紫玉米苞葉花色苷與牛血清白蛋白相互作用研究

朱莉，馬越，趙曉燕，王丹

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京100097）

紫玉米苞葉花色苷與牛血清白蛋白相互作用研究

朱莉，馬越，趙曉燕，王丹*

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京100097）

采用熒光光譜法、紫外可見吸收光譜法、高效液相色譜法研究紫玉米苞葉花色苷與牛血清白蛋白（BSA）之間的相互作用。結(jié)果表明，紫玉米苞葉花色苷與BSA之間存在一定的相互作用，結(jié)合程度隨著紫玉米苞葉花色苷濃度的增加而增加，二者結(jié)合后，會引起B(yǎng)SA結(jié)構(gòu)的變化。紫玉米苞葉中6種主要的花色苷成分與BSA結(jié)合程度不同，其結(jié)合能力大小依次為：天竺葵-3-（6'-丙二酰葡萄糖苷）＞芍藥-3-（6'-丙二酰葡萄糖苷）＞天竺葵-3-葡萄糖苷＞矢車菊-3-葡萄糖苷＞矢車菊-3-（6'-丙二酰葡萄糖苷）＞芍藥-3-葡萄糖苷。

紫玉米；花色苷；熒光光譜；紫外光譜；高效液相色譜

花色苷屬類黃酮化合物，是植物的主要呈色物質(zhì)之一[1-5]，紫玉米花色苷的含量較高，且具有很好的生物活性。紫玉米花色苷具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖的功能[6-7]，能夠提高小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、抗體生成細(xì)胞數(shù)和半數(shù)溶血值，提高小鼠的免疫功能；具有引起人類白血病和淋巴瘤（MOLT-4 and Daudi）凋亡的能力，且該能力與時間和劑量成依數(shù)性關(guān)系[8]。然而此類生物活性物質(zhì)對光熱等非常敏感，穩(wěn)定性差，利用率極低，極大的限制了其應(yīng)用及功效的發(fā)揮。由于花色苷不穩(wěn)定、中國每年至少浪費(fèi)數(shù)萬噸以上的花色苷。目前，關(guān)于其穩(wěn)定性的研究較多，包括輔助成色、添加食品添加劑、微膠囊化等等。但是，花色苷的不穩(wěn)定性仍沒有得到根本解決?；ㄉ辗€(wěn)定性決定其功能性，因此，花色苷的穩(wěn)定性是其應(yīng)用過程中的瓶頸問題。

牛血清白蛋白（BSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，并具有很多生理功能，比如：維持血液滲透壓和酸堿度，除此之外，它還作為一些外源和內(nèi)源化合物（脂肪酸、氨基酸、藥物）的載體，參與其體內(nèi)外運(yùn)輸過程[9]。由于BSA是外源藥物的主要結(jié)合蛋白，并且與人血清蛋白有高度的同源性，因此，BSA常被作為模型蛋白，用于研究一些化合物與其相互作用，從而反映這些物質(zhì)在體內(nèi)的活動情況[10-12]。近來研究表明篤斯越桔花色苷與乳清蛋白相互作用可以提高花色苷的穩(wěn)定性[13]，不同來源花色苷結(jié)構(gòu)及功效不同。紫玉米花色苷能否與BSA相互作用鮮有報道。

本文采用紫外光譜、熒光光譜、高效液相色譜法研究紫玉米苞葉花色苷與BSA之間的相互作用，分析紫玉米苞葉中不同花色苷與BSA的結(jié)合效果，為花色苷的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紫玉米苞葉（涿紫一號）：由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心農(nóng)產(chǎn)品加工實驗室提供。

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：Dima技術(shù)公司；甲酸、乙醇、鹽酸（分析純）：北京化工廠；Tris：北京銀豐科技發(fā)展有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：上海羅氏制藥有限公司。

液質(zhì)聯(lián)用儀（HPLC 1200 series，IonTrap 6310）：安捷倫公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BüCHI R-215）：瑞士布奇公司；CHRIST真空冷凍干燥機(jī)（ALPHR Z-4 LD PLUS）：北京博勵行儀器有限公司；層析儀（AKTA explorer）：美國通用電氣；酶標(biāo)儀（Spectra Max i3）：美國丹納公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫玉米苞葉花色苷的提取

取紫玉米苞葉10 g，置于攪拌機(jī)中粉碎1 min，成粉末狀。使用的提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇水溶液，并用1 mol/L的鹽酸將提取溶劑的pH值調(diào)為3；料液比為1∶50（g/mL）；提取溫度50℃；提取時間1 h；提取次數(shù)1次。提取結(jié)束后，將提取物進(jìn)行過濾，其中上清液再放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸以得到花色苷的粗提取物，溫度設(shè)為60℃。

1.2.2 大孔樹脂純化

AmberliteXAD-7大孔樹脂預(yù)處理后，填裝在1.6 cm/ 60 cm的填裝柱中，將上述粗提物上樣，流速為7 mL/ min，0.5%甲酸水沖洗后，采用0.5%甲酸的甲醇洗脫，收集紅色液體，45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液，冷凍干燥成干粉備用。

1.2.3 紫玉米苞葉花色苷提取物與BSA相互作用熒光光譜分析

取一定量 BSA固體溶于 0.05 mol/L，pH7.4的Tris-HCl緩沖液，并用緩沖液稀釋至1.1×10-7g/mL，備用，取BSA儲備液100 μL于非透明96孔板中，向其中加入不同濃度（0 g/mL、9.5×10-7g/mL、3.8×10-6g/mL、7.6× 10-6g/mL、1.1×10-5g/mL、1.5×10-5g/mL、1.9×10-5g/mL）的花色苷溶液100 μL，其中向不加花色苷溶液的處理組中加入100 μL無水乙醇，將其視為空白對照，置于25℃條件下10 min，使其充分反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀分析加入花色苷前后熒光光譜的變化，測定參數(shù)為激發(fā)波長260 nm，發(fā)射波長范圍290 nm～450 nm。

1.2.4 紫玉米苞葉花色苷提取物與BSA相互作用紫外光譜分析

取上述提取的紫玉米苞葉花色苷干粉，用無水乙醇配置花色苷溶液并稀釋，使其花色苷濃度為1.92× 10-4g/mL，作為備用溶液。取備用花色苷溶液10 μL于透明96孔板中，并向其中加入不同濃度（0、1×10-3、2× 10-3、3×10-3、4×10-3、5×10-3）的BSA溶液100 μL，向不加BSA溶液的處理組中加入100 μL Tris/HCl緩沖溶液，將其視為空白對照。在25℃條件下靜置10 min，使其充分反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行光譜掃描，掃描波長范圍為400 nm～750 nm。分析加入BSA溶液前后吸收光譜的變化。

1.2.5 高效液相色譜分析紫玉米苞葉花色苷提取物與BSA相互作用

配置好的花色苷溶液，經(jīng)45 mm濾膜過濾備用，取濾液100 μL與0.01 g/mL、100 μL的BSA溶液（100 μL的Tris/HCl酸緩沖液，作為空白對照）混合充分混合，室溫下反應(yīng)15 min后，加入200 μL，5%的甲酸醇溶液，放置30 min，經(jīng)45 mm濾膜，去除沉淀（蛋白及與蛋白結(jié)合的花色苷）后，進(jìn)入液相分析。根據(jù)趙曉燕等[14]用HPLC-MS法研究黑樹莓花色苷分子結(jié)構(gòu)的檢測方法，做適當(dāng)調(diào)整，設(shè)置HPLC檢測條件：流動相A為5%甲酸水，B相為乙腈；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.6 mL/min；線性洗脫梯度為：0～15 min 10%B，15 min～17 min 40%B，17 min～20 min 100%B，20 min～25 min 100%B，25 min～26 min 10%B。觀察反應(yīng)前后峰面積變化。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件Duncan新復(fù)極差法（P< 0.05），Origin7.5軟件作圖；試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA與紫玉米苞葉花色苷相互作用的熒光光譜

圖1反應(yīng)了BSA與不同濃度紫玉米苞葉花色苷在25℃條件下相互作用后熒光光譜的變化。

圖1 牛血清白蛋白與不同濃度紫玉米苞葉花色苷提取液反應(yīng)的熒光光譜Fig.1 The fluorescence quenching spectra of bovine serum albumin（BSA）combined with different concentration ofanthocyanins extracted purple corn bract

由圖1可知，隨著紫玉米苞葉花色苷濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸下降，說明紫玉米苞葉花色苷與BSA之間存在一定的相互作用，這與Li Shu等[15]對天竺葵-3-O-葡萄糖苷和BSA之間的相互作用的研究結(jié)果一致。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸是組成BSA主要的氨基酸殘基，同時也為BSA提供其所固有的熒光效應(yīng)。BSA熒光光譜的最大發(fā)射峰通常在340 nm處[16]。由圖1可見，光譜有輕微的紅移，推測紫玉米苞葉花色苷與BSA反應(yīng)會對BSA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

2.2 BSA與紫玉米苞葉花色苷相互作用的紫外可見光譜

圖2表示了紫玉米苞葉花色苷與不同濃度BSA相互作用后紫外吸收光譜的變化情況。

圖2 紫玉米苞葉花色苷提取液與不同濃度牛血清白蛋白反應(yīng)的紫外光譜Fig.2 The UV/VISabsorption spectrum of anthocyanins extracted from purple corn bract combined with different concentration of bovine serum albumin（BSA）

由圖2可知，吸收峰峰值隨著BSA濃度的增加而增加，并且光譜有輕微紅移現(xiàn)象發(fā)生，說明紫玉米苞葉花色苷提取物與BSA之間存在相互作用，與熒光猝滅實驗結(jié)果一致。除此之外，參考熒光猝滅機(jī)理[17-18]，紫外光譜實驗可以進(jìn)一步說明BSA與紫玉米苞葉花色苷之間的熒光猝滅反應(yīng)屬于靜態(tài)猝滅過程而非動態(tài)猝滅。

2.3 高效液相色譜分析紫玉米苞葉花色苷與BSA相互作用

紫玉米苞葉花色苷主要成分見表1，主要是以矢車菊、天竺葵、芍藥色素為苷元的多糖和酰基化結(jié)合的糖苷。紫玉米苞葉花色苷與BSA相互作用的HPLC分析結(jié)果見圖3，圖中橫坐標(biāo)與表1物質(zhì)對應(yīng)，圖3主要反應(yīng)了紫玉米苞葉中主要的花色苷成分與BSA結(jié)合能力的大小，結(jié)合能力由峰面積減少量表示。

表1 紫玉米苞葉花色苷的質(zhì)譜分析Table 1 MS data of anthocyanidin from purple corn brack

圖3 紫玉米苞葉花色苷提取液與牛血清白蛋白反應(yīng)的HPLC分析Fig.3 HPLC analysis of purple corn husks of anthocyanins combined with bovine serum albumin

從圖3中可以得出，由于花色苷結(jié)構(gòu)不同，造成與BSA結(jié)合程度存在顯著性差異（P<0.05），其中5號峰，天竺葵-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）與BSA結(jié)合程度最強(qiáng)，而芍藥-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）與BSA結(jié)合能力較差。紫玉米苞葉中主要的花色苷與BSA結(jié)合程度大小依次為：天竺葵-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）＞芍藥-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）＞天竺葵-3-葡萄糖苷＞矢車菊-3-葡萄糖苷＞矢車菊-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）＞芍藥-3-葡萄糖苷。

3 結(jié)論

紫玉米苞葉花色苷與BSA之間存在一定的相互作用，熒光猝滅遵循靜態(tài)猝滅機(jī)理。紫玉米苞葉中6種主要的花色苷成分與BSA結(jié)合程度存在顯著性差異，結(jié)合程度大小依次為：天竺葵-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）＞芍藥-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）＞天竺葵-3-葡萄糖苷＞矢車菊-3-葡萄糖苷＞矢車菊-3-（6’-丙二酰葡萄糖苷）＞芍藥-3-葡萄糖苷。此結(jié)果為進(jìn)一步對紫玉米苞葉花色苷與BSA作用機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

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Study on the Interaction between Purple Corn Bract Anthocyanins and Bovine Serum Albumin

ZHU Li，MA Yue，ZHAO Xiao-yan，WANG Dan*
（Beijing Academy of Agriculture and Forestry Vegetable Research Center，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture，P.R.China，Key Laboratory of Urban Agriculture（North），Ministry of Agriculture，P.R.China，Beijing 100097，China）

Fluorescence spectrometry，UV-VIS absorption spectroscopy，and high-performance liquid chromatography（HPLC）were used to research the interaction between purple corn bract anthocyanins and bovine serum albumin（BSA）.The results showed that there was a relationship on the purple corn anthocyanins bract and BSA.The bonding degree increased with the increase of the concentration of anthocyanins.Furthermore，the structure of BSA was changed after the combination.The binding abilities of six anthocyanins in purple corn bract was different.The order of combining ability was as follows：pelargonidin-3-（6'-malonylglucoside）＞peonidin-3-（6'-malonylglucoside）＞pelargonidin-3-glucoside＞cyanidin-3-glucoside＞cyanidin-3-（6'-malonylglucoside）＞peonidin-3-glucoside.

purple corn；anthocyanin；fluorescence spectrum；ultraviolet spectrum；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.004

2016-09-28

北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（QNJJ201603）;北京市科技新星計劃（Z131105000413023）

朱莉（1991—），女（漢），碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：王丹，女，教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。