胃癌組織低氧誘導因子1α及受控基因與臨床病理特點的關系

郭飛波 楊勇

胃癌組織低氧誘導因子1α及受控基因與臨床病理特點的關系

郭飛波 楊勇

目的 探討胃癌組織低氧誘導因子1α（HIF-1α）及受控基因與臨床病理特點的關系。方法 收集87例胃癌患者胃黏膜組織樣本（胃癌組織）和癌旁非腫瘤黏膜上皮組織（癌旁組織），采用免疫組化染色檢測PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白陽性表達率，免疫印跡試驗檢測PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白相對表達量，實時定量聚合酶鏈反應檢測PFKFB3、PFKFB4、HIF-1 αmRNA相對表達量；分析PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α與胃癌患者臨床病理資料及生存預后的關系。結果 胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白表達陽性率高于癌旁組織（P＜0.05）；胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α 蛋白表達量分別為（2.09±0.17）、（2.33±0.21）、（2.16±0.18），高于癌旁組織（1.03±0.11）、（1.47±0.14）、（1.10±0.12）（P＜0.05）；胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α mRNA相對表達量分別為（1.21±0.17）、（1.41±0.18）、（1.32±0.15），高于癌旁組織（0.55±0.50）、（0.63±0.08）、（0.51±0.04）（P＜0.05）。腫瘤直徑≥4 cm、低分化胃癌、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達明顯升高（P＜0.05）。胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α陰性組累積3年生存率均高于PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α陽性組（P＜0.05）。結論胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α呈高表達，且表達水平與腫瘤大小、臨床分期、分化程度有關，三者可作為胃癌病情、預后的預測指標之一。

胃癌 低氧誘導因子1α 受控基因 病理 預后

胃癌是全世界范圍內(nèi)的高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居消化系統(tǒng)腫瘤的首位[1，2]。中國是胃癌的高發(fā)國家，發(fā)病率約占全球的30%[3]。近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在腫瘤發(fā)病中起關鍵作用。國外研究證實[4]，低氧反應元件（hypoxic response element，HRE）是HIF-1α調(diào)控的主要下游靶基因，生長活躍的腫瘤細胞因能量代謝相對不足而處于低氧狀態(tài)，此時腫瘤細胞會激活HIF-1α，誘導HRE表達上調(diào)，并調(diào)控一系列受控基因，使腫瘤細胞重新恢復能量供應。6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase，PFK-2/FBPase-2）是HIF-

1α的主要受控基因家族[5]，哺乳動物中有4種不同的PFK-2/FBPase-2同工酶，分別為PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4。Rovira等[6]報道PFKFB3、PFKFB4有類似癌基因調(diào)控元件的作用，能夠催化形成2，6-雙磷酸果糖，使腫瘤細胞重新獲得糖酵解的能量而加速生長。因此，本研究檢測胃癌組織HIF-1α及其受控基因PFKFB3、PFKFB4表達水平，分析PFKFB3、PFKFB4與胃

癌臨床病理特點的關系，旨在為胃癌的診斷、預防和治療提供參考信息，現(xiàn)將結果報告如下。

資料與方法

1 一般資料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，選擇2009年4月~2013年5月在醫(yī)院行手術治療的87例胃癌患者作為研究對象，男性59例，女性28例，年齡24～72歲，平均（56.1±5.3）歲。所有患者均經(jīng)病理學證實，其中腺癌71例，非腺癌16例；組織分型按照胃癌Lauren標準[7]分為彌漫型14例、腸型73例；病理分級：低分化43例，中分化29例，高分化15例；按照美國癌癥聯(lián)合委員會[8]（American Joint Committee on Cancer，AJCC）胃癌TNM標準分為Ⅰ～Ⅱ期組33例和Ⅲ～Ⅳ期組54例；浸潤深度pT1～2 24例，pT3～4 63例。

2 納入與排除標準 納入標準：①所有患者均經(jīng)病理學證實為胃癌，患者臨床資料完整；②患者均行手術治療，術后規(guī)律隨訪；③術中取組織樣本保存；④治療方案取得患者及家屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②術前接受過放療、化療等其他抗癌治療者；③合并有其他嚴重并發(fā)癥影響隨訪者。

3 主要試劑與儀器 主要試劑：RNeasy MineElute clanup kit、miScript II RT Kit、2×SYBR Green qPCR Mix均購自德國QIAGEN公司；蘇木素、伊紅染液購自上海信帆生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司；兔抗人PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗購自美國Sigma公司；Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司；PVDF膜、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自美國Santa Cruz公司。主要儀器：YS100普通光學顯微鏡購自日本尼康公司，凝膠成像系統(tǒng)及圖像分析軟件購自美國Bio-Rad公司，Real-time PCR儀購自瑞士Roche公司。

4 方法

4.1 樣本采集：所有患者均于術中切除胃癌黏膜組織（胃癌組織），同時配對切除距腫瘤組織大體切緣癌旁≥10 cm非腫瘤黏膜上皮組織（癌旁組織），所有組織樣本均于低溫時采集，并置液氮中保存待檢。

4.2 免疫組化染色（immunohistochemical staining，ICH）方法：取組織樣本，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度4 μm的切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟，PBS沖洗，加入3%H2O2甲醇液孵育5 min消除內(nèi)源性過氧化酶，再加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，微波抗原修復。滴加3%山羊血清封閉液體，37℃孵育10 min棄去封閉液；分別滴加兔抗人PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α單克隆抗體，4℃孵育24 h。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，焦磷酸二乙酯（DEPC）水洗，蘇木素復染，中性樹膠封片，鏡檢。結果判定：參考四分法半定量計分標準，活性細胞占比＜5%為0分，活性細胞占比5%～25%為1分，活性細胞占比26%～50%為2分，活性細胞占比51%～100%為3分，0～1分為蛋白表達陰性，2～3分為蛋白表達陽性。由2位病理科醫(yī)生采用盲法閱片，顯微鏡下隨機選擇10個視野，計算陽性細胞占比，取平均值。

4.3 免疫印跡試驗（Western Blot）方法：將組織樣本用手術剪盡可能剪碎，充分研磨，加入RIPA裂解液，置冰水浴上靜置50 min，再置于冷凍離心機中，4℃、12 000 r/min離心20 min，提取總蛋白。采用Bradford蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白含量。將50 μg總蛋白以100℃水浴變性3 min，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）40 V電泳2 h，30 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉1.5 h。按照1∶200比例用PBS稀釋PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α單克隆抗體，4℃孵育24 h。PBST稀釋液漂洗PVDF膜3次，5 min/次；再加入1∶2 000由PBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，7℃振搖孵育1 h，應用熒光分析系統(tǒng)對目的條帶進行分析，以GAPDH作為內(nèi)參照，目的條帶與GAPDH條帶積分吸光度值之比為目的蛋白相對表達量。

4.4 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法：取100 mg組織樣本，于液氮中充分研磨，按照Trizol試劑盒提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA純度。將約1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA合成體系：DEPC 3 μl，反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μl，RNA逆轉(zhuǎn)錄模板1 μl，dNTP 0.2 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μl，上下游引物各0.5 μl，加入雙蒸水將總反應體系補充至22 μl，37℃金屬浴反應60 min合成cDNA。將cDNA置于Real-time PCR儀進行擴增，擴增引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成（引物序列見表1）。PCR反應體系：2×SYBR Green qPCR Mix 9 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 1 μl，加入雙蒸水將總反應體系補充至20 μl。反應條件：96℃預變性2 min；95℃變性1 min，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；后72℃ 57 min；將PCR反應產(chǎn)物采用5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照進行校正，測量目的基因CT值，分析目的基因相對表達量。

5 隨訪 對87例乳腺癌患者的隨訪從術后第2天開始，截止日期為隨訪結束或患者死亡或失訪。

6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法分析PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α與臨床病理特點的關系；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-Rank test比較組間生存率的差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白在胃癌組織中的表達 免疫組化染色結果顯示：胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白表達陽性率顯著高于癌旁組織，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2、圖1。

表1 引物序列及擴增長度

表2 胃癌組織與癌旁組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α陽性表達（n，%）

圖1 PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白在胃癌組織中的表達（ICH，×200）

2 胃癌組織與癌旁組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白表達 Western Blot檢查結果顯示：胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α 蛋白表達量分別為（2.09±0.17）、（2.33±0.21）、（2.16±0.18），明顯高于癌旁組織（1.03±0.11）、（1.47±0.14）、（1.10±0.12），組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 胃癌組織與癌旁組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白表達

3 胃癌組織與癌旁組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α mRNA表達 RT-PCR試驗結果顯示：胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α mRNA相對表達量分別為（1.21±0.17）、（1.41±0.18）、（1.32±0.15），明顯高于癌旁組織（0.55±0.5）、（0.63±0.08）、（0.51±0.04），組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

4 PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達與臨床病理特點的關系 胃癌患者PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白陽性表達與年齡、性別、病理類型、Lauren分型、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移等臨床病理資料無關（P＞0.05）；腫瘤直徑≥4 cm 胃癌患者PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白陽性表達率明顯高于腫瘤直徑＜4 cm者，低分化胃癌患者PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白陽性表達率明顯高于中、高分化者，Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白陽性表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期者，各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

圖3 胃癌組織與癌旁組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α mRNA表達

表3 PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達與臨床病理特點的關系

5 PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達與生存預后的關系 本研究隨訪截止至2016年5月31日，中位隨訪時間38.9個月。生存曲線分析顯示，PFKFB3陰性累積3年生存率為61.3%（95%CI：15.2%～31.0%），高于PFKFB3陽性累積3年生存率（38.1%，95%CI：20.2%～41.3%）（P＜0.05）（圖4A）；PFKFB4陰性累積3年生存率為58.7%（95%CI：14.4%～26.0%），高于PFKFB3陽性累積3年生存率（36.7%，95%CI：22.0%～45.8%）（P＜0.05）（圖4B）；HIF-1α陰性累積3年生存率為57.3%（95%CI：22.3%～34.3%），高于HIF-1α陽性累積3年生存率（30.5%，95%CI：30.9%～41.3%）（P＜0.05）（圖4C）。

討 論

圖4 胃癌患者生存曲線

惡性腫瘤細胞在氧氣和營養(yǎng)供應不足條件下，細胞糖酵解代謝功能活躍，這種特殊的化學表型被稱為Warburg效應。目前研究證實[9]，Warburg效應在腫瘤的生長、分化、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關鍵作用。Giang等[10]報道證實，抑制了惡性腫瘤的Warburg效應，能夠顯著改善患者的預后。與正常細胞線粒體依賴的糖分解相比，腫瘤細胞糖酵解產(chǎn)能率較低，導致腫瘤細胞因能量供應不足而處于相對低氧狀態(tài)，腫瘤細胞啟動自身的一系列生化反應，從而使細胞適應代謝的需求。HIF-1α是目前研究較多的一種低氧誘導因子，在維持惡性腫瘤細胞的高能量代謝適應過程中發(fā)揮重要作用。Ardyanto等[11]報道稱細胞低氧狀態(tài)能夠激活HIF-1α信號通路，誘導HRE高表達，并通過調(diào)控一系列下游靶基因，使細胞重新獲得能量供應。Langer等[12]證實HIF-1α是通過其受控基因調(diào)節(jié)代謝相關酶、生長因子等表達，其中PFK-2/ FBPase-2是HIF-1α最重要的受控基因之一。

PFK-2/FBPase-2調(diào)節(jié)糖酵解激酶超家族，包括肌酐激酶、磷酸果糖激酶、腺苷激酶等，能夠調(diào)控多條糖酵解通路，維持細胞的能量供應[13]?；蚪M研究證實[14]PFK-2/FBPase-2共有4種同工酶，分別為PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4。Novellasdemunt等[15]發(fā)現(xiàn)PFK-2/FBPase-2的4種同工酶均具有缺氧瞬即反應，即當細胞缺氧時能夠啟動缺氧反應元件，增強細胞的糖酵解，導致細胞乳酸含量增加而誘導細胞增殖，且這種效應可能與腫瘤進展有關。在4種同工酶中，PFKFB3、PFKFB4與胃癌密切相關。代偉偉等[16]采用免疫組化染色法比較了胃癌、肺癌、結腸癌和正常組織PFKFB3、PFKFB4表達情況，結果顯示胃癌組織PFKFB3、PFKFB4表達顯著高于肺癌、結腸癌和正常組織，但是在肺癌、結腸癌和正常組織中表達差異并無統(tǒng)計學意義，提示PFKFB3、PFKFB4對胃癌組織具有高選擇性。本研究顯示，胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α mRNA和蛋白表達水平均高于癌旁組織，提示胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α異常高表達。動物實驗模型證實[17]，沉默HIF-1α表達能夠抑制腫瘤的生長。原位雜交檢測結果也證實[18]HIF-1α mRNA在胃癌細胞中異常高水平，并且這種高表達水平與高糖酵解代謝相關。

本研究顯示，PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白陽性表達與年齡、性別、病理類型、Lauren分型、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移等臨床病理資料無關，腫瘤直徑34 cm、低分化胃癌、Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達明顯升高，提示PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α主要參與胃癌的發(fā)生和進展。隨著腫瘤細胞的增加，其對代謝的需求更高，此時需要更充足的能量供應。Shioya等[19]報道腫瘤細胞的高糖酵解途徑雖然不是獲得能量的主要方式，但是可以代償性的解決腫瘤細胞缺氧和低能量供應狀態(tài)，從而維持腫瘤細胞的快速生長。這也提示PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α可以作為預測腫瘤病情和預后的指標之一。國外有學者提出[20]，可以將HIF-1α作為胃癌治療的一個作用靶點，通過抑制HIF-1α表達，使腫瘤細胞的能量供應受阻，導致細胞壞死凋亡。本研究對不同PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達水平的胃癌患者生存情況進行分析，結果顯示PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α陽性表達組3年生存率均明顯低于PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α表達陰性組，提示PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α可以作為胃癌不良預后的預測指標。

綜上所述，胃癌組織PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α呈高表達，且表達水平與腫瘤大小、臨床分期、分化程度有關，三者可以作為胃癌病情、預后的預測指標之一。

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Relationship between Hypoxia Inducible Factor 1α，and its Controlled Genes and Clinical Pathological Characteristics in Gastric Carcinoma

GUO Fei-bo，YANG Yong.
Department of Laboratory Medicine，The First People's Hospital of Tianmen，Hubei 431700

Objective To explore the relationship between hypoxia inducible factor 1α，its controlled genes and clinical pathological characteristics in gastric carcinoma. Methods A total of 87 cases of gastric carcinoma patients gastric mucosa tissue samples （gastric cancer tissue） and adjacent non tumor mucosa epithelial tissue （adjacent issue） were collected，PFKFB3，PFKFB4，HIF-1α protein positive rate were detected by immunohistochemical staining，PFKFB3，PFKFB4，HIF-1α protein relative expression was detected by Western blot assay，PFKFB3，PFKFB4，HIF-1α mRNA relative expression was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction. The relationship between PFKFB3，PFKFB4，HIF-1α and clinical pathological data and survival prognosis were analysed. Results The positive rate （exactly number?） of PFKFB3，PFKFB4 and HIF-1α protein expression in gastric carcinoma was significantly higher than that in the adjacent tissues （P<0.05）.The expression level of PFKFB3，PFKFB4 and HIF-1α protein was （2.09±0.17），（2.33±0.21），（2.16±0.18），was significantly higher than that in adjacent tissues（1.03±0.11），（1.47±0.14），（1.10±0.12）（P<0.05）.The expression level of PFKFB3，PFKFB4 and HIF-1α mRNA was （1.21±0.17），（1.41±0.18），（1.32±0.15），was significantly higher than that in adjacent tissues（0.55±0.5），（0.63±0.08），（0.51±0.04）（P<0.05）.Tumor diameter34cm，poorly differentiated gastric cancer，Ⅲ～Ⅳ stage gastric cancer patients PFKFB3，PFKFB4，HIF-1 expression was significantly increased （P<0.05）.The cumulative 3 year survival rate of PFKFB3，PFKFB4 and HIF-1α negative group was significantly higher in gastric carcinoma than that in PFKFB3，PFKFB4 and HIF-1α positive group （P<0.05）.Conclusion The expression level of PFKFB3，PFKFB4 and HIF-1 are highly expressed in gastric carcinoma，and the expression level was related to tumor size，clinical stage and differentiation degree，three of them can be used as predictors for the prognosis of gastric cancer.

Gastric carcinoma Hypoxia inducible factor 1α Controlled gene Pathology Prognosis

R735.2 R446.8

A

1671-2587（2017）03-0265-07

2016-12-15）

（本文編輯：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.016

431700 湖北省天門市第一人民醫(yī)院檢驗科

郭飛波（1980–），男，湖北天門人，主管技師，主要從事病毒免疫與分子病毒學工作，（Tel）13117118657（E-mail）guofeibo1980@163.com。