呂哲 張穎 張玉波 時美娟 孟晴 路虹
河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科(石家莊050000)
大鼠局灶性腦缺血再灌注后聽覺中樞損傷的研究
呂哲 張穎 張玉波 時美娟 孟晴 路虹
河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科(石家莊050000)
目的探討大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后聽覺中樞的改變及引起聽力損傷的可能機制。方法選擇健康白色雄性SD大鼠60只,隨機分為假手術組和缺血再灌注組,每組30只。采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型,假手術組只分離頸部血管,不插入線栓。腦缺血60min,再灌注24h。于手術前及術后24h檢測聽性腦干反應,術后24h行神經功能評分,干濕重法測定腦組織含水量,TTC法檢測腦梗死體積,通過Evans blue的滲出情況評估血腦屏障的完整性,末端標記法觀察神經細胞凋亡狀況,計算凋亡指數(shù)。Western blotting法測定MMP-9、Clau?din-5、Occludin、PSD-95、CX-43及Na+-α蛋白表達。結果與假手術組比較,缺血再灌注組神經功能評分及腦含水量升高,腦梗死體積增大,ABR反應閾值明顯增加,凋亡指數(shù)增加,MMP-9、CX-43蛋白表達明顯上升,Claudin-5、Occludin、PSD-95、Na+-α蛋白表達顯著下降。兩組比較差異均具有統(tǒng)計學意義。結論局灶性腦缺血再灌注損傷后聽覺中樞的改變及聽力損傷可能與MMPs激活、血腦屏障破壞、縫隙連接通道功能活化、突觸功能異常及離子通道破壞有關。
缺血再灌注損傷;血腦屏障;縫隙連接;金屬蛋白酶9;離子通道
聽力障礙嚴重影響一個人的生活質量和社會交往,許多原因都可導致聽力障礙,例如炎癥、外傷、老齡化、遺傳及腦梗塞。許多臨床報告都顯示腦卒中患者伴有聽力損害[1-2],但是其具體機制研究尚少。
既往對缺血再灌注損傷導致聽力損傷研究多集中于耳蝸,對其導致的中樞病變研究較少[3-6]。腦梗塞后可出現(xiàn)聽覺處理異常[7]。同樣有許多腦梗塞伴聽力損傷患者顯示有聽覺感知如聲音定位的障礙,用外周病變很難解釋。聽皮層是大腦皮質的一個亞皮質區(qū)域,也是聽覺系統(tǒng)的最高級中樞。初級聽皮層神經元的凋亡及退行性變將導致聽覺中樞對傳入聲音信息的感知能力下降,對聲音信息的處理和認知能力下降[8]。神經信號發(fā)生和傳遞、轉導與縫隙連接、化學突觸及離子通道有關,實現(xiàn)細胞間的信息交流。在本研究中,我們通過建立短暫性右側大腦中動脈閉塞模型,探討腦缺血導致聽力障礙的可能機制,以及聽覺皮層損傷是否與激活MMP-9、細胞凋亡,破壞縫隙連接、突觸及血腦屏障,進而影響中樞聽覺功能有關。
1.1實驗動物
選擇健康白色雄性SD大鼠60只,耳廓反射靈敏、無噪聲暴露及耳毒性藥物使用史,購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心,體重250-280g,以標準飼料喂養(yǎng),恒溫20-25℃,12h光照/12h黑暗環(huán)境飼養(yǎng)。動物許可證號:SCXK(冀)2013-1-003。
1.2試劑和儀器
三苯氯化四氮唑(TTC)、兔抗CX43單克隆抗體(美國Sigma公司),兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗Na+-α單克隆抗體、兔抗PSD-95多克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗Claudin-5多克隆抗體、兔抗Occludin多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體、Evans blue(美國Santa Cruz公司),Tunel試劑盒(Roche公司),羊抗兔IgG熒光抗體(美國Rockland公司),ICS-CHARTR-EP型ABR電位儀(北京麥德森醫(yī)療器),Synergyynergy-HT多功能酶標(美國BioTek公司)。
1.3實驗方法
1.3.1動物分組和模型:將SD大鼠隨機分為2組:對照組(Sham組)和缺血再灌注組(Ischemia-Re? perfusion,I/R組)。每組30只。具體方法為:大鼠以10%水合氯醛麻醉后,分離右側頸總動脈及頸外、頸內動脈,結扎頸外動脈遠端,于頸外動脈上用顯微手術剪剪一小口,將標記好的栓線由切口處插入頸內動脈,向上深入約為距頸總動脈分叉處18.5±0.5mm,進線有輕微阻力,堵住大腦中動脈開口。結扎固定。閉塞時間為60min,后輕柔拔出線栓[9]。Sham組只分離頸部血管,不插入線栓。缺血再灌注24h后進行檢測和處死、取材。
1.3.2神經功能缺失評分:處死前采用改良的Lon?ga的6級5分法單盲進行行為學評分[9]。0分:無神經損傷癥狀;1分:提尾時不能伸展對側前肢;2分:提尾時對側前肢屈曲;3分:行走時輕度向對側轉圈;4分:行走時嚴重向對側轉圈;5分:不能自發(fā)行走,向對側跌倒。
1.3.3聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)測試:造模前及造模后24小時后,對兩組動物進行右耳ABR檢測。具體方法為:10%水合氯醛(0.35m l/100g)腹腔注射麻醉,置于隔聲屏蔽室內,采用美國ICS聽性腦干誘發(fā)電位儀檢測,使用針式電極,記錄電極置于顱頂正中皮下,參考電極置于右耳耳廓皮下,接地電極置于鼻尖。選用短聲為刺激聲,極性為交替波,速率為21.1次/秒,增益為50k,觀察時程為10ms。初始刺激強度從90dB SPL開始,后按5dB SPL逐檔遞減。至遞減到出現(xiàn)兩次ABR波Ⅲ波形不一致時,再增加5dBSPL檢測。直至重復波形出現(xiàn)一致時,即記為ABR反應閾值。為減少人為誤差,同樣方法再次測試,兩次Ⅲ波重合即可確定為閾值。
1.3.4腦組織含水量測定:大鼠斷頭快速取腦,冠狀切開去除額極。取病變側約2mm厚腦組織,放入已稱重的錫紙中稱重。然后用錫紙包裹,放入95℃烤箱中烘干24h,取出恢復至室溫稱重。采用公式計算腦組織含水量:(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。
1.3.5腦梗死體積測定:大鼠斷頭迅速取腦,PBS沖洗,均勻切成5片冠狀切片,浸入2%TTC溶液中,37℃溫箱中染色30min,4%多聚甲醛固定24h,拍照后應用圖像分析軟件計算梗死體積。梗死體積百分比=[總梗死體積-(梗死側半球體積-梗死對側半球體積)]/梗死對側半球體積×100%。
1.3.6 Evans blue含量測定:大鼠處死前2h經尾靜脈緩慢注射2%Evansblue溶液(4m l/kg),2h后10%水合氯醛麻醉,PBS心臟灌注,經血液循環(huán)將腦組織中其它部位的Evansblue溶液沖洗掉。斷頭取腦并拍照,收集損傷側大腦半球并稱重,用50%三氯乙醇做為勻漿介質進行勻漿(1.5ml/g腦組織)。取上清液,室溫靜置10min后4℃3000g離心20min。冰上靜置10min后將上面的液體完全取出,無水乙醇稀釋(液體:無水乙醇=1:3)混勻,酶標儀上620nm處測量吸光度,與標準曲線對照后計算Ev?ansblue含量(ug/g腦組織)
1.3.7 TUNEL法檢測凋亡神經細胞:麻醉后暴露心臟,自心尖處插入灌注針,以4%多聚甲醛灌注后取腦。參照《大鼠腦立體定位圖譜》確定聽皮層區(qū)域并于顯微鏡下剝離皮層組織取材。置于4%多聚甲醛中固定24小時以上,石蠟包埋。按照大鼠的冠狀位進行切片,5um/片,從聽皮層開始到最后,每5張腦片選擇一張,常規(guī)脫蠟至水,按照試劑盒說明書進行操作,光鏡下觀察,細胞核內棕黃色為陽性細胞。分別隨機選擇5個高倍視野,計算凋亡指數(shù):AI=(凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%
1.3.8 Western-blotting檢測基質金屬蛋白酶(Ma?trixmetalloproteinase-9,MMP-9)、緊密連接蛋白-5(Claudin-5)、閉鎖蛋白(Occludin)、突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein-95,PSD-95)、連接蛋白43(Connexin-43,CX-43)、鈉離子通道α(Na+-α)蛋白表達:顯微鏡下取梗死側聽皮層腦組織,制備腦組織勻漿,12000r/min4℃離心30min后取上清,BCA法蛋白定量。后經變性、上樣、電泳、轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入兔抗MMP-9多克隆抗體(1:400)、兔抗Claudin-5多克隆抗體(1:400)、兔抗Occludin多克隆抗體(1:500)、兔抗PSD-95多克隆抗體(1:500)、兔抗CX43單克隆抗體(1:400)、兔抗Na+-α單克隆抗體(1:400)、兔抗β-actin多克隆抗體(1:500),4℃孵育過夜后洗膜,加入羊抗兔IgG熒光抗體(1:3000),37℃孵育1h,遠紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描,測定目標帶單位密度,以β-actin的表達為內參照,MMP-9/β-actin、Claudin-5/β-actin、Occludin/β-actin、PSD-95/ β-actin、CX-43/β-actin、Na+-α/β-actin比值代表各蛋白相對表達水平。
1.4統(tǒng)計學方法
2.1神經功能缺失評分、腦組織含水量和腦梗死體積比較
Sham組無行為學改變,腦組織經TTC染色后顯示出均勻的紅色(圖1)。與Sham組比較,I/R組則表現(xiàn)出不同程度的腦缺血性損傷的表現(xiàn),例如不同程度的前肢屈曲,轉圈,對側肢體癱瘓等癥狀,表明缺血再灌注后造成了明顯的神經功能缺損。用干濕重法測得到腦組織含水量顯示,I/R組病變側腦組織含水量明顯升高;病變側腦組織經TTC染色后顯示為大范圍蒼白色梗死區(qū)域(圖1)。兩組神經功能缺失評分、腦組織含水量和腦梗死體積比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表1、圖1)。
圖1 Sham組和I/R組TTC染色Fig.1 The TTCStaining of Sham and I/R groups
表1 I/R 24h后兩組神經功能評分、腦組織含水量、腦梗死體積、腦組織EB含量及凋亡指數(shù)測定結果(±s)Table 1 The Resultof neurologicalscores、water content、infarctvolume、EBContentsand AIat24hrs post-operation(±s)
表1 I/R 24h后兩組神經功能評分、腦組織含水量、腦梗死體積、腦組織EB含量及凋亡指數(shù)測定結果(±s)Table 1 The Resultof neurologicalscores、water content、infarctvolume、EBContentsand AIat24hrs post-operation(±s)
Groups Sham group I/R group tP Neurological Scores(n=30)0 3.60±0.55 -35.851 <0.001 Water Contentof Brain(%)(n=5)75±2.45 83.60±3.36 -4.6244 =0.002 InfarctVolume(%)(n=5)0 61.80±2.39 -57.8197 <0.001 EB Contents(ug/g)(n=5)0.74±0.02 3.46±0.04 -136 <0.001 AI(%)(n=5)3.4±1.5 41.6±3.3 -23.5641 <0.001
2.2 ABR反應閾
造模前兩組ABR反應閾分別為24.38±4.35和24.88±3.85dB SPL,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義。造模后分別為24.88±3.85和55.60±3.36dBSPL。兩組比較差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01。Sham組造模前后比較差異無統(tǒng)計學意義。I/R組造模前后比較差異有統(tǒng)計學意義,提示聽力嚴重損傷。(表2、圖2)
圖2 Sham組和I/R組ABR檢測結果Fig.2 TheABRRssultof Sham and I/R groups(A:Sham group;B:I/R group)
2.3 Evansblue含量測定
缺血再灌注后24h,通過測量酶標儀上吸光度來檢測腦組織中Evans blue的漏出量來評估BBB的完整性,結果顯示,I/R組缺血側Evansblue滲漏較Sham組明顯增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)(表1、圖3)。
圖3 Evansblue染色A:Sham組;B:I/R組Fig.3 The Evansblue Staining of Sham and I/R groups(A:Sham group;B:I/R group)
2.4 TUNEL法檢測凋亡神經細胞
TUNEL法可以原位特異性的顯示檢測凋亡細胞。結果顯示缺血再灌注后24h,I/R組病變側梗死灶周邊組織陽性細胞明顯增多,兩組AI比較為41.6±3.3%vs 3.4±1.5%,差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。細胞形態(tài)上有改變,例如核濃縮,DNA片段化,凋亡小體等,提示缺血再灌注可以誘導細胞凋亡的發(fā)生(表1、圖4)。
圖4 神經細胞Tunel染色(×200)A:Sham組;B:I/R組;Fig.4 The TunelStaining ofneuralcells(×200)(A:Sham group;B:I/R group)
2.5 MMP-9、Claudin-5、Occludin、PSD-95、CX-43、Na+-α蛋白表達
Sham組皮層腦組織中有少量MMP-9蛋白表達,大量Claudin-5、Occludin、PSD-95、Na+-α蛋白表達。I/R組缺血皮層MMP-9、CX-43蛋白表達明顯上升,Claudin-5、Occludin、PSD-95、Na+-α蛋白表達顯著下降,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)(圖5、圖6、圖7)。
圖5 Western-blotting檢測MMP-9和CX-43蛋白表達A、B:MMP-9;C、D:CX-43*P<0.01vs Sham組Fig.5 The Protein Expression of MMP-9 and CX-43 by Wesern-blotting(A、B:MMP-9;C、D:CX-43),*P<0.01vs Sham group
表2 兩組實驗動物右耳ABR檢測結果(±s,n=30,dBSPL)Table2 TheABRResultof the RightEarof two Groups(±s,n=30,dBSPL)
表2 兩組實驗動物右耳ABR檢測結果(±s,n=30,dBSPL)Table2 TheABRResultof the RightEarof two Groups(±s,n=30,dBSPL)
Groups Sham group I/R group t P Pre-operation 24.38±4.35 24.88±3.85 -0.4714 >0.05 24hrspost-operation 26.44±5.45 55.60±3.36 -24.9458 <0.001 -1.6180 -32.9277 >0.05 <0.001 tP
圖6 Western-blotting檢測Claudin-5和Occludin蛋白表達A、B:Claudin-5;C、D:Occludin*P<0.01vs Sham組Fig.6 The Protein Expression of Claudin-5 and Occludin by Western-blotting(A、B:Claudin-5;C、D:Occludin),*P< 0.01vs Sham group
圖7 Western-blotting檢測PSD-95和Na+-α蛋白表達A、B:PSD-95;C、D:Na+-α*P<0.01vs Sham組Fig.7 The Protein Expression of PSD-95 and Na+-αbyWestern-blotting(A、B:PSD-95;C、D:Na+-α),*P<0.01vs Sham group
腦缺血再灌注后可以引發(fā)一系列復雜的分子學和生化機制,包括細胞凋亡、血腦屏障、基質金屬蛋白酶激活、縫隙連接、突觸異常、離子通道開放等。這幾種因素相互作用,構成一個非常復雜的調控網絡,造成系列病理級聯(lián)反應[10]。我們應用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注損傷(I/R)模型,手術操作簡便,創(chuàng)傷小,可良好模擬人類大腦中動脈局灶性腦缺血狀態(tài)。I/R后通過神經功能評分、腦含水量及梗死體積測定提示大腦皮質損傷。對聽覺通路高級中樞聽皮層的進一步檢測提示神經元出現(xiàn)結構和功能的變化,本研究實驗組在缺血再灌注24h后ABR反應閾較Sham組顯著升高,說明外周聽覺神經至腦干通路的神經電活動異常,聽功能出現(xiàn)損害,提示在腦卒中大鼠存在著聽力損害。
BBB是維持并穩(wěn)定中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境的重要結構,腦微血管內皮細胞及其間緊密連接(tight junction,TJ)是BBB的核心結構。Claudin-5及Oc?cludin是構成TJ的主要蛋白。腦缺血時可以激活炎性細胞因子,如NF-κB、IL-6等,促進與炎癥有關的細胞因子表達,擴大炎癥反應[11]。NF-κB還可以調節(jié)某些促炎性基因如MMP-9的表達。腦缺血再灌注后激活的神經元、膠質細胞以及浸潤的中性粒細胞均能釋放MMP-9。而MMP-9可以攻擊TJ蛋白和毛細血管基底膜,導致白細胞浸潤、血管源性水腫及BBB開放。同時中樞神經系統(tǒng)產生大量氧自由基,增加興奮性氨基酸釋放,增強血腦屏障的通透性[12]。吳捧蓮等[13]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后MMP-9表達升高,claudin-5表達降低,而PJ34可以通過抑制MMP-9表達,增加claudin-5表達來維持血腦屏障通透性,對I/R損傷有神經保護作用。Zehendner等[14]報導凋亡會通過降解occludin和Claudin-5而致TJ蛋白改變。與上述所有研究一樣,我們也發(fā)現(xiàn)腦缺血時MMP-9蛋白表達增加,說明MMP-9積極參與了缺血的病理過程。I/R后通過Tunel染色發(fā)現(xiàn)凋亡細胞增多,Occludin及Clau?din-5蛋白表達顯著下降。Occludin及Claudin-5表達減少使微血管完整性破壞,從而使BBB破壞,并可使缺血后大腦炎癥細胞因子滲透入腦[15]。結合Evansblue染色及含量測定結果,提示微血管完整性破壞,BBB破壞。
細胞連接是細胞間、細胞與細胞外基質之間的一些特化的連接裝置。神經細胞通過縫隙連接(gap junction,GJ)及化學突觸進行神經信息傳遞和轉導,實現(xiàn)細胞間的信息交流。神經細胞缺血后可通過GJ以“鈣波”形式改變周圍細胞內的鈣離子濃度,從而使缺血損傷蔓延[16]。研究表明,抑制GJ功能可以減輕腦缺血再灌注損傷[17]。腦組織中分布最廣泛的是CX43蛋白?;罨蟮男切文z質細胞通過CX43半通道釋放一系列物質作用于星形膠質細胞,釋放更多的炎癥物質和其它物質促進神經元死亡[18]。突觸是神經元之間信息交流的物質結構基礎,神經元突觸對腦缺血損傷極為敏感,可以導致突觸數(shù)目、結構及功能的變化,進而直接影響神經信息的傳遞。PSD95是突觸后致密物中的主要蛋白,與突觸活動、細胞內信號轉導及離子通道有關。研究表明腦缺血時PSD95直接參與了缺血信號的轉導,PSD95的改變直接影響突觸的傳遞功效,對突觸功能和神經元存活有明顯影響[19-20]。我們的研究同樣也證實了I/R后CX43蛋白表達明顯升高,PSD-95蛋白表達顯著降低,提示腦缺血后縫隙連接通道功能活化和突觸功能異常。
離子通道是神經信號發(fā)生和傳遞的基本單元,并可影響神經遞質的釋放、興奮性突觸后電位等。神經細胞通過它們進行神經信息傳遞和轉導,實現(xiàn)細胞間的信息交流。鈉通道是由α,β亞基組成的跨膜糖蛋白,鈉電流可引起細胞的去極化和傳導興奮,是細胞動作電位產生的結構基礎。缺氧時Na+內流持續(xù)增加導致細胞內Na+增多,引起繼發(fā)性鈣超載、興奮性氨基酸和自由基釋放增加,以及水和氯離子內流并使細胞腫脹,最終導致細胞損傷和壞死的級聯(lián)反應[21]。我們的研究證實I/R后Na+-α蛋白表達降低,提示Na+介導的電流中斷或失活,這可能是缺血后聽力損傷的可能機制之一。
因此,我們推測,在腦缺血再灌注導致聽皮層損傷及聽力受損的過程中,腦缺血激活炎性細胞因子及神經元、膠質細胞后,MMP-9表達上調,TJ蛋白和毛細血管基底膜破壞,BBB滲透性增加。同時缺血再灌注影響細胞周圍鈣離子濃度及興奮性氨基酸的釋放,影響細胞之間的縫隙連接、突觸及離子通道,進一步影響神經信息傳遞和轉導。但是,聽覺的形成是非常復雜的過程,ABR異常結果有可能受到其他因素影響,缺血對耳蝸的血供影響,血管紋、毛細胞等的異常,也會對ABR的閾值異常產生影響,聽覺系統(tǒng)的改變單獨用中樞或外周器官聽覺器官的損傷或結構改變來解釋并不能得到滿意的答復。腦缺血再灌注后聽力損傷,其機制是一個多環(huán)節(jié)、多途徑、多因素的級聯(lián)反應,每種因素并非是單獨存在,而是相互影響或互為因果。本研究只是對腦缺血再灌注后聽皮層的神經元的病理變化進行了初步探討,對于外周器官的變化,如耳蝸、毛細胞等等變化并未進行觀察,同時對于缺血再灌注后ABR不同頻率的聽閾、潛伏期改變及中樞傳導時間變化并未進行檢測,這將是我們下一步研究的重點。
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Auditory center injury after focalcerebral ischem ia-reperfusion injury in RATS
LVZhe,ZHANGYing,ZHANGYubo,SHIMeijuan,MENGQing,LUHong
DepartmentofOtolaryngology,Second HospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050000,China
LUHong Email:wx_900804@163.com
Objective To investigate themechanism of auditory center injury and hearing loss after focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in rats.M ethods Sixty healthy male adult SD rats were random ly divided into an ischemia-reperfusion(I/R)group and a sham operation group(n=30 in each group).For rats in the I/R group,themiddle cerebral artery occlusion(MCAO)modelwas established by suturing,w ith ischemia for 60mins followed by reperfusion for 24 hrs;while for those in the control group,only cervical vessels isolation was performed w ith no thread embolism inserted.The auditory brainstem response(ABR)was tested before and at24 hrs after operation,respectively.At24 hrs post-operation,neurological function,changes of water content in the brain(using dry-wetweightmethod)and infarct volume(using TTCmethod)weremeasured.The integrity of blood-brain barrier(BBB)was also evaluated by view ing exudation of Evans blue,and apoptosis of neurocyteswas exam ined by TUNEL to determ ine the apoptotic index(AI). Expression of MMP-9,Claudin-5,Occludin,PSD-95,CX-43 and Na+-αprotein were tested by Western blotting.Results Compared w ith the sham operation group,neurological function scores,infarct volume and water contentof brain were higherw ith elevated ABR thresholdsand AIin the I/R group.Expression ofMMP-9 and CX-43 proteinwas significantly up-regulated,while expression of Claudin-5,Occludin,PSD-95 and Na+-αprotein was significantly down-regulated.Conclusions Themechanism of hearing loss after focal cerebral ischem ia-reperfusion injury is perhaps related to MMPsactivation,BBB damage,gap junction activation,synaptic dysfunction and destruction of ion channels.
Ischemia-reperfusion injury;Blood-brain barrier;Gap junction;Matrix metalloproteinase-9;Ion channels
R764
A
1672-2922(2017)02-222-7
2017-02-02審核人:郭維維)
10.3969/j.issn.1672-2922.2017.02.016
呂哲,碩士,副主任醫(yī)師,耳聾及眩暈的基礎和臨床研究
路虹,Email:wx_900804@163.com