抑制素基因疫苗及其在提高單胎家畜繁殖力方面的研究進(jìn)展

于垚垚，劉深賀，王力軍，王亞平，劉文浩，楊利國(guó)

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

抑制素基因疫苗及其在提高單胎家畜繁殖力方面的研究進(jìn)展

于垚垚，劉深賀，王力軍，王亞平，劉文浩，楊利國(guó)

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

本文就抑制素基因疫苗的發(fā)展歷程、免疫效果的影響因素以及其在提高單胎動(dòng)物繁殖力方面的應(yīng)用研究進(jìn)行文獻(xiàn)綜述,為促進(jìn)抑制素基因疫苗的深入研究與推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

抑制素；基因疫苗；繁殖力；單胎家畜

抑制素主要是由雌性動(dòng)物的卵巢顆粒細(xì)胞以及雄性動(dòng)物睪丸支持細(xì)胞所分泌的一種糖蛋白激素，其主要生理功能是抑制促卵泡素（FSH）的合成與分泌，從而降低循環(huán)血液中的FSH水平[1]。而抑制素基因免疫是將克隆有抑制素抗原基因的真核表達(dá)載體導(dǎo)入宿主體內(nèi)，利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)表達(dá)出抑制素抗原蛋白，從而激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗抑制素的抗體，中和外源和內(nèi)源性的抑制素，釋放對(duì)FSH合成和分泌的抑制作用，促進(jìn)卵泡發(fā)育，增加排卵率，并最終達(dá)到提高動(dòng)物繁殖力的效果。由于抑制素基因疫苗能夠增加排卵率與雙胎率，因而在提高單胎動(dòng)物雙胎率進(jìn)而提高其繁殖力方面具有重大意義[2]，同時(shí)由于基因疫苗具有制備簡(jiǎn)單、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸以及能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間的免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，因而眾多的研究者對(duì)抑制素基因免疫進(jìn)行了深入的研究。

1 抑制素基因疫苗的研究進(jìn)展

抑制素基因疫苗的研究始于1998年，由楊利國(guó)教授指導(dǎo)的兩名博士研究生王進(jìn)榮和姜?jiǎng)灼酵瑫r(shí)開展研究。王進(jìn)榮[3]綜合分析了抑制素α亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)、兩種抗原表位、親水性曲線等，發(fā)現(xiàn)N端1-26或1-32、63-82、103-122可能包括抑制素α亞基的抗原表位?？紤]到抗原值、親水性及較多的Pro易形成coil結(jié)構(gòu)，故取N端1-32或63-82為半抗原。姜?jiǎng)灼降萚4]在此基礎(chǔ)上將抑制素α亞基N端1-32肽基因克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建了抑制素基因疫苗pINH，免疫小鼠后抗體陽(yáng)性率為30%，加強(qiáng)免疫后抗體陽(yáng)性鼠的FSH水平顯著升高。為了提高抑制素基因疫苗的免疫效果，茆達(dá)干等[5]將抑制素基因融合于乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的3端，并克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建了單拷貝的抑制素基因疫苗pcIS，用該疫苗免疫大鼠后，一次加強(qiáng)免疫后抗體陽(yáng)性率可達(dá)到38.9%～50%，二次加強(qiáng)免疫后抗體陽(yáng)性率可達(dá)到55.6%。隨后，曹少先等[6]利用表位串聯(lián)的原理將抑制素α亞基N端1-32肽基因插入質(zhì)粒pcIS乙肝表面抗原第112～113氨基酸殘基密碼子之間構(gòu)建了雙拷貝的抑制素基因疫苗pcISI，免疫大鼠后，第6、8周抗體陽(yáng)性率均達(dá)到了83.3%，且抗體陽(yáng)性率在第2～6周均高于pcIS組，這表明雙拷貝的抑制素基因疫苗具有更高的免疫原性。為了構(gòu)建與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP）相融合的雙抑制素基因疫苗，曹少先[7]又將雙拷貝抑制素基因疫苗pcISI中的ISI片段融合于pEGFP—N1中EGFP基因的5’端，構(gòu)建了雙拷貝的抑制素基因疫苗pEGISI，這為研究抑制素基因疫苗的免疫機(jī)理提供了重要基礎(chǔ)，同時(shí)由于該質(zhì)粒以卡納青霉素為選擇壓力，大大降低了由氨芐青霉素為選擇壓力而導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

隨后吳結(jié)革等[8]又將具有免疫增強(qiáng)作用的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage Colony-stimulating factor, GM-CSF）分別插入雙拷貝的抑制素基因疫苗pcISI和pEGISI,成功構(gòu)建了GMCSF與抑制素融合表達(dá)質(zhì)粒pCGMISI和pEGMISI，為研究GM-CSF基因在抑制素基因疫苗中的免疫增強(qiáng)作用奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步提高抑制素基因疫苗的免疫效果，韓麗等[9]又將具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的牛孢疹病毒I型（Bovine Herpesvirus 1，BHV-1）VP22基因插入雙拷貝的抑制素基因疫苗pEGISI，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGISI-VP22，并用該質(zhì)粒免疫小鼠，結(jié)果表明VP22確實(shí)能夠增強(qiáng)抑制素基因疫苗的免疫原性。

為了提高疫苗的安全性，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，韓麗等[10]將平衡致死系統(tǒng)引入抑制素基因疫苗，將pCIS質(zhì)粒中的IS序列分別插入到不含抗性基因的真核表達(dá)載體pVAX-asd與pYA3493中，構(gòu)建了不含抗性基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-asd-IS與pYAIS，并轉(zhuǎn)入asd 和crp雙缺失的豬霍亂減毒沙門氏菌中，構(gòu)建了重組菌C501（pVAX-asd-IS）和C501（pYAIS），這樣不但提高了抑制素基因疫苗的安全性，還為抑制素基因疫苗提供了更多的免疫途徑。

為了更有效地提高動(dòng)物的繁殖力，本實(shí)驗(yàn)室淡新剛等又將與抑制素具有相似功能的RF酰胺肽（RF-amide related peptide，RFRP）引入抑制素基因疫苗。他們先將豬源INH α（1-32）連接到乙肝表面抗原S基因C末端，合成SINH；又將牛源RFRP-3 基因連接到乙肝表面抗原S基因C末端，合成SRFRP。最后將SINH和SRFRP基因片段分別插入到 pIRES 真核表達(dá)載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建抑制素和促性腺激素抑制激素共表達(dá)質(zhì)粒p-SINH/SRFRP。同時(shí)由于組織纖溶信號(hào)肽（tissue plasminogen activator，TPA）序列能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，因而，淡新剛等又將TPA序列插入共表達(dá)質(zhì)粒目的基因的N-端，構(gòu)建了信號(hào)肽共表達(dá)質(zhì)粒p-TPA-SINH/TPASFRFP[11]。

2 抑制素基因疫苗免疫效果的影響因素

2．1 給藥方式

基因疫苗有多種給藥方式，如注射（肌肉、皮下、靜脈）、口服和鼻飼等[12]。但抑制素基因疫苗主要以肌肉注射方式居多，韓麗等分別采用口服和肌肉注射方式免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是肌肉注射還是口服均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1和Th2型免疫反應(yīng)，但肌肉注射的免疫效果更好，且能提高產(chǎn)仔數(shù)[10]。

2．2 免疫劑量

免疫劑量也是影響抑制素基因免疫的主要因素。用無(wú)抗性基因的抑制素真核表達(dá)質(zhì)?；蛞呙?重組菌C500(pXAIS))免疫奶牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量免疫組子宮孕角復(fù)舊時(shí)間短于對(duì)照組，且達(dá)到了顯著水平[13]。而其用0.75、1.5、2.25、3.0mg的pcISI質(zhì)粒免疫肉牛及南陽(yáng)黃牛，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)2.25mg的免疫劑量最佳[14,15]。而姜衛(wèi)星等的研究結(jié)果也證明抑制素基因疫苗pCISI的最佳免疫劑量是2.25mg[16]。

2．3 免疫佐劑

有多種免疫佐劑可以增強(qiáng)抑制素基因疫苗的免疫效果。王水蓮[17]比較了免疫佐劑脂質(zhì)體與普魯卡因的免疫增強(qiáng)效果，結(jié)果表明，普魯卡因顯著優(yōu)于脂質(zhì)體。隨后郭憲等[18]利用串聯(lián)抑制素重組質(zhì)粒pcDNA-DPPISSDINH和pcDNA-DPPISSDINH-sC3d3分別免疫綿羊，結(jié)果表明，佐劑sC3d具有免疫增強(qiáng)作用，能夠提高抑制素基因疫苗的免疫效果。茆達(dá)干等[19]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌DNA和gm-csf能夠增強(qiáng)抑制素基因疫苗的免疫效果。

2．4 免疫次數(shù)和免疫間隔

免疫次數(shù)對(duì)抑制素基因疫苗免疫效果的影響也不盡相同，大部分的研究結(jié)果均表明加強(qiáng)免疫能夠提高抑制素基因疫苗的免疫效果。但是韓麗以及梁愛心等的研究結(jié)果卻表明，免疫次數(shù)的增加并沒有提高基因疫苗的免疫效果，相反只免疫一次的效果更好[10,20]。免疫間隔也與抑制素基因疫苗的免疫效果息息相關(guān)，目前有關(guān)文獻(xiàn)中的免疫間隔一般為14、21及28d等，但有關(guān)免疫間隔對(duì)免疫效果的影響還未見報(bào)道。

3 應(yīng)用抑制素基因免疫技術(shù)提高單胎家畜繁殖力的研究進(jìn)展

3．1 應(yīng)用抑制素基因免疫技術(shù)提高羊繁殖力的研究進(jìn)展

郭憲等用抑制素基因疫苗首次免疫綿羊以后，F(xiàn)SH水平高于對(duì)照組，而后在2次和3次免疫后FSH水平達(dá)到顯著水平，且2次免疫后LH、E2、P等激素也高于對(duì)照組，3次免疫后，E2和P顯著高于對(duì)照組，最終免疫綿羊后雙羔率最高可達(dá)到30.0%，顯著高于對(duì)照組[21]。而張德坤等的研究結(jié)果卻表明，抑制素基因疫苗pCIS免疫能夠影響母羊FSH的分泌水平，而對(duì)雌激素和孕激素則無(wú)顯著影響[22]。同時(shí)，張德坤等用抑制素基因疫苗pCIS免疫母羊，雙胎率可達(dá)到39.2%，顯著高于對(duì)照組[23]。淡新剛等分別用質(zhì)粒p-TPA-SINH/TPA-SRFRP、p-SINH/ SRFRP和p-SINH免疫綿羊，結(jié)果表明，三種疫苗均能誘發(fā)明顯的免疫反應(yīng)，且第3次免疫后20d，p-TPASINH/TPA-SRFRP免疫組的FSH和LH水平最高。三個(gè)試驗(yàn)組最終母羊的雙羔率分別為37.5%、37.5%和12.5%[11]。

3．2 應(yīng)用抑制素基因免疫技術(shù)提高牛繁殖力的研究進(jìn)展

姜衛(wèi)星等[16]用雙拷貝的抑制素基因疫苗pCISI免疫南陽(yáng)黃牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制素抗體水平與黃體發(fā)育水平息息相關(guān)，抗體陽(yáng)性牛兩側(cè)黃體明顯比抗體陰性牛大。而王水蓮等[24]的研究結(jié)果表明，抑制素基因免疫可以增加大卵泡、小卵泡、成熟卵泡數(shù)量以及卵泡總數(shù)量，同時(shí)也可以增加成熟卵泡與黃體直徑，他們還發(fā)現(xiàn)抑制素抗體水平與成熟卵泡大小和黃體大小具有很強(qiáng)的相關(guān)性。崔先利等[25]的研究結(jié)果表明，抑制素基因疫苗pCISI能夠促進(jìn)雙大卵泡發(fā)育、誘發(fā)排雙卵并能誘發(fā)黃牛孿生。夏迪等[26]的研究還表明，非抗性篩選的抑制素基因疫苗還能促進(jìn)奶牛產(chǎn)后子宮復(fù)舊，同時(shí)還可以提升奶牛的泌乳性能。

4 結(jié)束語(yǔ)

動(dòng)物的繁殖力是指動(dòng)物維持其正常生殖機(jī)能，繁育后代的能力。在畜牧生產(chǎn)中，繁殖力的高低直接影響畜牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，因而提高動(dòng)物繁殖力具有十分重大的意義，特別是對(duì)于繁殖周期較長(zhǎng)的單胎家畜如牛羊等。而抑制素基因疫苗的發(fā)展歷程是免疫原性不斷提升、安全性不斷改善以及免疫程序不斷完備的過(guò)程，隨著科技的不斷發(fā)展和眾多研究者的不懈努力，我們有理由相信抑制素基因疫苗必將大規(guī)模應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)實(shí)踐。

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Progress of Inhibin Gene Vaccine and Its Effects on Singletons Livestock Fertility

YU Yao-yao, LIU Shen-he, WANG Li-jun, WANG Ya-ping, LIU Wen-hao, YANG Li-guo
(Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Education Ministry of China, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

This paper elaborates on the development course of inhibin gene vaccine,the factors influencing its effects and its application on the improvement of singletons livestock fertility. And the objective of this paper is to provide basis for the better application of inhibin gene vaccine in livestock production practice.

Inhibin; Gene vaccine; Singletons livestock; Fertility

S823.3

A

1004-4264（2017）05-0016-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.005

第二屆“牛人”攝影大賽作品 《秋意下的Hamra牧場(chǎng)》——熊倩 利拉伐

2016-12-08

于垚垚（1991-），山西晉城人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物生殖生理與生物技術(shù)的研究。

楊利國(guó)，教授。