彩色羧基熒光微球的制備

張小燕 周齊洋 江蘇省醫(yī)療器械檢驗所 （南京 210012）

彩色羧基熒光微球的制備

張小燕 周齊洋 江蘇省醫(yī)療器械檢驗所 （南京 210012）

采用活性溶脹種子無皂乳液聚合法制備了表面修飾有羧基的彩色且在特定激發(fā)下釋放熒光的聚苯乙烯微球。采用乳液聚合首先制備尺寸均一的苯乙烯納米小球作為可溶脹活性種子，采用丙烯酰化的染料分子作為共聚單體，從而制備得到有色苯乙烯微球。所得到的有色微球進一步作為種子，通過溶脹法負載稀土配合物進行熒光標記，并再次通過乳液聚合使其包裹在微球內(nèi)。為了便于生物分子偶聯(lián)，在聚合過程中引入甲基丙烯酸作為功能化共聚單體，從而使所得微球表面被羧基功能化。

標記 無皂乳液聚合 彩色 熒光 羧基化

聚合物微球因其形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粒徑分布窄、比表面積大、表面吸附性強等特點在生命科學、生物醫(yī)學等領(lǐng)域得到廣泛的應用，如細胞表面抗原檢測，血流分析，吞噬功能檢測，凝集試驗為代表的診斷檢測，藥物篩選等[1-3]。聚合物微球本身為白色，對比度不強，不易被檢測，但對微球進行染料或熒光標記，成為帶有色彩或熒光信號的微球時，易于檢測。尤其是對基于聚苯乙烯微球的膠乳凝集試驗，有色微球更易于觀察，從而大大提高檢測的靈敏度[4]。通過控制有色染料或熒光物質(zhì)的量，可制備出彩色或熒光強度編碼的微球，這樣的信號編碼微球為抗原分型、藥物篩選等高通量檢測提供了一種高效便捷的手段[5-6]。例如，聶書明教授課題[7]組用兩種不同顏色的量子點摻雜在樹脂微球中，通過控制每種顏色量子點的用量制備出30種不同比例的熒光微球，在不同的微球表面修飾特定的抗體/抗原，就可以通過混合微球?qū)崿F(xiàn)對靶標分子的高通量篩選。目前大多選用有機熒光染料分子，通過物理吸附、包覆，化學嫁接到微球表面或者以熒光染料分子為共聚單體，以共聚的方式固定到微球，制得熒光編碼微球[8-10]。但是傳統(tǒng)的有機熒光分子由于熒光發(fā)射峰寬而不對稱，不同熒光分子之間易因發(fā)射峰重疊而造成干擾，在一定程度上限制了熒光編碼微球的應用。部分稀土元素，因其熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、光穩(wěn)定性好、發(fā)射峰窄、熒光壽命長等優(yōu)點，被廣泛應用于生物成像、生物分子檢測等研究領(lǐng)域[11-13]。另一方面，為了進一步豐富微球的可編碼范圍，同時減少因摻雜多種稀土配合物而造成各熒光信號減弱的影響，熒光與可見色彩搭配組合可提供一種新的思路。

在此，我們分別以蘇丹紅Ⅰ和Eu為色彩染料和熒光標記物，用以驗證制備這種雙重標記的聚苯乙烯微球的方法。蘇丹紅Ⅰ在溶液中呈橙黃色，而Eu在360nm紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。通過兩次溶脹種子無皂乳液聚合，制備出顯橙黃色且在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光的聚苯乙烯微球。我們相信通過控制不同標記物的量，將可獲得容量巨大的編碼微球庫。

1.材料與方法

1.1 一般資料

苯乙烯、二乙烯基苯、購自Acros公司，堿洗除阻聚劑后減壓蒸餾；菲-9-甲酸甲酯、9-乙酰菲、過硫酸銨、蘇丹紅Ⅰ、丙烯酰氯，領(lǐng)苯二甲酸正丁酯（DBP）、均購于Sigma-Aldrich公司；六水合三氯化銪（EuCl3·6H2O），購于魚臺縣清達精細化工廠；氨基鈉、三氯甲烷、四氫呋喃（THF），鄰菲羅啉（phen）、硅膠層析柱、苯、己烷，均購于阿拉丁公司；鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基磺酸鈉（SDS），購于北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；以上材料均為分析純。日立S4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡；上海棱光技術(shù)有限公司970 CRT熒光分光光度計；上海讓奇T-6紫外吸收分光光度計，英國馬爾文Zetasizer Nano ZSP納米粒度電位儀。

1.2 方法

1.2.1 聚苯乙烯種子微球的制備。通過無皂乳液聚合法制備聚苯乙烯微球：在帶有冷凝管、機械攪拌器的500mL三口瓶中加入200mL水和10mL精制苯乙烯，通入氮氣加熱攪拌；水浴升溫至75?C時，加入引發(fā)劑過硫酸銨（APS）（100mg過硫酸銨溶于5mL純水中），繼續(xù)攪拌反應20h，得到均一的白色乳液即為聚苯乙烯微球（PSt）。產(chǎn)物離心收集，超純水水清洗6次，最后超聲重懸水中，采用差重法測定固含量。

1.2.2 彩色聚苯乙烯微球的制備。可聚合彩色染料單體丙烯?；K丹紅Ⅰ（Acrylated Sudan，AS）根據(jù)文獻[4]報道的方法制得。根據(jù)文獻[4,14,15]報道的方法，采用活性溶脹種子聚合法制備橙黃色聚苯乙烯微球。DBP與0.25%的SDS水溶液混合，超聲至均勻乳液，將聚苯乙烯種子微球置于DBP乳液中在30?C水浴中攪拌溶脹24h。然后把含有苯乙烯（St）、二乙烯基苯（DVB）、可聚合染料單體AS的乳液加到種子懸浮液中，攪拌溶脹24h?；旌弦涸诘獨獗Ｗo下攪拌升溫至75?C，溫度穩(wěn)定后，加入引發(fā)劑APS，聚合24h，產(chǎn)物通過離心收集并用乙醇和水洗4次。

1.2.3 羧基熒光微球的制備。稀土Eu配合物根據(jù)文獻報道[16]制得。在濃度為20mg/mL的PSt乳液中加入SDS溶液，使其終濃度為0.25%wt。稱取60mg Eu配合物，溶于1mL苯乙烯中，并加入至50mL PSt懸浮液，超聲乳化后，避光機械攪拌48h，通入N2，升溫至75?C，加入300mg過硫酸銨進行聚合反應。反應2h后，補加1mL St和0.3mL甲基丙烯酸（MAA），繼續(xù)反應6h。結(jié)束反應后離心收集產(chǎn)物，洗滌6次，即為羧基熒光微球。樣品進行噴金處理，通過掃描電子顯微鏡（SEM）進行觀察，微球表面電荷通過zeta電位進行測定，檢測時，取微球懸浮于水中并充分稀釋。每個樣品測三次，取平均值。

1.2.4 羧基熒光膠乳表面羧基含量測定。在聚合過程中引入甲基丙烯酸，微球表面被羧基功能化，使微球能與生物分子偶聯(lián)。羧基的含量用電導率法測得[17]：取一定量聚苯乙烯微球懸浮液，加入一定量的0.01M的NaOH溶液中和微球表面羧基，使其pH為11左右，在磁力攪拌下用0.01M的HCl溶液返滴定，直到樣品的pH為3結(jié)束，計算羧基含量。

2.結(jié)果與討論

雙重編碼微球的制備路徑如圖1所示，通過無皂乳液聚合制備尺寸均一的苯乙烯納米小球作為可溶脹活性種子，然后采用丙烯?；奶K丹紅Ⅰ作為共聚單體，制備橙黃色苯乙烯微球。將所得微球作為種子，溶脹負載稀土配合物進行熒光標記，通過乳液聚合使其包裹在微球內(nèi)。

圖1. 表面羧基功能化的彩色熒光微球的制備路徑示意圖

圖2. (a)蘇丹紅Ⅰ的紫外-可見吸收光譜；(b)Eu配合物的紫外-可見吸收光譜；(c)Eu配合物的熒光光譜。

圖3. (a)聚苯乙烯種子微球，(b)蘇丹紅標記彩色微球，(c)經(jīng)雙重標記的熒光微球的SEM照片。照片中scalebar長度為300nm。

圖4. 聚苯乙烯微球在水中的zeta電位：(a)蘇丹紅標記的彩色微球，(b)雙重標記的熒光微球。

蘇丹紅Ⅰ是一種顏色鮮艷的油溶性染料，固體呈紅色，在低濃度溶液中呈橙黃色，常被用作汽油、機油、鞋油、蠟等產(chǎn)品的染色。如圖2a所示，蘇丹紅Ⅰ在470nm左右有最大吸收，而稀土Eu配合物在這一波長沒有吸收（圖2b），Eu配合物在600nm以上有狹窄的熒光發(fā)射峰，最強熒光在615nm左右（圖2c）。選用蘇丹紅Ⅰ和Eu配合物的組合，不會因為紫外吸收譜的重疊產(chǎn)生干擾，同時也避免了蘇丹紅Ⅰ的吸收譜和Eu配合物的發(fā)射譜重疊而導致熒光減弱。因此，由這兩種物質(zhì)標記制得的微球可以采用470nm處紫外吸收強度（蘇丹紅Ⅰ）和615nm處熒光強度作為兩組檢測信號。通過控制二者的比例，可制得編碼微球。

聚苯乙烯種子微球、丙烯?；K丹紅Ⅰ標記橙黃色微球以及蘇丹紅和Eu配合物雙重標記的熒光微球的SEM照片分別如圖3（a）、（b）、（c）所示。所制備的種子微球直徑約為150nm，第一次溶脹并聚合后微球直徑約為200nm，第二次溶脹并進行乳液聚合后，微球直徑增加到約260nm。SEM照片表明，在最優(yōu)條件下制備的微球表面光滑，球形形貌均勻，尺寸均一。隨著種子溶脹乳液聚合的進行，微球尺寸分布有所變化，但整體單分散性仍較好。

微球分散在水中后，通過zeta電位進行表征，其結(jié)果如圖4所示。在第二次種子聚合引入共聚單體甲基丙烯酸（MAA）前，微球的zeta電位為-25mV，這是由于引發(fā)劑為陰離子型自由基，引發(fā)劑過硫酸銨在分解后產(chǎn)生的陰離子結(jié)合在聚合物末端，并暴露在聚合物微球表面所致。在引入MAA后，微球的zeta電位降低到約-60mV，表明表面所帶負電荷明顯增多。

圖5. 電導率法測定熒光微球表面羧基含量

為了定量測定微球表面羧基的密度，采用電導滴定法對所制備的微球進行測定，滴定曲線如圖5所示[18]。滴定初期（階段Ⅰ），HCl中和樣品懸浮液中的過量NaOH，逐步消耗的OH-電導率比Cl-強，從而使整個體系的電導率下降。HCl完全中和游離的NaOH時，體系的電導率達到最低。繼續(xù)滴加HCl，其中的H+與微球表面的COO-結(jié)合使其質(zhì)子化生成弱酸。這一階段由于HCl滴加而引入的Cl-流動性比帶電微球大，從而使整個體系電導率有所增加，這一階段電導率曲線相對比較平緩（階段Ⅱ）。當乳液體系中的COO-都已經(jīng)質(zhì)子化形成COOH后，繼續(xù)滴加HCl將直接導致體系電導率上升（階段Ⅲ）。

聚合物微球表面羧基含量根據(jù)公式（1）進行計算所得約為1.2mmol/mg。

3.結(jié)論

本文分別以蘇丹紅Ⅰ和Eu為色彩染料和熒光標記物，通過兩次溶脹種子無皂乳液聚合成功制備出有色染料和熒光物質(zhì)雙重標記的表面羧基功能化的聚苯乙烯微球。微球在無激發(fā)光激發(fā)的狀態(tài)下呈現(xiàn)橙黃色，而360nm紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。兩種標記物分別可提供470nm處紫外吸收和615nm處熒光作為檢測信號。我們有理由相信，通過控制兩種標記物的含量，可以制備出雙重信號編碼的功能化微球，為生物分子檢測、藥物篩選等領(lǐng)域研究提供有力工具。

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The Preparation of Colorfulcarboxyl Fluorescent Microsphere

ZHANG Xiao-yan ZHOU Qi-yang Jiangsu Province Medical Instrument Testing Institute (Nanjing 210012)

In this paper we report the preparation of colored polymer beads that possess carboxyl groups on the surface and emit fuorescence under excitation by UV with specifc wavelength, through active swollen seeds based soap-free emulsion polymerization. Uniform polystyrene nano-spheres are frstly synthesized by emulsion polymerization and utilized as swellable seeds, onto which the co-polymerization of styrene and acrylated dye molecules produces colored polystyrene beads.The as-obtained polymer beads then act as seeds for loading of rare earth ion Eu complex and the following polymerization to encapsulate the Eu complex as well as incorporation of carboxyl group to facilitate coupling of biomolecules.

encoded, soap-free emulsion polymerization, colored, fuorescent, carboxylate

1006-6586(2017)09-0045-04

TQ325.2

A

2017-03-09