甜葉菊毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質(zhì)積累的影響

鄒 凱，劉澤波，陳繼光，尹忠平*，上官新晨，許小向

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

甜葉菊毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質(zhì)積累的影響

鄒 凱，劉澤波，陳繼光，尹忠平*，上官新晨，許小向

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

以發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060誘導(dǎo)甜葉菊毛狀根，建立毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類物質(zhì)體系，研究茉莉酸甲酯對綠原酸類化合物積累的影響。經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060侵染的甜葉菊葉片外植體，共培養(yǎng)14 d后產(chǎn)生毛狀根。聚合酶鏈式反應(yīng)檢測結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的rolB和rolC基因已成功整合到甜葉菊毛狀根基因組中。MS液體培養(yǎng)基較B5、WPM更利于甜葉菊毛狀根生長及綠原酸類物質(zhì)的積累，培養(yǎng)35 d后，干質(zhì)量增加約30 倍，綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩嶙罡吆糠謩e為3.47、11. 47、3.04 mg/g。毛狀根在MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第3周時分別添加15、45、100 μmol/L的茉莉酸甲酯進行誘導(dǎo)，處理后第1、2、4、8天收獲，毛狀根的生長量和綠原酸類物質(zhì)含量均有提高，其中以45 μmol/L茉莉酸甲酯的促進作用最為顯著，3 種綠原酸類物質(zhì)的總產(chǎn)量是對照組的2.68 倍（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，甜葉菊毛狀根培養(yǎng)可用于綠原酸類物質(zhì)的生產(chǎn)，經(jīng)茉莉酸甲酯處理可顯著提高綠原酸類物質(zhì)的產(chǎn)量。

甜葉菊；發(fā)根農(nóng)桿菌；毛狀根；茉莉酸甲酯；綠原酸類化合物

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）是一種多年生菊科草本植物[1]，其葉片中含有豐富的次生代謝產(chǎn)物。Karak? se等[2]以高效液相色譜-質(zhì)譜儀鑒定出甜葉菊葉片中的24 種奎寧酸和莽草酸的衍生物，其中綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩岷?,5-二咖啡酰奎寧酸的含量分別為35.5、145.6、37.2 μg/g。研究發(fā)現(xiàn)綠原酸類物質(zhì)具有多種功能活性，如抗氧化性[3]、增強肝糖原利用能力[4]、抑制HIV-1整合酶[5-6]、抑制致癌物質(zhì)的突變型[7]等。

目前綠原酸類化合物主要是從杜仲[8]、金銀花[9]、咖啡豆[10]等天然植物中提取，需要大量的植物資源，成本較高，毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物有望解決此難題。研究表明，毛狀根培養(yǎng)有很多優(yōu)點，如生化和遺傳性狀的穩(wěn)定性高、對季節(jié)和地理環(huán)境的依賴性低、生長速率快、能高效地合成次生代謝物等[11]，因此具有很好的應(yīng)用前景。但從目前的研究報道來看，毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物還存在產(chǎn)量較低等問題，影響了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用，通過誘導(dǎo)子刺激提高產(chǎn)量是解決這一問題的較好途徑之一[12]。茉莉酸甲酯是目前研究較多的一種誘導(dǎo)子，其在植物次生代謝過程中起信號分子的作用，能有效地刺激植物次生代謝產(chǎn)物的合成，如萜類、黃酮類、生物堿類等[13]。研究表明，茉莉酸甲酯可促進野葛毛狀根內(nèi)總異黃酮的積累，提高其含量和產(chǎn)量[14]。根據(jù)Yukimune等[13]研究報道，向培養(yǎng)基中添加100 μmol/L的茉莉酸甲酯能有效提高紫衫醇含量。王學(xué)勇等[15]研究了茉莉酸甲酯對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累和釋放的影響，經(jīng)茉莉酸甲酯處理后第2、6、9天隱丹參酮的含量分別達0.039、0.204、0.572 mg/g，分別是同時期未經(jīng)茉莉酸甲酯處理的2.2、8.5、23.8 倍；丹參酮ⅡA的含量達0.251、0.601、1.563 mg/g，分別是未經(jīng)茉莉酸甲酯處理的1.9、4.1、6.2 倍。本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060誘導(dǎo)甜葉菊毛狀根，建立了毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸類化合物體系，在此基礎(chǔ)上研究茉莉酸甲酯對綠原酸類化合物積累的影響，旨在為毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)植物次生代謝物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

甜葉菊種子：購于安徽宿州，品種為豐農(nóng)3號。甜葉菊無菌苗的培養(yǎng)參考Fu Xiao等[16]的方法，培養(yǎng)后的無菌苗在MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L吲哚丁酸（indole-3-butytric acid，IBA）培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，2 周后剪下甜葉菊葉片，用于誘導(dǎo)實驗。

MS、WPM、B5培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tieda試劑有限公司；綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩幔ň鶠樯V純） 上海同田生物科技有限公司；茉莉酸甲酯美國Sigma公司；DNA Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent科技有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、水平電泳儀 美國Bio-Rad有限公司；電泳成像儀 美國UVP公司；臺式離心機 上海安亭儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 農(nóng)桿菌的活化

挑取保存于－8 0 ℃甘油中的發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060，于酵母甘露醇培養(yǎng)基（yeast mannitol broth，YMB）上進行活化，2 d后挑選單菌落，轉(zhuǎn)接到Y(jié)MB液體培養(yǎng)基，在27 ℃、115 r/min黑暗條件下進行培養(yǎng)，當(dāng)生長到對數(shù)期時用于侵染甜葉菊葉片。

1.3.2 外植體的制備

取甜葉菊幼嫩葉片，剪成2.5～3.0 cm2左右，用無菌針頭在葉片上戳若干小孔，置于1/2 MS+100 μmol/L乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基中，（27±1）℃暗培養(yǎng)2 d后用于毛狀根誘導(dǎo)實驗。

1.3.3 毛狀根的誘導(dǎo)與除菌

毛狀根的誘導(dǎo)與除菌參考Fu Xiao等[16]的方法。將預(yù)培養(yǎng)的葉片浸入已重懸浮的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，115 r/min條件下暗培養(yǎng)25 min。然后將侵染的葉片用無菌濾紙吸干表面多余菌液，轉(zhuǎn)入1/2 MS+100 μmol/L乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基中，（27±1）℃、暗條件下共培養(yǎng)2 d，空白對照組用無菌水代替菌液。共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片轉(zhuǎn)接至1/2 MS+50 mg/mL頭孢噻肟鈉中進行一次除菌培養(yǎng)，7 d后轉(zhuǎn)至1/2 MS+50 mg/mL頭孢噻肟鈉培養(yǎng)基中進行第2次繼代除菌培養(yǎng)，以后每7 d除菌一次。

1.3.4 液體培養(yǎng)基的篩選

挑選生長旺盛、分枝較多的毛狀根根系，接種于無激素MS液體培養(yǎng)基，（27±1）℃、115 r/min黑暗條件下培養(yǎng)2 周，再分別稱取濕質(zhì)量為0.3 g左右的毛狀根，接種到裝有50 mL的MS、B5、WPM液體培養(yǎng)基（蔗糖3%，pH 6.0）中，培養(yǎng)5 周后收獲，烘干，稱質(zhì)量，并測定其綠原酸類物質(zhì)含量。

1.3.5 毛狀根生長曲線的繪制

將培養(yǎng)10 d后的毛狀根，接入到裝有50 mL、pH 6.0的MS液體培養(yǎng)基中，每瓶接入毛狀根鮮質(zhì)量為0.3 g，27 ℃、115 r/min暗培養(yǎng)，每7 d收獲一次，烘干，稱質(zhì)量。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、干質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖。

1.3.6 毛狀根rolB和rolC基因的PCR檢測

取在無激素培養(yǎng)基上快速生長的無菌毛狀根100 mg，按照TransGen EasyPure Plant Genomic DNA Kit的方法提取毛狀根基因組DNA，同時采用同樣的方法提取發(fā)根農(nóng)桿菌基因組DNA，以非轉(zhuǎn)化根基因組作為對照組，進行rolB和rolC基因的PCR檢測。在進行PCR檢測時，采用周偉等[17]設(shè)計的引物，擴增rolB（423 bp）、rolC（626 bp）基因，引物序列如表1所示。

表1 rolB rolC基因PCR擴增引物序列Table1 Primer sequences of rolB and rolC for PCR amplification

PCR體系（15 μL）：1 μL DNA、7.5 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix（Taq DNA polymerase、MgCl2、dNTP）、5.5 μL ddH2O、0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物。

PCR擴增條件[16]：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，進行35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖（Gel View染色）上電泳30 min，電泳結(jié)束后在UVP凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.3.7 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理

毛狀根培養(yǎng)至第3周時，分別加入15、45、100 μmol/L的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)子溶液，pH值調(diào)至6.0，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在處理后的第1、2、4、8天后收獲，烘干并稱質(zhì)量，同時測綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩岬暮俊?/p>

1.3.8 毛狀根綠原酸類成分的提取

稱取0.2 g毛狀根干燥粉末，置于10 mL離心管中，加入4 mL 50%的甲醇溶液，30 ℃、180 W超聲輔助提取30 min，冷卻，5 000 r/min離心10 min，收集上清液。重復(fù)提取一次，合并2 次提取液，并定容至10 mL，待測。

1.3.9 綠原酸類化合物HPLC測定

檢測條件[16]：色譜柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.2%醋酸水（A）和甲醇（B）；流速：1 mL/min；洗脫條件：0～10 min：70% A；10～15 min：70%～45% A；15～25 min：45% A；25～26 min：45～70% A；26～30 min：70% A；檢測波長：327 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛狀根的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

圖1 甜葉菊毛狀根誘導(dǎo)、固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)過程照片F(xiàn)ig.1 Pictures showing hairy root induction, solid-state culture and liquidstate culture of Stevia rebaudiana Bertoni

經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060侵染的甜葉菊葉片外植體共培養(yǎng)10 d左右，傷口周圍出現(xiàn)白色半透明的小突起，14 d左右陸續(xù)長出白色的誘導(dǎo)根，出根的部位多在外植體下端靠近葉柄及傷口處（圖1C）。待根長至3～5 cm時，將其剪下并轉(zhuǎn)至1/2 MS+250 mg/mL羧芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，1 周后轉(zhuǎn)接到1/2 MS+50 mg/mL頭孢噻肟鈉固體培養(yǎng)基上繼續(xù)除菌培養(yǎng)，重復(fù)除菌5～6 次，除菌完全。無菌毛狀根在1/2 MS固體培養(yǎng)基上能快速生長，呈現(xiàn)出多分枝、無向地性等特點（圖1D）。以上這些特征與Fu Xiao等[16]研究報道一致，因此從形態(tài)學(xué)上可以初步判定經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060誘導(dǎo)所獲得的根為毛狀根。挑選生長旺盛且?guī)в休^多分枝的毛狀根單根，置于無激素的MS液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其以初始部位為中心快速生長，25 d左右可以長滿整瓶（圖1E、F）。將所獲得的有代表性的無菌毛狀根置于MS液體培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，供后續(xù)實驗及毛狀根rolB和rolC基因鑒定用。

2.2 毛狀根rolB和rolC基因檢測結(jié)果

圖2 甜葉菊毛狀根rolB rolC基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析圖Fig.2 Gel electrophoresis analysis of PCR amplified fragments of rolB and rolC genes from Stevia rebaudiana Bertoni hairy roots

研究表明，毛狀根的形成與發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA上的rol家族基因有著密切關(guān)系[18]?，F(xiàn)已證實，轉(zhuǎn)入rolB和rolC基因的植物能產(chǎn)生毛狀根如煙草、胡蘿卜等，這種毛狀根主要表現(xiàn)出生長快、分枝多和無向地性等特點[19-20]。因此，檢測rolB和rolC基因成為了毛狀根鑒定的主要方法。黃偉劍等[21]根據(jù)rolB基因序列設(shè)計引物，進行PCR擴增反應(yīng)，從轉(zhuǎn)化的廣藿香毛狀根DNA中擴增出一條423 bp特異片段，表明發(fā)根農(nóng)桿菌TL-DNA中的rolB已成功整合到廣藿香毛狀根中。本研究首先從外觀形態(tài)特征上對發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060所誘導(dǎo)出的根進行了甄別，選取生長快、分枝多和無向地性的根進行進一步鑒定，以未經(jīng)農(nóng)桿菌感染的正常甜葉菊無菌苗的根為陰性對照，檢測了其基因組中的rolB和rolC基因，結(jié)果表明（圖2），所誘導(dǎo)的根基因組中均擴增出423 bp和626 bp的特異性目標(biāo)片段，且該片段與從發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060 Ri質(zhì)粒中所擴增出的基因片段相同，而未轉(zhuǎn)化的正常根中未能擴增出目標(biāo)片段。因此，可以據(jù)此鑒定本實驗以發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060所誘導(dǎo)出的根為毛狀根。

2.3 毛狀根綠原酸類成分檢測結(jié)果

圖3 毛狀根綠原酸類化合物HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of chlorogenic acids of hairy roots

收集甜葉菊毛狀根，以超聲輔助提取法提取其中的綠原酸類成分，參考Fu Xiao等[16]的HPLC法測定提取物中3 種綠原酸類單體成分的含量。從圖3可知，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡?？鼘幩? 個標(biāo)準品的保留時間分別為6.497、17.547、19.190 min（圖3A），所測毛狀根樣品中同時檢測出了以上3 種成分，且這3 種組分有很好的分離度（圖3B）。本研究基于此HPLC法，建立了3 種綠原酸成分的檢測標(biāo)準曲線，結(jié)果如表2所示。

表2 綠原酸類化合物標(biāo)準曲線Table2 Standard curve of chlorogenic acids

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)選

圖4 毛狀根在B5、MS和WPM3 種培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第5周后的生物量（A）及綠原酸類化合物含量（B）BFig.4 Biomass and contents of chlorogenic acids of hairy roots cultured in B5, MS and WPM culture medium for5 weeks

培養(yǎng)基是毛狀根生長及代謝產(chǎn)物積累的重要影響因素。在毛狀根培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)毛狀根在WPM、B5和MS3 種液體培養(yǎng)基里的生長特性和生物量積累有明顯的差別。檢測結(jié)果表明（圖4），培養(yǎng)基種類對毛狀根生物量的積累影響非常大，在第5周收獲時MS培養(yǎng)基中的生物量積累最高，干質(zhì)量增加倍數(shù)約為30 倍，顯著高于B5和WPM培養(yǎng)基；綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩帷?,5-二咖啡?？鼘幩岙a(chǎn)量均在MS培養(yǎng)中最高，分別高達3.47、11.47、3.04 mg/g。因此，MS培養(yǎng)基有利于毛狀根的生長與綠原酸類化合物的積累，選取MS培養(yǎng)基進行后續(xù)實驗。研究結(jié)果與王麗等[22]報道MS液體培養(yǎng)基更利于龍葵毛狀根生長一致。MS與B5培養(yǎng)基無機氮源的含量較高，但兩者所培養(yǎng)的毛狀根的生物量相差很大，說明甜葉菊毛狀根的生長可能與無機氮源關(guān)系不太大，主要可能是受其中有機氮源的影響，王沖之等[23]有類似的研究報道。

2.5 毛狀根生長曲線的建立

圖5 甜葉菊毛狀根生長曲線Fig.5 Growth curve of Stevia rebaudiana Bertoni hairy roots

由圖5可知，在MS液體培養(yǎng)基中毛狀根生長曲線總體上呈“S”型，第1周為毛狀根生長延滯期，可能是毛狀根在適應(yīng)新的生長環(huán)境，表現(xiàn)出生長遲滯的現(xiàn)象；2～4 周為指數(shù)生長期，此期間毛狀根快速生長；至第4周末生長達到最高峰，這時干質(zhì)量可達0.66 g/50 mL；在生長周期的第5周，由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)基本上被消耗掉了，毛狀根由初期的乳白色變逐漸變?yōu)辄S褐色，呈現(xiàn)老化狀態(tài)（圖1G），干質(zhì)量呈現(xiàn)下降的趨勢。由以上分析可知，生長周期的第3周左右為毛狀根繼代的最佳時期，也可能是添加誘導(dǎo)子最佳添加的最好時間，而第4周則是收獲毛狀根的最佳時間。

2.6 外源添加茉莉酸甲酯對毛狀根生長的影響

圖6 茉莉酸甲酯對毛狀根生長的影響Fig.6 Effect of methyl jasmonate on the growth of hairy roots

當(dāng)毛狀根培養(yǎng)到第3周時，添加3 種濃度的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，分別處理1、2、4、8 d后稱其干質(zhì)量，結(jié)果如圖6所示。與對照組相比，添加3 種濃度的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)1、2、4、8 d后都提高毛狀根的生物量，其中添加15 μmol/L茉莉酸甲酯誘導(dǎo)第8天后，干質(zhì)量增值倍數(shù)最大，生物量高達0.533 g/50 mL，為對照的1.20 倍（P＜0.05），這表明茉莉酸甲酯對毛狀根生長存在一定程度的促進作用。此外，茉莉酸甲酯處理的毛狀根在后期培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象比對照組更明顯，可能是因為茉莉酸甲酯引起了毛狀根的過敏反應(yīng)，進而促進了酚酸類物質(zhì)的釋放。

2.7 茉莉酸甲酯對毛狀根綠原酸類成分積累的影響

圖7 茉莉酸甲酯對毛狀根綠原酸類成分的影響Fig.7 Effect of methyl jasmonate on the production of chlorogenic acids by hairy roots

由圖7可知，添加3 種濃度的茉莉酸甲酯誘導(dǎo)第1、2天，綠原酸類化合物積累量增加不明顯。當(dāng)誘導(dǎo)到第4天時，綠原酸類化合物積累量開始增加，至第8天時綠原酸類化合物積累量顯著性提高。當(dāng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)濃度為45 μmol/L時，綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡?？鼘幩嵋约翱偖a(chǎn)量分別為5.85、23.45、4.28 mg/g和27.71 mg/50 mL，總產(chǎn)量是對照組的2.68 倍（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，外源添加茉莉酸甲酯對毛狀根進行誘導(dǎo)，激發(fā)了植物細胞的信號響應(yīng)機制，促進了毛狀根更快地積累次生代謝物。

3 討 論

發(fā)根農(nóng)桿菌是一種土壤農(nóng)桿菌，可以侵染雙子葉植物，誘發(fā)產(chǎn)生毛狀根。目前對于毛狀根的研究主要集中在植株再生與新品種培育方面，如紫高杯花和長壽花等[23]。在利用毛狀根生產(chǎn)植物中次生代謝產(chǎn)物方面，目前已有不少研究報道，如利用鼠尾草[24]、丁香羅勒[25]、藿香[26]等毛狀根生產(chǎn)酚酸類成分。

從已有的文獻報道來看，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生毛狀根，主要機制可能有2 個：一是葉片產(chǎn)生傷口后48 h會形成并且釋放乙烯丁香酮等酚類物質(zhì)，該類化合物可能是誘導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌識別的信號分子；二是葉片傷口處的細胞正處于生長活躍期，會形成大量的新細胞，使得外植體更容易侵染成功，從而產(chǎn)生毛狀根[27]。本實驗室已利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1成功從甜葉菊葉片中誘導(dǎo)出毛狀根，并在毛狀根中檢測出含量較高的綠原酸類化合物。在此基礎(chǔ)上，利用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060從預(yù)培養(yǎng)48 h的甜葉菊葉片外植體中誘導(dǎo)出毛狀根，這種毛狀根易于在MS液體培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)3 周后可積累較多的綠原酸類物質(zhì)，綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、4,5-二咖啡酰奎寧酸含量分別為1.58、3.73、0.39 mg/g。對培養(yǎng)基成分進行比較分析發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基中NO3－、NH4+、NaH2PO4、CaCl2使用量較WPM、B5高，其中NaH2PO4的使用量均比B5、WPM高出4 倍，CaCl2的使用量比B5高出2 倍。此外，MS中KI（0.83 mg/L）的使用量也高于B5、WPM，但VB1（0.5 mg/L）的使用量均比WPM、B5少1 倍；3 種培養(yǎng)基的鐵鹽均采用EDTA類化合物和Fe2SO4。通過以上分析，猜測NH4NO3、KNO3、NaH2PO4、CaCl2、VB1可能是影響甜葉菊毛狀根生長及次生代謝物積累的主要因素，但這些化合物對毛狀根培養(yǎng)具體有何作用及作用的機理還有待進一步研究。

本研究建立了甜葉菊毛狀根的培養(yǎng)體系，優(yōu)化了其液體培養(yǎng)條件，并通過采用在液體培養(yǎng)體系中添加一定濃度的外源誘導(dǎo)子方法來提高次級代謝物的產(chǎn)量。實驗結(jié)果表明，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)能大幅度提高綠原酸類物質(zhì)的產(chǎn)量，其主要原因可能有2 個方面：一是茉莉酸甲酯的加入提高了細胞活力，導(dǎo)致了生物量上升；另一方面，茉莉酸甲酯的加入可提高綠原酸類物質(zhì)合成代謝途徑中某些酶的活力，從而使綠原酸類物質(zhì)的合成速率提高，進而提高了產(chǎn)量，但加入茉莉酸甲酯對綠原酸類物質(zhì)代謝途徑中關(guān)鍵酶的影響還需進一步深入研究。

添加誘導(dǎo)子是提高次級代謝產(chǎn)物含量的一種有效途徑，能專一、選擇性地誘導(dǎo)植物合成特定信號分子，產(chǎn)生防御反應(yīng)并促進次生代謝產(chǎn)物的積累[12]。目前，常用的誘導(dǎo)子有水楊酸、茉莉酸甲酯、寡聚糖、稀土元素以及重金屬等，其中茉莉酸甲酯是近年來研究的熱點，它作為一類信號物質(zhì)，被辨認并結(jié)合細胞膜上特定的受體，刺激細胞內(nèi)產(chǎn)生特定細胞內(nèi)信息分子，在毛狀根培養(yǎng)中可使次生代謝相關(guān)基因激活，最終提高次生代謝物的產(chǎn)量[28]。誘導(dǎo)子在誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的合成過程中，其濃度效應(yīng)有2 種，一種是反應(yīng)飽和型，即次生產(chǎn)物的合成隨誘導(dǎo)子濃度增加而增加，達到最大值后穩(wěn)定；另一種是最適濃度型，即誘導(dǎo)反應(yīng)要求最適濃度下誘導(dǎo)子表現(xiàn)出最強的活性[29]。本實驗中茉莉酸甲酯濃度效應(yīng)屬于后者，在毛狀根培養(yǎng)過程中添加茉莉酸甲酯，當(dāng)濃度為45 μmol/L時，誘導(dǎo)效果最佳。

關(guān)于茉莉酸甲酯信號分子轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機理，目前一些相關(guān)研究報道認為，當(dāng)植物處于逆境時，會自發(fā)啟動相應(yīng)的防御機制來抵御外來環(huán)境對自身生長的影響。首先通過細胞膜上的受體感知外界的刺激,然后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),激活相應(yīng)的基因,最后誘發(fā)合成次生代謝物[30]。研究發(fā)現(xiàn),植物體通過積累特定次生代謝物來抵抗外界不良環(huán)境的傷害，而植物體的這種從感知到發(fā)生相應(yīng)生理生化反應(yīng)的過程被認為是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,當(dāng)遇到誘導(dǎo)子時，首先會被植物體細胞膜上特定的受體感知,經(jīng)信號轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)變成胞內(nèi)信號,形成的胞內(nèi)信號再與其特定的受體結(jié)合,活化其下游的通路,最后會引發(fā)相應(yīng)酶活性的變化,最終做出相應(yīng)的生理生化反應(yīng)[30]。在這個途徑中,胞內(nèi)信號通常包含有鈣離子、超氧陰離子、腺苷酸環(huán)化酶[30]，以及活性氧迸發(fā)的產(chǎn)物（H2O2和O2－?）[30-31]。文獻表明當(dāng)植物體遇到外源誘導(dǎo)子處理時,通常會誘發(fā)氧迸發(fā)，植物發(fā)生氧迸發(fā)反應(yīng)后,會在其體內(nèi)迅速積累較多的活性氧（如H2O2和O2－?）物質(zhì)，而這些物質(zhì)在植物體誘發(fā)合成次生代謝物過程中發(fā)揮著重要的信號分子作用，在活性氧大量產(chǎn)生的同時也會提高一些氧化酶活性,而這些具有活性的氧化酶又可以清除過多的活性氧物質(zhì),從而保護植物體免受過多活性氧的毒害,以此達到保護植物體[30]。在活性氧迸發(fā)的產(chǎn)物中由于O2－?的半衰期特別短，對此，大多數(shù)學(xué)者認為H2O2是次生代謝途徑中不可忽視的信號分子[30]，但H2O2在甜葉菊毛狀根的次生代謝途徑中是否同樣發(fā)揮著信號分子的作用以及H2O2與茉莉酸甲酯信號分子在代謝途徑中的具體作用都有待于進一步考察與研究。

參考文獻：

[1] MOSETTIG E, BEGLINGER U, DOLDER F, et al. The absolute configuration of steviol and isosteviol[J]. Journal of the American Chemical Society, 1963, 85(15)： 2305-2309. DOI：10.1021/ja00898a025.

[2] KARAK?SE H, JAISWAL R, KUHNERT N. Characterization and quantif i cation of hydroxycinnamate derivatives in Stevia rebaudiana leaves by LC-MSn[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2011, 59(18)： 10143-10150. DOI：10.1021/jf202185m.

[3] KONO Y, KOBAYASHI K, TAGAWA S, et al. Antioxidant activity of polyphenolics in diets： rate constants of reactions of chlorogenic acid and caffeic acid with reactive species of oxygen and nitrogen[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1997, 1335(3)： 335-342.

[4] HEMMERLE H, BURGER H J, BELOW P, et al. ChemInform abstract： chlorogenic acid and synthetic chlorogenic acid derivatives：novel inhibitors of hepatic glucose-6-phosphate translocase[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 1997, 40(2)： 137-145. DOI：10.1021/ jm9607360.

[5] ROBINSON W E, CORDEIRO M, ABDEL-MALEK S, et al. Dicaffeoylquinic acid inhibitors of human immunodeficiency virus integrase： inhibition of the core catalytic domain of human immunodef i ciency virus integrase[J]. Molecular Pharmacology, 1996, 50(4)： 846-855.

[6] ROBINSON W E, REINECKE M G, ABDEL-MALEK S, et al. Inhibitors of HIV-1 replication that inhibit HIV integrase[J]. PNAS, 1996, 93(13)： 6326-6331. DOI：10.1073/pnas.93.13.6326.

[7] STICH H F, ROSIN M P, BRYSON L. Inhibition of mutagenicity of a model nitrosation reaction by naturally occurring phenolics, coffee and tea[J]. Mutation Research/Fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 1982, 95(2/3)： 119-128. DOI：10.1016/0027-5107(82)90251-2.

[8] 盧琪, 段家彩, 高麗, 等. 杜仲綠原酸的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[J].食品科學(xué), 2010, 31(14)： 275-279.

[9] 尤秀麗, 池路花, 曹蕓梅, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波超聲雙輔助提取金銀花綠原酸工藝[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(12)： 272-276. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.051.

[10] 王立志, 胡曉梅, 付其勝, 等. 綠咖啡豆中總綠原酸的純化工藝研究[J]. 中國食品添加劑, 2014(7)： 123-128. DOI：10.3969/ j.issn.1006-2513.2014.07.014.

[11] 陶如, 馮蕾, 趙法興, 等. 白花丹參毛狀根誘導(dǎo)體系的建立與其內(nèi)生真菌提高毛狀根中丹酚酸含量的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2015, 26(6)： 1469-1473. DOI：10.3969 /j.issn.1008-0805.2015.06.078.

[12] 孫際薇. 茉莉酸甲酯對曼陀羅毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響[D]. 重慶： 西南大學(xué), 2014： 12-13.

[13] YUKIMUNE Y, TABATA H, HIGASHI Y, et al. Methyl jasmonateinduced overproduction of paclitaxel and baccatin Ⅲ in Taxus cell suspension cultures[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(9)： 1129-1132. DOI：10.1038/nbt0996-1129.

[14] 于樹宏, 李玲, 潘瑞熾, 等. 茉莉酸甲酯和ABA對野葛毛狀根中異黃酮含量的影響[J]. 植物生理學(xué)報, 2002, 38(4)： 344-346.

[15] 王學(xué)勇, 崔光紅, 黃璐琦, 等. 茉莉酸甲酯對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累和釋放的影響[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(4)： 300-302. DOI：10.3321/j.issn：1001-5302.2007.04.007.

[16] FU X, YIN Z, CHEN J, et al. Production of chlorogenic acid and its derivatives in hairy root cultures of Stevia rebaudiana[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2015, 63(1)： 262-268. DOI：10.1021/ jf504176r.

[17] 周偉, 姚倩雯, 錢忠英, 等. 丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2007, 36(2)： 93-98. DOI：10.3969/ j.issn.1000-5137.2007.02.019.

[18] DI C A, COSTANTINO P L, DI C A. Cell commitment and rolB gene expression in the induction of root differentiation[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture, 1996, 46(3)： 203-209. DOI：10.1007/BF02307096.

[19] 徐洪偉. 高山紅景天毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)的建立[D]. 長春： 東北師范大學(xué), 2004： 4-6.

[20] 萬小榮, 李玲. 發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒rolB基因研究進展(綜述)[J]. 亞熱帶植物科學(xué), 2001, 30(3)： 63-68. DOI：10.3969/ j.issn.1009-7791.2001.03.017.

[21] 黃偉劍, 何夢玲, 張宏意, 等. 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)廣藿香毛狀根的研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報, 2015, 31(2)： 156-160. DOI：10.3969/ j.issn.1006-8783.2015.02.004.

[22] 王麗, 劉琪, 羅志文, 等. 龍葵毛狀根誘導(dǎo)及其抑菌活性的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(20)： 63-65. DOI：10.3969/ j.issn.0517-6611.2015.20.022.

[23] 王沖之, 丁家宜. 不同培養(yǎng)基及外源激素對西洋參毛狀根的生長和皂甙含量的影響[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報, 2001, 10(4)： 1-4. DOI：10.3969/j.issn.1674-7895.2001.04.001.

[24] 施和平, 朱遠鋒, 王蓓, 等. 香石竹毛狀根誘導(dǎo)、離體培養(yǎng)及其植株再生[J]. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(11)： 1742-1750. DOI：10.13345/ j.cjb.140057.

[25] GRZEGORCZYK I, KRóLICKA A, WYSOKI?SKA H. Establishment of Salvia officinalis L. hairy root cultures for the production of rosmarinic acid[J]. Zeitschrift Für Naturforschung C Journal of Biosciences, 2006, 61(5/6)： 351-356. DOI：10.1515/znc-2006-5-609.

[26] TADA H, MURAKAMI Y, OMOTO T, et al. Rosmarinic acid and related phenolics in hairy root cultures of Ocimum basilicum[J]. Phytochemistry, 1996, 42(2)： 431-434. DOI：10.1016/0031-9422(96)00005-2.

[27] 呂政, 張淑麗, 路放, 等. 關(guān)蒼術(shù)毛狀根培養(yǎng)體系建立及其多糖含量測定[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2014, 49(16)： 1386-1392. DOI：10.11669/ cpj.2014.16.005.

[28] SEMBDNER G, PARTHIER B. The biochemistry and the physiological and molecular actions of jasmonates[J]. Annual Review of Plant Biology, 2003, 44(1)： 569-589. DOI：10.1146/annurev. pp.44.060193.003033.

[29] 李家儒, 管志勇, 劉曼西, 等. Cu2+對紅豆杉培養(yǎng)細胞中紫杉醇形成的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999, 18(2)： 117-120. DOI：10.3321/ j.issn：1000-2421.1999.02.006.

[30] 焦蒙麗. 水楊酸和茉莉酸甲酯對丹參培養(yǎng)細胞迷迭香酸生物合成的誘導(dǎo)作用[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2012： 4-5.

[31] VERPOORTE R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(4)：283-333. DOI：10.1016/j.biotechadv.2005.01.003.

Induction and Culture of Stevia rebaudiana Bertoni Hairy Roots and Effect of Methyl Jasmonate on the Accumulation of Chlorogenic Acids

ZOU Kai, LIU Zebo, CHEN Jiguang, YIN Zhongping*, SHANGGUAN Xinchen, XU Xiaoxiang
(Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food, College of Food Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In the present study, hairy roots of Stevia rebaudiana were induced by Agrobacterium rhizogenes ACCC10060, and then cultured to produce chlorogenic acids. Furthermore, the effect of methyl jasmonate on the synthesis of chlorogenic acids was also investigated. Leaf explants of Stevia rebaudiana were infected with Agrobacterium rhizogenes ACCC10060, and then co-cultured for inducing hairy roots. After14 days, hairy roots grew out. The PCR analysis results indicated that the rolB and rolC genes of Ri plasmid in Agrobacterium rhizogenes were successfully transferred into the hairy root genome, which confirmed that the tested induced roots were hairy roots. Compared with B5 and WPM liquid medium, MS was more suitable for hairy root growth and the accumulation of chlorogenic acids. After 35-day culture, the dry weight of hairy roots increased about 30 times, and the maximum contents of chlorogenic acid, 3,5-dicaffeylquinic acid, and 4,5-dicaffeylquinic acid were 3.47, 11.47 and 3.04 mg/g, respectively. Methyl jasmonate solutions at 15, 45 and 100 μmol/L were added into the medium, respectively as an inducer for higher production of chlorogenic acids after three weeks of culture. Both biomass and chlorogenic acid content were increased when the hairy roots were treated with methyl jasmonate for 1, 2,4 and8 days respectively. The optimal concentration of methyl jasmonate was 45 μmol/L for chlorogenic acid production. The total yield of chlorogenic acids was increased to 2.68 folds as compared to that of the control group (P ＜ 0.01). These results suggested that Stevia rebaudiana hairy roots could be used to produce chlorogenic acids and that methyl jasmonate treatment could significantly increase chlorogenic acid production.

Stevia rebaudiana; Agrobacterium rhizogenes; hairy root; methyl jasmonate; chlorogenic acids

10.7506/spkx1002-6630-201712014

?圖分類號：Q943.4

A

1002-6630（2017）12-0089-07

2016-09-28

江西省食品藥品監(jiān)督管理局科技計劃項目（2015yp17）；江西省科技支撐計劃項目（2010BNB00503）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31260368）

鄒凱（1990—），男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物與功能食品。E-mail：455016597@qq.com

*通信作者：尹忠平（1971—），男，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物與功能食品。E-mail：364207482@qq.com

鄒凱, 劉澤波, 陳繼光, 等. 甜葉菊毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質(zhì)積累的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 89-95.

10.7506/spkx1002-6630-201712014. http：//www.spkx.net.cn

ZOU Kai, LIU Zebo, CHEN Jiguang, et al. Induction and culture of Stevia rebaudiana Bertoni hairy roots and effect of methyl jasmonate on the accumulation of chlorogenic acids[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 89-95. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712014. http：//www.spkx.net.cn