甘草酸微生物轉(zhuǎn)化菌的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

蘇龍++梁廣波++陳光麗++韋玉華++潘雪梅++王雪儒

摘要：首先，采用單因素方法對碳源、氮源、發(fā)酵接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等因素進(jìn)行考查，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化。得到的優(yōu)化發(fā)酵條件是甘草浸出液10%，發(fā)酵溫度40 ℃，pH 5.0，接種量10%，裝液量75 mL/250 mL，發(fā)酵時(shí)間為6.5 d，180 r/min。在最優(yōu)條件下，甘草次酸的量達(dá)到7.67 mg/mL。

關(guān)鍵詞：米曲霉；微生物轉(zhuǎn)化；甘草；甘草酸；甘草次酸；優(yōu)化

中圖分類號：TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1918-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.030

Screening and Identify of the Glycyrrhizic Acid Microbial Transformation and Optimization of Fermentation Conditions for Glycyrrhetic Acid by Microorganism

SU Long，LIANG Gang-bo，CHEN Guang-li，WEI Yu-hua，PAN Xue-mei，WANG Xue-ru

（College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University，Yulin 537000，China）

Abstract：Firstly，using single-factor test，the effects of these 5 parameters，i.e.，carbon source，nitrogen source，the inoculation amount，initial pH of medium， fermentation time，fermentation temperature on the glycyrrhetic Acid yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through the orthogonal array experiments with 4 factors in 3 levels. The optimal conditions were licorice digester liquid 10%，initial pH 5.0，rotation speed 180 r/min，10% inoculum size in 75 mL working volume（in 250 mL flasks） at 40 ℃ for 6.5 d. Using these conditions，the the glycyrrhetic acid yield was 7.67 mg/mL.

Key words： aspergillusoryzae；microbialtransformation； licorice； glycyrrhizic acid； glycyrrhetic acid； optimized

甘草屬于豆科植物。中國西部、俄羅斯及歐洲分布較多。自古以來，甘草在很多國家廣為藥用，尤其在中國醫(yī)藥學(xué)中許多配方都有甘草和甘草浸膏。中醫(yī)理論認(rèn)為甘草性平味甘，具有和中緩急、潤肺、解毒、祛痰、止咳、通經(jīng)脈、利氣血、調(diào)和諸藥等功效，為臨床廣泛應(yīng)用[1]。近年來，隨著藥理活性試驗(yàn)方法的發(fā)展和完善，發(fā)現(xiàn)甘草還具有明顯的抗炎，抗?jié)冏饔煤涂棺儜B(tài)反應(yīng)作用[2]。日本學(xué)者熊谷朗[3]進(jìn)一步證明甘草還具有抗病毒性肝炎，慢性肝炎作用。彭子模等[4]也報(bào)道了甘草具有抗愛滋病毒的作用。大量研究證明，上述作用主要?dú)w因于甘草的主要成分甘草甜素和甘草次酸及其衍生物。因此，甘草次酸及其衍生物的研究開發(fā)，是近幾十年來各國科學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。

甘草的腸道代謝及藥代動(dòng)力學(xué)研究[5，6]表明甘草酸在腸道內(nèi)緩慢地轉(zhuǎn)化為甘草次酸。甘草酸經(jīng)人口服后，血漿中主要測出甘草次酸，而未測到甘草酸。普通和無菌大鼠均給予甘草酸口服，普通大鼠血漿中可以測出甘草次酸，但沒有原形物3甘草酸，而在無菌大鼠血漿中未測到甘草次酸。分別口服甘草酸和甘草次酸，血漿中甘草次酸的MRT值出現(xiàn)顯著差異，說明腸道內(nèi)甘草酸緩慢地轉(zhuǎn)化為甘草次酸[7-10]。然而，在甘草中甘草次酸的含量較低，只有0.1%左右，其前體甘草酸的含量則比較高，在3.7%～8.3%。因此，利用微生物與中草藥甘草共同發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸具有非常重要的意義。

甘草酸與甘草次酸的微生物轉(zhuǎn)化所需的菌株可從土壤中獲得，也可以來自植物組織，然而如何從這些眾多的菌株當(dāng)中篩選出能夠轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有價(jià)值的目標(biāo)產(chǎn)物、且專一性強(qiáng)的菌株，是微生物轉(zhuǎn)化甘草酸和甘草次酸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，方便、快捷的微生物轉(zhuǎn)化菌株篩選模型的建立是研究的主要內(nèi)容，也是菌株篩選的有效途徑。周艷艷等[11，12]利用篩選到的酵母菌株YGL-B-0發(fā)酵培養(yǎng)72 h甘草次酸的含量為11.70 mg/mL。宋新波等[13]利用海棗曲霉分泌的酶轉(zhuǎn)化甘草為甘草次酸，也獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。徐靜等[14]以甘草酸單銨鹽為原料，通過酶法轉(zhuǎn)化的方法制備甘草次酸，經(jīng)過酶解條件的優(yōu)化后，甘草次酸的得率達(dá)到40.87%。陳永強(qiáng)等[15]利用自行篩選的黃曲霉菌株HG-12轉(zhuǎn)化甘草，也很好地提高了甘草次酸的含量。何晨[16]利用純度為90%的甘草酸為碳源的篩選模型，從新疆野生甘草土壤中分離篩選得到具有水解甘草酸產(chǎn)生甘草次酸的菌株，并采用發(fā)酵法轉(zhuǎn)化甘草生產(chǎn)甘草次酸，最終濃度為2.22 g/L，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。王云[17]利用從土壤中分離得到的一種綠色木霉進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化甘草酸，產(chǎn)物為單葡萄糖醛酸基甘草次酸，轉(zhuǎn)化率約為90%。宋素琴等[18]從脹果甘草不同組織中分離得到的149株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，得到一株能產(chǎn)甘草酸類似物的肉生枯草芽胞桿菌。大量的研究證明，用微生物轉(zhuǎn)化甘草酸、甘草次酸具有非常大的應(yīng)用情景，效益高，獲得的目標(biāo)組分多，但是要獲得專一性強(qiáng)的微生物轉(zhuǎn)化菌株和適宜的轉(zhuǎn)化條件還較為困難。加強(qiáng)菌株篩選及其簡便、快捷的轉(zhuǎn)化條件研究，對利用微生物轉(zhuǎn)化甘草酸、甘草次酸等甘草成分的工業(yè)化生產(chǎn)有重要的意義。本試驗(yàn)詳細(xì)研究了米曲霉對甘草次酸微生物轉(zhuǎn)化的條件， 優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件， 為進(jìn)一步研究甘草次酸的代謝及新藥開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草片（玉林市至真藥業(yè)連鎖店），含量90.0%的甘草酸（西安市匯林生物公司），甘草次酸（西安市匯林生物公司），其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司）。

初篩培養(yǎng)基：甘草酸粉2 g，瓊脂2 g，用蒸餾水定容至100 mL，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min。復(fù)篩培養(yǎng)基：甘草酸粉2 g，MgSO4 0.05 g、NaNO3 0.5 g、FeSO4 0.001 g、KH2PO4 0.1 g，用蒸餾水定容至100 mL，pH 5.0，121 ℃高壓滅菌20 min。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：甘草浸出液10%，pH自然，分裝121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Tu21800紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HH-s數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；FE20 Five Easy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 菌株初篩 配制好初篩培養(yǎng)基平板，從實(shí)驗(yàn)室中草藥轉(zhuǎn)化菌種庫中篩選能轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次酸的菌株；能在以甘草酸為惟一碳源的初篩培養(yǎng)基上生長的菌株，即為能轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次酸的疑似菌株，用復(fù)篩培養(yǎng)基液體培養(yǎng)，通過TLC薄層層析和分光光度法檢測甘草次酸，確認(rèn)轉(zhuǎn)化菌株。

1.3.2 菌株復(fù)篩 ①發(fā)酵液的TLC薄層層析檢測。將初篩菌種菌懸液0.2 mL接入30 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)120 h，以發(fā)酵前作為對照。對發(fā)酵液作產(chǎn)物TLC檢測，在薄層層析板上有甘草次酸斑點(diǎn)出現(xiàn)的菌株就有可能是能將甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸的菌株即目標(biāo)菌株。薄層層析板的制備：取30 g硅膠G和100 mL 0.3%的CMC-Na水溶液調(diào)成糊狀，在普通玻璃板上涂勻，室溫下過夜晾干，于110 ℃烘干活化30 min，即制成活化的硅膠薄層層析板。甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精密稱取甘草次酸5 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。發(fā)酵液的處理：各取發(fā)酵前及發(fā)酵后發(fā)酵液2.5 mL，加入5 mL乙酸乙酯，振蕩、靜置分層后將乙酸乙酯于80 ℃水浴中揮干，向揮干物中加入1 mL甲醇，取此甲醇溶液及甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣于前述硅膠板上進(jìn)行TLC展開分析。TLC條件[16，19，20]展開劑：石油醚-乙酸乙酯-醋酸（2∶1∶0.1），各取甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)液、發(fā)酵前后試液點(diǎn)樣于同一硅膠板上。碘顯色1 min，至斑點(diǎn)清晰，取出。②發(fā)酵液分光光度分析。將初篩的菌種接入復(fù)篩培養(yǎng)基中，以10%、50 mL甘草浸煮液作為培養(yǎng)液，30 ℃、180 r/min搖床中發(fā)酵4 d。取米曲霉發(fā)酵后的甘草液體2.5 mL，加入5 mL的乙酸乙酯放在35 ℃、180 r/min的搖床中萃取，過夜。量取乙酸乙酯層1 mL，依次加入3 mL乙醇、0.2 mL 1%香草醛乙醇溶液和2 mL 80%硫酸，50 ℃水浴10 min，取出放冷，在545 nm處測定OD值[21]。

1.3.3 菌株鑒定 將篩選及純化好的菌種委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行鑒定。

1.3.4 甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定[16] 精密稱取120 ℃干燥到恒重的甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。得各組成濃度分別為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以0號空白分別于545 nm處測定吸光度，得回歸方程，樣品測定利用回歸方程計(jì)算即得。

1.3.5 單因素試驗(yàn) 以甘草次酸含量為依據(jù)，分別考察不同碳源（蔗糖、葡萄糖、麩皮、麥芽糖、玉米粉、淀粉）、不同氮源（蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、黃豆粉、硫酸銨、尿素）、不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同裝液量（25、50、75、100、125、150 mL/250 mL）、不同發(fā)酵溫度（20、25、30、35、40、45 ℃）、不同發(fā)酵時(shí)間（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 d）對甘草次酸產(chǎn)量的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以發(fā)酵溫度、發(fā)酵液pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間為影響因素，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

經(jīng)過初篩、復(fù)篩和發(fā)酵檢測的篩選，得到一株能把甘草酸轉(zhuǎn)化為甘草次酸的的菌株，結(jié)果見圖1、圖2。將測定的菌株的ITS序列用Blastn軟件與GeneBank中已報(bào)道的ITS序列進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)，菌種的ITS序列與在GeneBank登記的Aspergillus oryzae（米曲霉）的ITS序列的同源性達(dá)到99%；通過對菌株的菌落形態(tài)及結(jié)合ITS序列同源性比較，可以確定菌種為Aspergillus oryzae（米曲霉）。

2.2 甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

根據(jù)所獲得的不同甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度的吸光度，做出甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.072 3x+0.001 7，R2=0.998。

2.3 碳源和氮源對甘草次酸量的影響

碳源作為微生物生長所需要的營養(yǎng)因子，對微生物的生長代謝起著重要的作用，并且細(xì)胞的干物質(zhì)中碳約占50%，微生物對碳的需求最大；微生物生長和產(chǎn)物合成也需要氮源，主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成。

從圖4、圖5可以看出，碳源和氮源種類對甘草酸的轉(zhuǎn)化影響不大，麩皮和淀粉的加入可以增加甘草次酸的含量，但幅度不大；其他碳源的加入相反起到抑制作用。無論是添加有機(jī)氮源還是無機(jī)氮源，對甘草酸量的影響都差不多?？赡苁怯捎诟什菟幉膩碓从谥参锔浚卸嗵穷惡偷鞍踪|(zhì)等，經(jīng)微生物分解后即產(chǎn)生大量碳源和氮源，可滿足微生物的生長營養(yǎng)要求。從總體來看，添加碳源和氮源對甘草次酸量的影響不大，另外從成本方面考慮，本系統(tǒng)發(fā)酵過程中只以甘草浸出液為碳源和氮源的來源，不另外加入。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對甘草次酸量的影響

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，甘草次酸量逐漸增加，在接種發(fā)酵第6.5天時(shí)甘草次酸量達(dá)到最大；繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，甘草次酸量有下降的趨勢。發(fā)酵時(shí)間不僅影響微生物的生長速率和生長量，且影響微生物的代謝強(qiáng)度和代謝物的多寡，β-葡萄糖醛酸酶屬于米曲霉的次級代謝產(chǎn)物，一般微生物生長到中后期才開始分泌。發(fā)酵時(shí)間的延長使得菌體的代謝產(chǎn)物β-葡萄糖醛酸酶的含量增大，從而提高甘草酸的轉(zhuǎn)化率。故發(fā)酵時(shí)間選擇6.5 d為宜。

2.5 發(fā)酵溫度對甘草次酸量的影響

溫度是影響微生物生長和存活的主要環(huán)境因素之一，對發(fā)酵的影響很大。溫度的高低影響酶的反應(yīng)，氧的溶解和傳遞速率，菌體生長和產(chǎn)物合成等。由圖7可知，35 ℃發(fā)酵時(shí)甘草次酸量最高。20 ℃發(fā)酵時(shí)甘草次酸量最少，說明20 ℃時(shí)米曲霉生長緩慢，還沒有酶的分泌或者分泌的酶量較少，甘草次酸量較少。溫度過高，雖然菌種生產(chǎn)速度加快，但也有可能營養(yǎng)成分消耗過快，酶的分泌量也減少，導(dǎo)致甘草次酸量下降；也可能溫度過高不適合酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

2.6 培養(yǎng)基的初始pH對轉(zhuǎn)化甘草酸的影響

相對于最適pH而言，過高或者過低的pH環(huán)境都會(huì)影響到米曲霉的生長，也會(huì)影響酶的分泌，更影響到酶催化反應(yīng)。由圖8可知，當(dāng)pH為5.0時(shí)，發(fā)酵液中的甘草次酸量最高，而pH低于或高于5.0，甘草次酸量相應(yīng)減少，故最適pH選擇5.0。

2.7 菌種接入量對甘草次酸量的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中甘草次酸量逐漸增加，接種量為8%時(shí)，甘草次酸量最高；超過8%時(shí)甘草酸轉(zhuǎn)化率開始下降。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在培養(yǎng)中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機(jī)會(huì)。但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會(huì)延長培養(yǎng)時(shí)間，降低生產(chǎn)效率。本試驗(yàn)選擇8%為最佳接種量。

2.8 裝液量對甘草次酸量的影響

氧氣是好氧微生物能正常生長繁殖的重要參數(shù)之一。溶氧的多少直接影響微生物生長，并影響β-葡萄糖醛酸酶的產(chǎn)量，進(jìn)而影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化率。利用裝液量來研究溶氧的影響，裝液量小的培養(yǎng)基與氧氣的接觸面積大，增加液體的溶氧量。反之，裝液量大的溶氧量較少。由圖10可知，當(dāng)裝液量為75 mL（250 mL三角瓶）時(shí)，甘草次酸量最高；裝液量過多或過少，甘草次酸產(chǎn)量均減少。裝液量與轉(zhuǎn)化環(huán)境的溶氧量有直接的關(guān)系，增大溶氧量有利于細(xì)胞生長、產(chǎn)酶，促進(jìn)甘草次酸的產(chǎn)生；裝液量太少，導(dǎo)致細(xì)胞生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，反而會(huì)影響酶的分泌，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。因此，在轉(zhuǎn)化甘草酸時(shí)，培養(yǎng)基的裝液量為75 mL/250 mL。

2.9 金屬離子對甘草次酸量的影響

由圖11可知，Ca2+、Mg2+對甘草酸的轉(zhuǎn)化有一定的效果，可能是這兩種離子是β-葡萄糖醛酸酶的激活劑，但甘草次酸增加的幅度不明顯；Mn2+具有抑制作用。從金屬離子的作用來看，對于米曲霉發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘草的轉(zhuǎn)化率提高不明顯，也有可能因?yàn)楦什菰诜N植過程或在后期處理的時(shí)候已經(jīng)攜帶有金屬離子，故發(fā)酵過程中也不添加金屬離子。

2.10 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析見表1，表2。通過對正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，可知對甘草酸轉(zhuǎn)化影響因素的排序?yàn)锽>C>D>A，即pH、接種量對甘草酸轉(zhuǎn)化影響較大，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對甘草苷轉(zhuǎn)化影響較小。最佳的組合為A3B2C3D2，即發(fā)酵溫度40 ℃，pH為5.0，接種量10%，發(fā)酵時(shí)間為6.5 d。經(jīng)驗(yàn)證在最優(yōu)條件下，甘草次酸含量最高，達(dá)7.67 mg/mL。

3 討論

本試驗(yàn)通過以甘草酸為惟一碳源的平板篩選法結(jié)合薄板薄層層析檢測，從實(shí)驗(yàn)室的中草藥轉(zhuǎn)化菌庫中篩選到一株能高效轉(zhuǎn)化甘草酸為甘草次酸的菌株，鑒定為米曲霉。通過單因素和正交試驗(yàn)對米曲霉發(fā)酵甘草轉(zhuǎn)化甘草次酸的條件進(jìn)行了優(yōu)化。最優(yōu)的發(fā)酵條件為甘草浸出液10%，發(fā)酵溫度40 ℃，pH為5.0，接種量10%，裝液量75 mL/250 mL，發(fā)酵時(shí)間為6.5 d。在最優(yōu)條件下，甘草次酸的含量達(dá)到7.67 mg/mL。

雖然本試驗(yàn)篩選的菌株經(jīng)過優(yōu)化后具備了良好的轉(zhuǎn)化效果，然而，生物反應(yīng)的技術(shù)途徑對中草藥活性成分的轉(zhuǎn)化非常重要，正確的轉(zhuǎn)化途徑是成功的開始。目前在中藥活性成分的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)中，發(fā)展起來的有組織細(xì)胞培養(yǎng)、微生物轉(zhuǎn)化、腸內(nèi)菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化、酶促反應(yīng)及發(fā)酵法等。這些技術(shù)方法都具有各自的優(yōu)勢和不足，針對不同類型化合物生物轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，開展多途徑的轉(zhuǎn)化研究，為篩選合理的工業(yè)化生產(chǎn)工藝創(chuàng)造可能性條件。從文獻(xiàn)報(bào)道來看，實(shí)現(xiàn)甘草酸、甘草次酸生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)化生產(chǎn)還有很長的路要走，在轉(zhuǎn)化技術(shù)方法上還需要不斷地完善。

致謝：本研究得到廣西農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育基地）、廣西重點(diǎn)學(xué)科生物化工、農(nóng)產(chǎn)品深加工與安全技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助，謹(jǐn)此致謝！

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