h，實時熒光定量PCR和Western blot實驗結(jié)果顯示：與正常組相比，GAL-3重組蛋白處理組的GAL-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，提示外源性GAL-3重組蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞自身GAL-3的表達(dá)，增強GAL-3的作用效應(yīng)，見圖2。

Figure 2.Recombinant GAL-3 protein induced the endogenous mRNA (A) and protein (B) expression of GAL-3 in HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsshControl.

圖2 GAL-3重組蛋白誘導(dǎo)HUVECs內(nèi)源GAL-3的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)

3 GAL-3重組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1和IL-6的表達(dá)

通過實時熒光定量PCR和Western blot對各實驗組檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，GAL-3重組蛋白處理組MCP-1和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而GAL-3-shRNA組MCP-1和IL-6的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于正常組和陰性對照組(P<0.05)。同時ELISA對各實驗組上清檢測發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，GAL-3重組蛋白明顯誘導(dǎo)HUVECs分泌炎癥因子MCP-1和IL-6(P<0.05)。而與正常組和陰性對照組相比，GAL-3-shRNA組MCP-1和IL-6分泌水平明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression (A), secretion (B) and protein expression (C) of MCP-1 and IL-6 in each group were detected respectively by RT- PCR, ELISA and Western blot， respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖3 RT-PCR、ELISA和Western blot分別檢測各組MCP-1和IL-6 mRNA表達(dá)水平、分泌水平和蛋白表達(dá)水平

4 GAL-3誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9和cyclin D1的表達(dá)

實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),與正常組相比，GAL-3重組蛋白處理組MMP-9和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，而GAL-3-shRNA組MMP-9和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression levels of MMP-9 and cyclin D1 in each group were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖4 RT-qPCR檢測各組MMP-9和cyclin D1的mRNA表達(dá)水平

5 GAL-3誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖

通過劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn)：與正常組相比，GAL-3重組蛋白明顯誘導(dǎo)HUVECs的遷移(P<0.05)，而GAL-3-shRNA組HUVECs的遷移能力明顯低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，提示GAL-3參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。此外，通過CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)，GAL-3重組蛋白處理組的細(xì)胞活力明顯高于正常組(P<0.05)，而與正常組和陰性對照組相比，GAL-3-shRNA組的細(xì)胞活力則明顯降低(P<0.05)，見圖5。

6 GAL-3參與HSP90-ERK1/2信號通路的激活，而與JNK信號通路無關(guān)

與正常組相比，GAL-3重組蛋白顯著誘導(dǎo)HSP90和p-ERK1/2的蛋白水平增高，而GAL-3-shRNA組中的HSP90和p-ERK1/2蛋白水平明顯低于正常組和陰性對照組(P<0.05)，提示GAL-3可以明顯激活HSP90-ERK1/2信號通路。同時，JNK信號通路作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路，本實驗檢測發(fā)現(xiàn)，p-JNK的蛋白水平在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，提示GAL-3不參與JNK信號通路的激活，見圖6。

Figure 5.The ability of migration (A, ×100) and the viability (B) of HUVECs in each group were detected by wound healing assay and CCK-8 assay， respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖5 各組HUVECs的遷移能力和細(xì)胞活力

討 論

大量證據(jù)表明，血管重塑依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的活化，當(dāng)血管內(nèi)膜受到外界損傷或炎癥刺激時，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞大量遷移、增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致血管重塑，并促使不穩(wěn)定斑塊的形成，是臨床上急性心血管事件重要的始動環(huán)節(jié)[8]，因此針對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及炎癥反應(yīng)的實驗研究，可為臨床不穩(wěn)定性斑塊的早期識別和干預(yù)奠定基礎(chǔ)。本研究通過加入GAL-3重組蛋白及RNA干擾技術(shù)，證實GAL-3可誘導(dǎo)HUVECs生長、遷移以及炎癥反應(yīng)，其機制可能與HSP90/ERK1/2信號通路激活有關(guān)。

研究表明，炎癥反應(yīng)是激活內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵，其中GAL-3能促進巨噬細(xì)胞活化及單核細(xì)胞趨化，增加MCP-1、IL-6、MMP-9等因子的表達(dá)，而這些炎癥因子及趨化因子在AS發(fā)展中起著重要的作用[2]。MCP-1作為重要的趨化因子，其誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移和滲透是激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子IL-6等釋放的重要環(huán)節(jié)[9]。研究表明，阻斷MCP-1表達(dá)可以明顯減少血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)并起到穩(wěn)定斑塊的作用。我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVECs中炎癥因子MCP-1和IL-6可被GAL-3重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，而GAL-3 RNA干擾則可有效抑制炎癥因子的表達(dá)水平，進一步證實GAL-3參與內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。此外研究發(fā)現(xiàn)，GAL-3 的表達(dá)可以作為轉(zhuǎn)錄的標(biāo)志，活化狀態(tài)細(xì)胞GAL-3表達(dá)水平高于靜息狀態(tài)的細(xì)胞[10]，進一步促進炎癥因子的釋放。因此，GAL-3重組蛋白明顯誘導(dǎo)HUVECs自身的GAL-3表達(dá)， 從而擴大其自身作用效應(yīng)，其機制可能與GAL-3激活內(nèi)皮細(xì)胞而使其處于增殖狀態(tài)有關(guān)，但具體機制尚不清楚

Figure 6.The protein level of HSP90 (A) and the phosphorylation of ERK1/2 (B) and JNK (C). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsshControl group.

圖6 Western blot檢測檢測各組HSP90、p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平變化

。

此外，細(xì)胞外基質(zhì)的降解是血管重塑重要的內(nèi)在因素之一，MMP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)血管重塑，促使易損斑塊的形成[11]。細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡，cyclin D1作為重要的細(xì)胞周期蛋白，其表達(dá)水平高低反映細(xì)胞的增殖能力。為了進一步驗證GAL-3對HUVECs的生長和遷移的影響，本研究通過檢測了MMP9、Cyclin D1表達(dá)、以及CCK-8增殖實驗和細(xì)胞劃痕實驗探討HUVECs的增殖和遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GAL-3能夠調(diào)節(jié)HUVECs的生長與遷移。因此，GAL-3的促炎癥反應(yīng)和促生長效應(yīng)可能是其參與AS不穩(wěn)定斑塊形成過程主要環(huán)節(jié)。

HSP90 為作為心臟內(nèi)源性保護蛋白，外界刺激因素(如熱應(yīng)激、缺氧、炎癥反應(yīng)等)可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)HSP90 表達(dá)增加，以減輕細(xì)胞的損傷[12]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中HSP90可以選擇性地增強ERK1/2信號通路，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移[13]。ERK1/2與JNK同屬于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的成員[14]，ERK1/2主要參與從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡的重要信號通路。JNK信號通路可受外界應(yīng)激刺激而被活化，從而引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，GAL-3可調(diào)控HUVECs的生長與遷移，GAL-3重組蛋白明顯誘導(dǎo)HSP90和ERK1/2磷酸化水平上調(diào)，而GAL-3基因干擾可有效抑制HSP90和p-ERK1/2的表達(dá)水平，但不影響JNK活性。因此，GAL-3誘導(dǎo)HUVECs生長、遷移以及炎癥反應(yīng)可能與HSP90/ERK1/2信號通路有關(guān)，但與JNK信號通路無關(guān)。

綜上所述，GAL-3促進血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，為防治血管重塑和動脈粥樣硬化提供了新的思路。

[1] 譚曉勇, 羅 茂, 盧培林, 等. miR-30c調(diào)控PAI-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和遷移的影響[J].中國病理生理雜志, 2016, 32(12): 2199-2204.

[2] 禹艷紅, 潘善培, 謝琪璇, 等. Galectin-3在雌性小鼠生殖系統(tǒng)中的表達(dá)及脂多糖的影響[J].中國病理生理雜志, 2009, 25(7):1409-1414.

[3] Meijers WC, López-Andrés N, de Boer RA. Galectin-3, cardiac function, and fibrosis[J]. Am J Pathol, 2016, 186(8):2232-2234.

[4] Chen SS, Sun LW, Brickner H, et al. Downregulating galectin-3 inhibits proinflammatory cytokine production by human monocyte-derived dendritic cells via RNA inter-ference[J]. Cell Immunol, 2015, 294(1):44-53.

[5] Arar C, Gaudin JC, Capron L, et al. Galectin-3 gene (LGALS3) expression in experimental atherosclerosis and cultured smooth muscle cells[J]. FEBS Lett, 1998, 430(3):307-311.

[6] Mackinnon AC, Liu X, Hadoke PW, et al. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Glycobiology, 2013, 23(6):654-663.

[7] Falcone C, Lucibello S, Mazzucchelli I, et al. Galectin-3 plasma levels and coronary artery disease: a new possible biomarker of acute coronary syndrome[J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2011, 24(4):905-913.

[8] Moran A, Gu D, Zhao D, et al. Future cardiovascular disease in China: Markov model and risk factor scenario projections from the coronary heart disease policy model-China[J]. Circ Cardiovasc Qual Outcomes, 2010, 3(3):242-252.

[9] Tanimoto A, Murata Y, Wang KY, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 expression is enhanced by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor via Jak2-Stat5 signaling and inhibited by atorvastatin in human monocytic U937 cells[J]. J Biol Chem, 2008, 283(8): 4643-4651.

[10]李慶寬, 張育民. 半乳糖凝集素-3與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的研究進展[J].心血管病學(xué)進展, 2013, 34(3): 394-398.

[11]Kampoli AM, Tousoulis D, Papageorgiou N, et al. Matrix metalloproteinases in acute coronary syndromes: current perspectives[J]. Curr Top Med Chem, 2012, 12(10): 1192-1205.

[12]Kazimirko VK, Kutovoy VV, Bobyk VI, et al. Chape-rones function HSP60 and HSP90 and their role in cardiac pathology[J]. Lik Sprava, 2014, (9-10):19-24.

[13]Gao F, Hu X, Xie X, et al. Heat shock protein 90 stimulates rat mesenchymal stem cell migration via PI3K/Akt and ERK1/2 pathways[J]. Cell Biochem Biophys, 2015, 71(1): 481-489.

[14]Wang Z, Niu Q, Peng X, et al. Mitofusin 2 ameliorates aortic remodeling by suppressingras/raf/ERK pathway and regulating mitochondrial function in vascular smooth muscle cells[J]. Int J Cardiol, 2015, 178:165-167.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of galectin-3 on growth, migration and inflammation of endothe-lial cells

ZHONG Lin1, LIANG Ping-ping1, GONG Lei2, WANG Jia-hui3, ZHU Yu-jie1, LIN Ze-run1, YANG Jun1

(1DepartmentofCardiology，2BiochipLaboratory，3CentralLaboratory,YantaiYuhuangdingHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Yantai264000,China.E-mail:yangjun19640124@163.com)

AIM: To explore the effects of galectin-3 (GAL-3) on the viability, migration and inflammation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and the mechanisms. METHODS: The HUVECs were culturedinvitroand treated with GAL-3 recombinant protein at 2 mg/L or GAL-3 short hairpin RNA (shRNA). The HUVECs were divided into normal group, recombinant GAL-3 group, shControl group and GAL-3-shRNA group. The mRNA expression of GAL-3, monocyte chemotactic protein (MCP)-1, IL-6, matrix metalloproteinase (MMP)-9 and cyclin D1 was detected by real-time quantitative PCR， and the protein expression of GAL-3, IL-6 and MCP-1 was detected by Western blot. The secretion levels of MCP-1 and IL-6 in the culture medium were measured by ELISA. The viability and the ability of migration of the HUVECs were examined by CCK-8 assay and wound healing assay. The protein levels of heat shock protein 90 (HSP90), ERK1/2, p-ERK1/2, JNK and p-JNK were determined by Western blot. RESULTS: The expression of GAL-3, MCP-1 and IL-6 at mRNA and protein levels, the mRNA expression of MMP-9 and cyclin D1, and the secretion levels of MCP-1 and IL-6 in the culture medium were significantly higher than those in normal group (P<0.05) after the HUVECs were treated with GAL-3 recombinant protein. However, these molecules mentioned above in GAL-3-shRNA group were significantly lower than those in normal group and negative control group (P<0.05). Compared with normal group, the viability and migration ability of the HUVECs in recombinant GAL-3 group were significantly increased, but the viability and migration ability of the HUVECs in GAL-3-shRNA group were lower than those in normal group and shControl group (P<0.05). In addition, the protein levels of p-ERK1/2 and HSP90 in recombinant GAL-3 group were higher than those in normal group (P<0.05), but those in GAL-3-shRNA group were lower than those in normal group and shControl group (P<0.05). The protein level of p-JNK was not oviously changed among the 4 groups. CONCLUSION: GAL-3 is involved in regulating the cell growth, migration and the release of inflammatory cytokines in vascular endothelial cells, which may be mediated by HSP90-ERK1/2 signaling pathway.

Galectin-3; Endothelial cells; Cell migration; Inflammation

1000- 4718(2017)06- 1065- 08

2016- 10- 19

2017- 01- 12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81571636)；山東省自然科學(xué)基金資助項目(No. ZR2015HM058)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展計劃資助項目(No. 2015WS0017)；煙臺市科技發(fā)展計劃項目(No. 2013WS224; No. 2015WS021)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.018

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△通訊作者 Tel: 13808900219; E-mail: yangjun19640124@163.com

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