藥用植物分子育種展望

馬小軍+莫長明

[摘要] 分子輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計(jì)育種是植物分子育種學(xué)三大發(fā)展方向。該文就此3個育種方向的遺傳連鎖作圖、QTL定位作圖、關(guān)聯(lián)分析作圖、分子輔助選擇、花粉管通道介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、基因編輯技術(shù)、全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白組測序和品種分子設(shè)計(jì)等研究領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀和新趨勢進(jìn)行概述，并結(jié)合藥用植物分子育種目標(biāo)和存在問題的探討，展望了此3種分子育種技術(shù)在藥用植物分子育種中的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 藥用植物育種；分子輔助育種；轉(zhuǎn)基因育種；分子設(shè)計(jì)育種

[Abstract] The molecular-assisted breeding，transgenic breeding and molecular designing breeding are three development directions of plant molecular breeding. Base on these three development directions，this paper summarizes developing status and new tendency of research field of genetic linkage mapping，QTL mapping，association mapping，molecular-assisted selections，pollen-mediated transformations，agrobacterium-mediated transformations，particle gun-mediated transformations，genome editing technologies，whole-genome sequencing，transcriptome sequencing，proteome sequencing and varietal molecular designing. The objective and existing problem of medical plant molecular breeding were discussed the prospect of these three molecular breeding technologies application on medical plant molecular breeding was outlooked.

[Key words] medical plant breeding；molecular-assisted breeding；transgenic breeding；molecular designing breeding

分子育種是分子生藥學(xué)的一個重要內(nèi)容。所謂分子育種就是將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于育種中，在分子水平上進(jìn)行育種，它是常規(guī)育種的一個新發(fā)展。常規(guī)育種注重表型選擇，而分子育種強(qiáng)調(diào)基因型選擇。分子育種離不開常規(guī)育種，它也同樣以優(yōu)異表型為育種目標(biāo)，并建立起基因型和表現(xiàn)型之間的聯(lián)系，通過基因型來選擇表現(xiàn)型。藥用植物育種是改善藥材品質(zhì)的重要途徑。近20年來，人們通過系統(tǒng)選育、雜交育種、多倍體育種等常規(guī)育種方法，已培育出了人參、西洋參、地黃、丹參、羅漢果、松藍(lán)、柴胡、桔梗、枸杞、厚樸等許多中藥材新品種。但是，由于藥用植物種類多、生長周期長、雜合度高、育種目標(biāo)特殊等原因，使得藥用植物育種的總體水平較低，育種效率不高。分子育種具有快速、高效、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是未來藥用植物育種學(xué)的發(fā)展方向。為此，本文對分子育種學(xué)的3個主要研究方向——分子輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計(jì)育種的基本概念和技術(shù)進(jìn)行簡要敘述，同時探討藥用植物分子育種存在的問題并展望其應(yīng)用前景，以期引起同行關(guān)注，促使更多的科技工作者投入到藥用植物分子育種工作中來。

1 分子輔助育種

分子輔助育種是分子育種研究和應(yīng)用最多的一個方向。分子輔助育種的原理是把與待研究的表現(xiàn)型刻劃在DNA遺傳圖譜上，通過DNA檢測就可以快速、簡便地進(jìn)行選擇。開展分子輔助育種通常包含遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位、性狀關(guān)聯(lián)分析和優(yōu)良種質(zhì)篩選4個相互聯(lián)系又有一定獨(dú)立性的研究內(nèi)容。

1.1 遺傳連鎖作圖 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建包括3步：①選擇建立適宜的遺傳作圖群體；②選擇合適類型的遺傳標(biāo)記，篩選多態(tài)性標(biāo)記，檢測遺傳作圖群體個體或家系基因型；③確立遺傳標(biāo)記連鎖群、排列順序和距離并繪制圖譜[1]。選擇合適的遺傳作圖群體是成功、高效構(gòu)建完整、高密度遺傳圖譜及定位QTL的關(guān)鍵。植物用于遺傳作圖群體按遺傳穩(wěn)定性可分為F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，BC1，三交等暫時性分離群體和RIL，DH，IF2等永久性分離群體。每類作圖群體各有優(yōu)缺點(diǎn)[2]，會影響遺傳連鎖作圖效率和精度。這些群體都已被廣泛用于自花授粉植物的遺傳連鎖作圖。然而，自交不親和、近交退化、生長周期長的異花授粉植物，較難獲取純合株系，通常以雜交F1[3]，F(xiàn)2和回交群體作為遺傳作圖群體[4]，并結(jié)合擬測交策略[5]構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。因此，遺傳連鎖作圖時應(yīng)結(jié)合具體情況選擇不同類型的分離群體。遺傳連鎖圖譜的分辨率和精度，很大程度還取決于群體的大小。群體越大精度越高，但工作量與費(fèi)用大大增加。遺傳連鎖框架圖譜構(gòu)建可采用大群體中的隨機(jī)小群體（150個單株或家系），需要精細(xì)定位某一連鎖區(qū)域時，通常擴(kuò)大到1 000個以上單株的群體。

遺傳連鎖作圖主要分子標(biāo)記有RFLP，SSR，RAPD，ISSR，AFLP，SNP，SRAP等。每種分子標(biāo)記各有優(yōu)缺點(diǎn)，例如SSR具有多態(tài)性豐富、覆蓋整個基因組、共顯性、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，但引物開發(fā)需要已知序列、成本高[6]；RAPD需要DNA量少、多態(tài)性高于RFLP、實(shí)驗(yàn)操作簡單，但不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型、結(jié)果重復(fù)性差、不適合品種水平分析[7]；SRAP具有簡單、可靠、通量較高、編碼區(qū)片段比例較高、共顯性等特點(diǎn)，能很好定位基因組中開放閱讀框[8]；AFLP可靠、高效，但為顯性標(biāo)記、引物需要標(biāo)記、技術(shù)與設(shè)備要求高、標(biāo)記分布不均勻[9]。SNP在基因組中分布較SSR標(biāo)記廣泛，共顯性或顯性、穩(wěn)定性高、基因內(nèi)部SNP可能直接影響表型、易于自動化[10]。遺傳連鎖作圖時，應(yīng)針對特定物種，根據(jù)具體情況，從標(biāo)記多態(tài)性、顯性、穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)操作難易度、費(fèi)用比等多方面綜合考慮。

遺傳連鎖作圖包括遺傳標(biāo)記分離、連鎖關(guān)系、排序分析和遺傳距離估算等步驟，開發(fā)有MAPMAKER/EXP[11]，Joinmap[12]，CarthaGene[13]等多種作圖軟件。這些軟件在數(shù)據(jù)準(zhǔn)備難易、可視化程度和功能等方面存在較大不同。其中，廣泛使用的有MAPMAKER/EXP 3.0，Joinmap 4.0等軟件。MAPMAKER/EXP 3.0適用于BC1，F(xiàn)2，RIL等群體遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及復(fù)合性狀基因定位。Joinmap 4.0適用于BC1，F(xiàn)2，RIL，DH等群體遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及整合。

遺傳連鎖圖譜還難于直接在育種中發(fā)揮作用，主要用于QTL定位、基因克隆、性狀遺傳分析和基因組比較研究，其飽和度直接影響到QTL定位精確性。因此，構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜對QTL定位十分必要。遺傳連鎖圖譜上標(biāo)記平均間隔，連鎖框架圖譜要求不大于20 cM；主效基因定位要求在10～20 cM或更??；QTL定位要求在10 cM以下；基因克隆要求目標(biāo)區(qū)域在1 cM以下[14]?，F(xiàn)有遺傳連鎖圖譜多數(shù)是由不同群體、標(biāo)記、研究者、實(shí)驗(yàn)條件下所構(gòu)建的，飽和度不夠高。多標(biāo)記多群體作圖增加標(biāo)記位點(diǎn)和圖譜整合是增加遺傳連鎖圖譜飽和度的有效途徑。在具備共有標(biāo)記可用條件下，可直接采用“錨定標(biāo)記策略”，將不同遺傳連鎖圖譜整合成一張公共圖譜、一致性圖譜。這不僅可以增加圖譜的飽和度，還可以擴(kuò)展圖譜的應(yīng)用范圍。在無共有標(biāo)記可用條件下，可先用以往的作圖群體開發(fā)共有分子標(biāo)記再進(jìn)行圖譜整合。分子遺傳連鎖圖譜雖然發(fā)展很快，但是若不與形態(tài)、同工酶、細(xì)胞學(xué)等常規(guī)標(biāo)記結(jié)合起來，其在育種中應(yīng)用價值有限制。因此，必須借助FISH等技術(shù)將分子遺傳連鎖圖譜與經(jīng)典遺傳圖譜、細(xì)胞遺傳圖譜整合成一張綜合遺傳圖譜。這不僅是重要農(nóng)藝性狀準(zhǔn)確定位需要，也是圖位克隆分離目的基因的需要。

1.2 QTL定位作圖 QTL定位作圖的原理與常規(guī)育種中通過表現(xiàn)型3點(diǎn)測驗(yàn)估算交換值來確定基因順序的原理是一樣的，只是表現(xiàn)型換成了“虛擬基因”QTL。其步驟包括：①構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；②檢測與記錄分離群體中個體的遺傳標(biāo)記基因型和數(shù)量性狀表型值；③應(yīng)用適宜統(tǒng)計(jì)方法和軟件，確定QTL在連鎖群或染色體上位置，估算QTL遺傳效應(yīng)參數(shù)，并繪制圖譜。為了提高作圖精度、效率以及更好估算QTL效應(yīng)，QTL定位作圖統(tǒng)計(jì)方法不斷發(fā)展。最初QTL定位作圖廣泛使用的是單標(biāo)記分析法[15]，但其存在無法確切估算QTL位置、低估QTL遺傳效應(yīng)、需求個體數(shù)量多等諸多問題。因此，Lander和Bostein[16]以一元回歸分析與極大似然法為基礎(chǔ)，借助于完整分子連鎖圖，提出了區(qū)間作圖法，其具有近無偏估計(jì)QTL位置與效應(yīng)、所需個體數(shù)量較少等優(yōu)勢，伴隨相應(yīng)軟件Mapmaker/QTL推出而被廣泛應(yīng)用，但也存在一次僅能檢驗(yàn)2個標(biāo)記，無法檢測上位性和基因型與環(huán)境互作等不足。Zeng[17]進(jìn)一步將多元回歸分析與極大似然法結(jié)合，整合其他遺傳標(biāo)記控制遺傳背景效應(yīng)，提出了復(fù)合區(qū)間作圖法，其保持了區(qū)間作圖法的優(yōu)點(diǎn)，同時提高了作圖精度和效率，但仍存在無法分析上位性和基因型與環(huán)境互作，多個連鎖QTL遺傳方差估計(jì)困難等缺點(diǎn)。針對上述定位作圖方法不足，Kao等[18]引入Cockerham模型，多區(qū)間上多個QTL同時檢測，突破了回歸方法的局限，提出多重復(fù)區(qū)間作圖法，改進(jìn)了QTL定位作圖的精確度和有效性，其還可估計(jì)QTL間上位性、個體基因型值與數(shù)量性狀遺傳力，但如何確定合適臨界值缺乏理論支持。針對無法分析復(fù)雜遺傳現(xiàn)象及環(huán)境作用基因效應(yīng)，影響重要農(nóng)藝性狀精細(xì)定位與遺傳效應(yīng)分析問題，朱軍等[19]又提出了基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法。該方法可分析QTL上位性各項(xiàng)遺傳主效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)進(jìn)行QTL定位，但效應(yīng)檢測靈敏度有限。QTL定位作圖統(tǒng)計(jì)分析復(fù)雜，依靠計(jì)算機(jī)來完成非常必要，開發(fā)推出有Mapmaker/QTL[16]，QTL Cartographer[20]，QTLMAPPER[21]，IciMapping[22]，QTLnetwork[23]等多種軟件。

QTL定位的重要目標(biāo)是為分子輔助育種提供選擇標(biāo)記和分離克隆QTL上的基因。目前QTL定位群體多為F2，BC1等初級定位群體，遺傳背景較復(fù)雜、重組率有限和田間實(shí)驗(yàn)無法重復(fù)，影響QTL定位的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，大多數(shù)QTL定位精度不高、在10～30 cM[24]。這一精度無法區(qū)分所定位QTL是單個基因還是數(shù)個QTL連鎖的多基因組成，無法滿足基因分離克隆需要。通常情況下，10～30 cM區(qū)域基因組很可能包含控制同一性狀、效應(yīng)相反的幾個QTL。這會影響性狀改良時在這一區(qū)域的遺傳獲得量和育種值。因此，要進(jìn)一步理解QTL遺傳結(jié)構(gòu)和分離克隆QTL，QTL精細(xì)定位十分重要。為了提高基于QTL精細(xì)定位效果，必須構(gòu)建近等位基因系、回交近交群體和單片段代換系等永久性次級定位群體，開展多年多點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，消除群體內(nèi)遺傳背景和環(huán)境的干擾。這些群體的株系，除目標(biāo)性狀外，遺傳背景基本一致，遺傳背景干擾效應(yīng)被降低至最小，將極大提高了QTL定位的精度，有助于通過染色體登錄和步移法實(shí)現(xiàn)QTL的克隆。

1.3 關(guān)聯(lián)分析作圖 關(guān)聯(lián)分析作圖也稱連鎖不平衡作圖，是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法[25]。關(guān)聯(lián)分析作圖有4個步驟[26]：①種質(zhì)材料的選擇（盡可能包括物種全部表型和遺傳變異），其中核心種質(zhì)是進(jìn)行連鎖不平衡作圖最佳選擇；②運(yùn)用基因組范圍內(nèi)獨(dú)立遺傳標(biāo)記（SSR，SNP，AFLP）和STRUCTURE軟件分析群體結(jié)構(gòu)；③目標(biāo)性狀選擇及其表型鑒定；④全基因組掃描或候選基因關(guān)聯(lián)分析。相比遺傳連鎖分析，關(guān)聯(lián)分析作圖具有3個優(yōu)點(diǎn)：①一般以現(xiàn)有自然群體和人工群體為材料，無需專門構(gòu)建作圖群體；②可同時檢測作圖群體一個座位上的多個等位基因；③可定位數(shù)量性狀基因座位甚至單個基因本身，精度高[24-25]。遺傳連鎖作圖定位的QTL與目標(biāo)基因常相距1 cM以上，分子輔助育種中易發(fā)生目標(biāo)基因丟失或連鎖累贅，而關(guān)聯(lián)分析作圖鑒定的標(biāo)記可達(dá)單個基因水平，可極大提高輔助選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。關(guān)聯(lián)分析作圖最初用于人類遺傳疾病研究，2001年才首次引入到植物遺傳研究中，發(fā)現(xiàn)了dwarf8基因與花期相關(guān)的SSR多態(tài)性位點(diǎn)[27]。關(guān)聯(lián)分析作圖包括標(biāo)記水平的全基因組途徑和序列水平的候選基因途徑2種基本方法，可用于功能基因驗(yàn)證、功能性標(biāo)記開發(fā)和數(shù)量性狀QTL定位等研究。目前，主要集中在研究基因序列變異，轉(zhuǎn)錄后修飾與表型變異關(guān)聯(lián)分析作圖是未來發(fā)展的新方向[28]。雖然關(guān)聯(lián)分析作圖是挖掘優(yōu)異等位基因的有效途徑，但本身也具有局限性。關(guān)聯(lián)分析作圖效果很大程度上取決于群體中連鎖不平衡強(qiáng)弱和分布。連鎖不平衡程度和分布影響因素主要是突變和重組，此外還有群體結(jié)構(gòu)、群體大小、遺傳漂變等[29]。種質(zhì)多態(tài)性不足夠多時，關(guān)聯(lián)分析作圖存在統(tǒng)計(jì)能力降低，不如遺傳連鎖作圖[30]。另外，遺傳連鎖作圖更適合于全基因組的QTL掃描，關(guān)聯(lián)分析作圖則可對特定QTL進(jìn)行更精細(xì)定位，二者進(jìn)行QTL定位作圖時是互補(bǔ)的，可先用遺傳連鎖作圖進(jìn)行初步定位，再用關(guān)聯(lián)分析作圖進(jìn)行精細(xì)定位[30]。據(jù)此，Yu等[31]提出了將遺傳連鎖作圖和關(guān)聯(lián)分析作圖相結(jié)合的巢式關(guān)聯(lián)分析作圖。

1.4 分子輔助選擇應(yīng)用 分子輔助育種方法分前景選擇和背景選擇，在攜帶目標(biāo)基因單株選擇、回交轉(zhuǎn)育材料選擇與評估和數(shù)量性狀改良等方面有廣泛應(yīng)用。Izadi-Darbandi 和Yazdi-Samadi[32]針對高分子麥谷蛋白位點(diǎn)Glu-1，開發(fā)DNA標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，獲得了具有不同面包加工品質(zhì)的伊朗普通小麥品種。Tanweer等[33]通過分子輔助前景選擇法，將根據(jù)遺傳連鎖圖譜圖位克隆的稻瘟病抗性基因Pi-b[34]和Pi-kh[35]聚合到馬來西亞主栽水稻品種MR219中，獲得了具強(qiáng)稻瘟病抗性的純合植株，分子輔助背景選擇評估顯示95%遺傳背景與MR219一致，既提高了瘟病抗性又保持了品種原有優(yōu)良性狀，在保持MR219在農(nóng)戶中的高使用率和產(chǎn)量方面發(fā)揮了重要作用。Sureshkumar等[36]根據(jù)遺傳連鎖圖譜上與低植酸lpa2-2等位基因緊密連鎖標(biāo)記，通過SSR標(biāo)記輔助選擇，回交培育出低植酸玉米品種。Lohithaswa等[37]在玉米F2群體中，鑒定出了3個具有高遺傳力的高粱霜霉病抗性QTL，并通過分子輔助選擇成功滲入到8個易感玉米品系中。Knoll 和 Ejeta[38]利用QTL輔助選擇進(jìn)行了高粱早期耐冷性篩選。Gao等[39]根據(jù)圖位克隆的性別決定基因ACS7，WIP1和抗枯萎病基因Fom-2，設(shè)計(jì)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，篩選出了雌性抗枯萎病甜瓜品種。Zhang等[40]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析作圖，證明大豆產(chǎn)量性狀由許多微效位點(diǎn)控制，并利用鑒定的SNP標(biāo)記和位點(diǎn)進(jìn)行大豆產(chǎn)量的輔助選擇，準(zhǔn)確率達(dá)到0.75～0.87。此外，陳偉等[41]采用混合分離群體分析法（bulked segregant analysis，BSA）快速篩選出了2個油酸含量相關(guān)和4個亞麻酸含量相關(guān)的SSR標(biāo)記，用于分子輔助選擇育種，獲得了遺傳背景與回交親本基本一致的高油酸和低亞麻酸植株。雖然，抗病分子輔助育種取得了明顯進(jìn)展，但是抗蟲、品質(zhì)改良、抗逆等分子輔助育種進(jìn)展緩慢。這是由于現(xiàn)有遺傳連鎖圖譜和QTL定位結(jié)果多源于一個或幾個親本組合，使得圖譜飽和度和QTL穩(wěn)定性低，不宜推廣到更廣泛的種質(zhì)范圍，多數(shù)還難于應(yīng)用于分子輔助育種實(shí)踐，尚需在育種親本和種質(zhì)群體中驗(yàn)證。雖然已構(gòu)建長春花[42]、石斛[43]、柴胡[44]、羅漢果[45]、丹參[46]等數(shù)種藥用植物遺傳連鎖圖譜。但是，這些遺傳連鎖圖譜均是采用單個F1或F2等非永久性分離群體構(gòu)建，因而圖譜飽和度和精度也較低，標(biāo)記間平均距離都多在10.0 cM以上，性狀緊密連鎖標(biāo)記缺乏，目前尚未見應(yīng)用于分子輔助育種研究的報道。簡化基因組測序技術(shù)可快速、高效構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜和篩選性狀相關(guān)標(biāo)記，為解決圖譜飽和度與精度較低問題提供了良好解決途徑。例如，Zhang等[47]和劉甜[48]分別利用RAD-se，SLAF-seq構(gòu)建了黃連花和丹參高密度遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記間平均距離可達(dá)0.7 cM。

2 轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因育種是通過基因工程手段將一種或幾種外源基因轉(zhuǎn)移至某種植物，使其有效表達(dá)出相應(yīng)的產(chǎn)物的一種分子育種方法。轉(zhuǎn)基因的基本原理與常規(guī)雜交育種有相似之處：雜交是將整條基因鏈（染色體）轉(zhuǎn)移，而基因轉(zhuǎn)移是選取最有用的一小段基因轉(zhuǎn)移，因此轉(zhuǎn)基因比雜交具有更高的選擇性。

2.1 常規(guī)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù) 轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)法、花粉管通道法、聚乙二醇介導(dǎo)法和電穿孔法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)法和花粉管通道法為植物轉(zhuǎn)基因育種最常用方法。農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)法具有明顯優(yōu)勢互補(bǔ)性，還融合發(fā)展出了農(nóng)桿槍、粒子轟擊農(nóng)桿菌和菌體微單轟擊轉(zhuǎn)基因育種方法[49]。自從農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[50]、基因槍介導(dǎo)法[51]和花粉管通道法[52]創(chuàng)立以來，至今三者在農(nóng)作物和園藝作物抗病、抗蟲、抗逆等轉(zhuǎn)基因育種中均取得了豐碩成果。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，1987年，Bytebier等[53]首次成功轉(zhuǎn)化單子葉植物獲得石刁柏抗卡那霉素植株；1994年，Hiei等[54]首次成功轉(zhuǎn)化禾本科植物水稻。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)化頻率高、插入片段大且確切、遺傳表達(dá)穩(wěn)定、技術(shù)與設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，從而成為植物轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用最廣泛的方法?；驑尳閷?dǎo)法也因具有受體材料來源廣泛（單子葉植物、雙子葉植物）等優(yōu)點(diǎn)，成為植物轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用第二多的方法?；ǚ酃芡ǖ婪ㄒ虿皇苤参锓N類限制、操作簡單、易普及推廣，得到了一定程度的應(yīng)用，最突出的成果就是培育出了推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。與農(nóng)作物和園藝作物相比，藥用植物轉(zhuǎn)基因育種落后。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法主要在次生代謝產(chǎn)物合成方面有一定研究，由于再生體系和轉(zhuǎn)化體系缺乏，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的研究較少，僅有青蒿[55]、羅漢果[56]和丹參[57]等數(shù)種植物。基因槍介導(dǎo)法也只有白術(shù)[58]和野甘草[59]等少量藥用植物研究報道。藥用植物花粉管通道法轉(zhuǎn)基因育種尚未見有研究報道。

2.2 基因編輯育種技術(shù) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)法和花粉管通道法，3種轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，外源基因都是隨機(jī)整合到宿主基因組中去，轉(zhuǎn)基因效果預(yù)見性不強(qiáng)，存在基因沉默和出現(xiàn)非預(yù)期變異問題?；蚓庉嫾夹g(shù)具有靶向突變、刪除、插入、替換目的基因[60]和可獲得不含外源基因的非轉(zhuǎn)基因植株[61]等優(yōu)點(diǎn)，能很好彌補(bǔ)3種常規(guī)轉(zhuǎn)基因育種方法存在的問題。它們相互結(jié)合已成為一種全新的、強(qiáng)有力的育種方法，正在迅猛發(fā)展。

1996年，Kim等[62]將ZFP（Zinc finger protein）特異識別DNA序列的鋅指結(jié)構(gòu)與核酸內(nèi)切酶FokI的非特異性切割結(jié)構(gòu)域人工串聯(lián)重組融合，形成具有DNA切割功能的新嵌合體融合鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN），創(chuàng)立了第一代基因編輯技術(shù)ZFN。此后，經(jīng)眾多科學(xué)家不斷改進(jìn)，ZFN技術(shù)發(fā)展成為最成熟的基因編輯技術(shù)。2007年，Kay等[63]發(fā)現(xiàn)黃單胞菌分泌注入到植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活子類效應(yīng)因子（transcription activator-like effector，TALE）可以特異性識別、結(jié)合和激活宿主植物特定基因表達(dá)。2010年，Christian等[64]將TALE特異性識別結(jié)合DNA的重復(fù)序列中央結(jié)構(gòu)域與FokI的催化切割結(jié)構(gòu)域進(jìn)行串聯(lián)融合，得到了能打斷DNA雙鏈的人工重組轉(zhuǎn)錄激活子類效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN），發(fā)展出了第二代基因編輯技術(shù)TALEN。2007年，丹麥的Barrangou等[65]首次證實(shí)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其位點(diǎn)附近相關(guān)基因（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ associated，CRISPR/CAS）是細(xì)菌的獲得性免疫防御系統(tǒng)，用于特異性識別并降解清除外源核酸，以抵御病毒和質(zhì)粒入侵。2012年，Jinek等[66]發(fā)現(xiàn)在crRNA和tracrRNA互補(bǔ)雙鏈RNA引導(dǎo)下，CRISPR/CAS9系統(tǒng)能定向打斷DNA雙鏈，并提出在設(shè)計(jì)精妙的單鏈RNA引導(dǎo)下，該系統(tǒng)可用于基因編輯。2013年，Cong等[67]成功應(yīng)用CRISPR/ CAS9系統(tǒng)對哺乳動物基因組進(jìn)行多重基因編輯，開發(fā)出第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/CAS9。2015年，Zetsche等[68]又發(fā)現(xiàn)了具有內(nèi)切酶更易進(jìn)入組織細(xì)胞、產(chǎn)生粘性末端、目標(biāo)位點(diǎn)選擇更靈活的全新CRISPR/CAS基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1。最近，Gao等[69]還發(fā)明了古生菌Argonaute蛋白在DNA引導(dǎo)下進(jìn)行基因組編輯的技術(shù)NgAgo，被譽(yù)為第四代基因編輯技術(shù)。

ZFN技術(shù)原理為，人工設(shè)計(jì)重組合成ZFN，導(dǎo)入到細(xì)胞中，通過鋅指結(jié)構(gòu)靶向特異性的DNA位點(diǎn)并結(jié)合，然后利用FokI核酸酶切割結(jié)構(gòu)域剪切特定位點(diǎn)DNA，最后借助細(xì)胞內(nèi)固有同源重組或非同源末端連接途徑修復(fù)DNA缺口[70]，完成特定DNA序列的堿基突變、刪除、插入和替換等編輯工作。除通過TALE重復(fù)序列中央結(jié)構(gòu)域識別并結(jié)合特定DNA外，TALEN其他技術(shù)原理與ZFN技術(shù)類似。CRISPR/CAS9技術(shù)原理為，人工設(shè)計(jì)合成與特異DNA位點(diǎn)具有同源性的單鏈向?qū)NA（a singal guide RNA，sgRNA），并構(gòu)建sgRNA和CAS9蛋白質(zhì)粒載體，通過體外表達(dá)后注入或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)的方式，使sgRNA和CAS9蛋白得以在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合形成特異識別切割復(fù)合體，然后切割復(fù)合體在sgRNA同源互補(bǔ)結(jié)合引導(dǎo)下靶向特異DNA位點(diǎn)，在CAS9蛋白作用下進(jìn)行DNA雙鏈剪切，最后也是借助細(xì)胞內(nèi)固有同源重組或非同源末端連接途徑修復(fù)DNA缺口，完成特定DNA序列的堿基突變、刪除、插入和替換等編輯。CRISPR/Cpf1技術(shù)與CRISPR/CAS9技術(shù)原理類似，不同是所使用的核酸內(nèi)切酶不一樣。通過農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)法，ZFN，TALEN和CRISPR/CAS技術(shù)都已被用于煙草、水稻、小麥、番茄、葡萄、甘藍(lán)、蘋果、甜橙等[71-79]眾多作物產(chǎn)量、抗病、抗除草劑、品質(zhì)、雄性不育、開花基因靶向突變、刪除、插入和替換研究。三者應(yīng)用范圍有較大重復(fù)，但三者又各有技術(shù)特點(diǎn)和適用范圍。ZFN和TALEN技術(shù)，針對不同靶DNA序列，需要重新設(shè)計(jì)合成新核酸酶，實(shí)驗(yàn)繁瑣、成本高。CRISPR/CAS技術(shù)僅需設(shè)計(jì)合成一個能夠結(jié)合目標(biāo)序列的短片段sgRNA，實(shí)驗(yàn)簡單方便，但也存在脫靶率突出和目標(biāo)序列附近下游必須存在PAM保守序列問題。NgAgo技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不穩(wěn)定，仍需要進(jìn)一步優(yōu)化完善。

3 分子設(shè)計(jì)育種

分子設(shè)計(jì)育種是一種基于全基因組測序基礎(chǔ)上的前沿分子育種方法，是對育種程序中的諸多因素進(jìn)行模擬、篩選和優(yōu)化，提出最佳目標(biāo)基因型以及實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因型的親本選配和后代選擇策略，以提高作物育種中的預(yù)見性和育種效率，實(shí)現(xiàn)從傳統(tǒng)的“經(jīng)驗(yàn)育種”到定向、高效的“精確育種”的轉(zhuǎn)化。

3.1 基因組研究進(jìn)展 基因組研究包括以全基因組測序?yàn)榇淼慕Y(jié)構(gòu)基因組學(xué)和以轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等為代表的功能基因組學(xué)。全基因組測序遺傳圖譜、物理圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜是分子設(shè)計(jì)育種的藍(lán)圖。轉(zhuǎn)錄組測序分離鑒定的基因以及揭示的化合物合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、性狀控制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是分子設(shè)計(jì)育種重要理論基礎(chǔ)。采用第一代DNA雙脫氧核苷酸末端終止法與化學(xué)降解法測序技術(shù)完成了擬南芥[80]、水稻[81]、楊樹[82]等模式植物基因組測序。伴隨第二代高通量、低成本的454，Solexa，SOLiD測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，黃瓜[83]、玉米[84]、大豆[85]等越來越多作物也相繼完成了基因組測序，涵蓋糧食、園藝和油料作物[86]。NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄了150多種植物的基因組數(shù)據(jù)。藥用植物受遺傳背景不清、雜合度高、序列重復(fù)性多等因素限制，基因組測序起步晚，研究遠(yuǎn)不及農(nóng)作物。2010年才完成首個藥用植物丹參基因組框架圖，隨后相繼完成了人參和靈芝基因組測序。近年隨著讀長更長（可達(dá)10 kb）的第三代SMRT單分子實(shí)時測序技術(shù)成熟推出，解決了第二代測序技術(shù)海量數(shù)據(jù)拼接難、高GC含量區(qū)域無法跨越和高度重復(fù)片段無法準(zhǔn)確測定等問題，將二代和三代測序技術(shù)優(yōu)勢互補(bǔ)結(jié)合，完成了首個高雜合、高重復(fù)序列木本藥用植物杜仲基因組精細(xì)圖的構(gòu)建。伴隨藥用植物基因組測序計(jì)劃的開展，羅漢果等越來越多的藥用植物基因組信息也將可獲得。由于獲取信息多、成本較低、簡單高效等優(yōu)點(diǎn)，簡化基因組測序也正蓬勃發(fā)展，包括RAD-seq，GBS，SLAF-seq等技術(shù)，已被用于眾多植物的復(fù)雜性狀連鎖標(biāo)記開發(fā)[87-89]、高密度遺傳圖譜構(gòu)建[90-93]、QTL精細(xì)定位[93-95]、群體遺傳結(jié)構(gòu)與多樣性分析[96-97]等研究。此外，藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究更是發(fā)展迅速，先后進(jìn)行了青蒿、丹參、西洋參、紅豆杉、三七、柴胡、紅花、金銀花、地黃、人參等40多種藥用植物研究[98]，且在人參三萜皂苷、紅花黃酮、丹參酮關(guān)鍵酶基因鑒定[99-101]和長春花、羅漢果化合物代謝途徑解析[102-103]等方面取得了長足進(jìn)展。

3.2 分子設(shè)計(jì)育種進(jìn)展 2003年，荷蘭科學(xué)家Peleman和van der Voort首次提出分子設(shè)計(jì)育種概念[104]。分子設(shè)計(jì)育種是以生物信息學(xué)為平臺，以基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和種質(zhì)信息等相關(guān)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，綜合育種過程中所有學(xué)科的有用信息，根據(jù)作物育種目標(biāo)和生長環(huán)境，在計(jì)算機(jī)上虛擬設(shè)計(jì)篩選出最佳目標(biāo)基因型和育種方案，然后據(jù)此開展作物育種實(shí)驗(yàn)的分子育種方法。分子設(shè)計(jì)育種是一種從傳統(tǒng)“經(jīng)驗(yàn)式”到“定向、高效、精準(zhǔn)”轉(zhuǎn)變的育種方法，也是一個結(jié)合分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、栽培學(xué)、植物保護(hù)學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)等多學(xué)科的系統(tǒng)工程。分子設(shè)計(jì)育種主要包括3個步驟[105]：①尋找目標(biāo)性狀基因（或生產(chǎn)品種的原材料），即通過遺傳群體構(gòu)建、多態(tài)性標(biāo)記篩選、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀表型鑒定等研究，鑒定目標(biāo)性狀基因及基因關(guān)系；②尋找目標(biāo)品種（或設(shè)計(jì)品種原型），即根據(jù)不同生態(tài)環(huán)境條件，利用已經(jīng)鑒定出的各種重要育種性狀的基因信息（染色體上基因位置、基因遺傳效應(yīng)、基因到性狀的表達(dá)和生化途徑、基因間互作、基因與背景環(huán)境互作等），模擬預(yù)測各種可能基因型的表型，從中選擇符合特定育種目標(biāo)的基因型品種；③尋找育種途徑，即設(shè)計(jì)目標(biāo)基因型品種選育途徑（或制定生產(chǎn)品種的育種方案）。分子設(shè)計(jì)育種一提出，國內(nèi)外均意識到其將會成為未來作物育種的發(fā)展方向，紛紛開始布局研究，在前期研究積累信息多的作物取得了一些進(jìn)展。“全球水稻分子育種計(jì)劃”項(xiàng)目已開始實(shí)施。美國已投資建立了4個小麥分子育種實(shí)驗(yàn)室。我國在水稻、大豆、小麥、油菜和植物花色等領(lǐng)域也啟動了分子設(shè)計(jì)育種計(jì)劃[106]。分子設(shè)計(jì)育種需要重要性狀QTL或基因定位與克隆、基因型到性狀表型控制機(jī)制、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫、品種預(yù)測模型及模擬工具、分子輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種、遺傳群體培育與創(chuàng)新等研究基礎(chǔ)做鋪墊。受這些基礎(chǔ)研究缺乏限制，分子設(shè)計(jì)育種仍面臨著一些巨大挑戰(zhàn)，基本還處于性狀遺傳解析、實(shí)驗(yàn)室建立、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、設(shè)計(jì)育種理論與技術(shù)體系建立等前期工作的準(zhǔn)備當(dāng)中。但是，隨著相關(guān)支撐條件不斷完善和分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，分子設(shè)計(jì)育種必將在提高育種效率、準(zhǔn)確性和降低育種成本方面發(fā)揮重要作用，從而成為解決傳統(tǒng)育種瓶頸的唯一途徑。

4 植物分子育種三大方向發(fā)展趨勢

為更好了解研究發(fā)展趨勢和最新進(jìn)展，按5年為1個時間段，對1992年至2016年共25年間，植物分子輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計(jì)育種相關(guān)研究論文數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。隨著時間發(fā)展，該三大植物分子育種研究方向論文數(shù)均逐年增長。其中，分子輔助育種和分子設(shè)計(jì)育種研究增長迅速，尤其是分子設(shè)計(jì)育種研究，轉(zhuǎn)基因育種研究則在2002—2006年大幅增長后，增幅放緩。這可能與其受到社會反轉(zhuǎn)基因呼聲影響有關(guān)。分子輔助育種的遺傳連鎖作圖、QTL定位作圖研究穩(wěn)步發(fā)展，關(guān)聯(lián)分析作圖研究出現(xiàn)爆發(fā)式增長，分子輔助選擇進(jìn)展則相對緩慢；轉(zhuǎn)基因育種以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化研究為主，其次為基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化研究，CRISPR/CAS基因編輯研究則因其簡單易行特點(diǎn)被推崇也出現(xiàn)爆發(fā)式增長；分子設(shè)計(jì)育種的轉(zhuǎn)錄組測序研究因其廉價高效特點(diǎn)而井噴式增長，全基因組測序和蛋白組測序研究穩(wěn)步增加，品種分子設(shè)計(jì)研究開始起步，并在材料平臺、設(shè)計(jì)軟件開發(fā)和目標(biāo)品種模擬設(shè)計(jì)方面取得一些實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，根據(jù)設(shè)計(jì)方案培育出了滿足在UK環(huán)境下生長目標(biāo)的品種[107-109]。

5 藥用植物分子育種存在的問題與展望

5.1 提高藥效是藥用植物分子育種的主要目標(biāo) 提高療效在藥材中體現(xiàn)為提高有效成分含量的育種研究，這是藥用植物分子育種的主要目標(biāo)，也是藥用植物育種的基本要求。藥用植物分子育種的對象只能選擇有效成分明確并且以單體成分為用途的藥用植物，例如開展青蒿（青蒿素）、紅豆杉（紫杉醇）、銀杏（銀杏內(nèi)酯B）、蛇足石杉（石杉堿甲）、穿心蓮（穿心蓮乙素）、人參（人參皂苷Rd，Rh₂，Rg₃）、羅漢果（羅漢果甜苷5、賽門苷等）等分子育種研究，對于有效成分不確定以及不以單一中藥成分為生產(chǎn)目標(biāo)的藥材不能盲目開展育種工作。轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析已成為次生代謝化合物合成關(guān)鍵酶鑒定和代謝途徑解析的有效策略，如Ithin等[110]鑒定了土豆和番茄中參與甾體糖苷生物堿代謝合成的10個關(guān)鍵酶基因；Frusciante等[111]解析了藏紅花中藏紅花素生物合成第一步專屬代謝途徑關(guān)鍵酶基因；Itkin等[103]解析了羅漢果中羅漢果皂苷Ⅰ至皂苷Ⅵ完整代謝合成途徑?；蚓庉嫾夹g(shù)是進(jìn)行基因功能鑒定和新品種培育的有力工具。采用TALEN技術(shù)，Müller等[112]通過基因靶向敲出鑒定了參與擬南芥次生代謝化合物植保素camalexin生物合成關(guān)鍵酶基因CYP71A12。采用CRISPR/Cas 9技術(shù)，Jiang 等[113]靶向抑制FAD2基因表達(dá)，顯著增加了異源六倍體亞麻薺的油酸含量；Alagoz等[114]精確地靶向敲出藥用植物罌粟生物堿代謝關(guān)鍵酶基因4′OMT2，使其發(fā)生1～4個堿基的InDel突變，實(shí)現(xiàn)對生物堿代謝途徑的平衡調(diào)控，有效降低了生物堿的含量。成分含量為多基因控制的數(shù)量性狀，育種難度大。有效成分明確的藥用植物可將轉(zhuǎn)錄組、遺傳轉(zhuǎn)化、基因編輯和代謝組等技術(shù)有機(jī)結(jié)合，進(jìn)行有效成分與毒性成分基因挖掘、功能鑒定和代謝途徑解析，以及增加紅豆杉、蛇足石杉等有效成分含量低藥用植物藥效與減少半夏、附子等有毒藥用植物毒性的育種研究。種群內(nèi)有效成分存在嚴(yán)重分離的，還可采用擬測交或BSA策略，充分發(fā)揮新一代測序技術(shù)強(qiáng)大分析能力，進(jìn)行SLAF，GBS等簡化基因組測序和遺傳連鎖、QTL定位、關(guān)聯(lián)分析作圖研究，快速鑒定與有效成分含量緊密連鎖的分子標(biāo)記和QTL，借助分子輔助選擇技術(shù)提高良種篩選和純種培育的效率，加快育種進(jìn)程。當(dāng)然，品種培育試驗(yàn)與生產(chǎn)應(yīng)用過程應(yīng)符合現(xiàn)行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》要求，進(jìn)行受體植物、基因操作和轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品安全性（遺傳穩(wěn)定性、環(huán)境安全性、食用安全性）評價。轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品食用安全性評價，除了規(guī)定的毒理學(xué)評價、致敏性評價、關(guān)鍵成分分析和全食品安全性評價外，還必須進(jìn)行用藥安全性評價。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在藥用植物育種中應(yīng)用的增加，是否需要制定出專門針對藥材轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的管理規(guī)定，應(yīng)認(rèn)真、慎重的討論。

5.2 挖掘和創(chuàng)造優(yōu)良農(nóng)藝性狀也是藥用植物的分子育種目標(biāo) 在確保中藥藥效的前體下，改善農(nóng)藝性狀也是藥用植物育種的目標(biāo)。種子繁育種苗混雜、產(chǎn)量低而種植無效益、產(chǎn)量低而藥材價格過高、病蟲多而藥材農(nóng)殘嚴(yán)重是中藥材產(chǎn)業(yè)面臨的突出問題。優(yōu)異農(nóng)藝性狀關(guān)系到藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量，包括更高的生物產(chǎn)量、更好的抗病、抗蟲、抗逆性狀和特殊農(nóng)藝性狀等。這些性狀均為復(fù)雜的數(shù)量性狀，且藥用植物種類繁多，大多數(shù)剛完成從野生到家種的轉(zhuǎn)變，性狀遺傳規(guī)律認(rèn)識不足，種質(zhì)缺乏且雜合度高，還存在生長周期長與自交不親和問題。藥用植物育種僅采用系統(tǒng)選育和雜交選育方法進(jìn)行良種選育將收效甚微，需要借助分子輔助選擇等技術(shù)來提高效率和加速育種進(jìn)程。半夏、三七等種群內(nèi)農(nóng)藝性狀存在嚴(yán)重分離的藥用植物也可采用擬測交或BSA策略，應(yīng)用遺傳連鎖分析進(jìn)行初步作圖和QTL定位，再利用SLAF，GBS等簡化基因組測序分析進(jìn)行精細(xì)作圖和QTL定位，快速獲得與產(chǎn)量、抗病蟲、抗逆、性別等性狀連鎖的分子標(biāo)記和QTL，借助分子輔助育種技術(shù)篩選優(yōu)良種質(zhì)、培育純種和開展聚合育種研究，即將各種優(yōu)異性狀基因和QTL逐步集中于某個單一品種是藥用植物育種更高的要求。采用CRISPR/Cas 9技術(shù)，Shi等[115]靶向突變玉米乙烯反應(yīng)負(fù)調(diào)控基因ARGOS8，使玉米開花期受脅迫條件下的產(chǎn)量每英畝增加了136.08 kg。Wang等[116]靶向突變稻瘟病侵染效應(yīng)因子基因OsERF922，增強(qiáng)了水稻稻瘟病抗性，且農(nóng)藝性狀與野生型無顯著差異。因此，種質(zhì)嚴(yán)重缺乏的珍稀瀕危藥用植物，還可運(yùn)用基因編輯技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和新品種的培育。

5.3 藥用植物常規(guī)育種研究是分子育種的基礎(chǔ) 強(qiáng)大的常規(guī)育種研究基礎(chǔ)，能更有效、更精準(zhǔn)的應(yīng)用分子育種技術(shù)。如果沒有常規(guī)育種提供的遺傳群體材料和性狀信息作為基礎(chǔ)，分子育種就成為無源之水。與農(nóng)作物相比，藥用植物的常規(guī)育種研究基礎(chǔ)薄弱，突出表現(xiàn)在種質(zhì)全面收集保存、種質(zhì)系統(tǒng)評價鑒定、性狀遺傳規(guī)律分析、核心種質(zhì)構(gòu)建、遺傳材料分離純化、種質(zhì)創(chuàng)新等研究工作不足，以致優(yōu)異突變體、高純度品系、重組自交系、近等位基因系、回交近交群體和單片段代換系等遺傳群體材料缺乏。因此，必須加強(qiáng)這些周期長、基礎(chǔ)薄弱的常規(guī)育種研究的持續(xù)積累。

5.4 充分利用最新分子生物學(xué)技術(shù)為分子育種服務(wù) 新品種培育如何確保藥材療效是中藥領(lǐng)域廣泛關(guān)注的問題，也是藥用植物育種面臨的巨大挑戰(zhàn)。分子設(shè)計(jì)育種是一種綜合了多學(xué)科、多層次信息的高效、精準(zhǔn)、預(yù)見性強(qiáng)的育種技術(shù)。除了目標(biāo)性狀發(fā)生變異外，其他性狀保持不變是分子設(shè)計(jì)育種要達(dá)到的目標(biāo)。因此，分子設(shè)計(jì)育種可很好適應(yīng)藥用植物新品種培育過程中確保藥材療效的要求。全基因組測序、控制性狀QTL或基因的定位與克隆鑒定、基因型到性狀表型控制機(jī)制、基因與環(huán)境互作效應(yīng)、分子輔助選擇技術(shù)、基因組編輯技術(shù)、種質(zhì)資源培育與創(chuàng)新等研究是分子設(shè)計(jì)育種的必要基礎(chǔ)。藥用植物雖然在遺傳圖譜構(gòu)建、基因組測序、次生代謝產(chǎn)物基因挖掘與鑒定、種質(zhì)收集評價等方面取得了一定進(jìn)展，但是分子設(shè)計(jì)育種這些相關(guān)基礎(chǔ)研究積累仍相當(dāng)薄弱。因此，應(yīng)選擇如丹參、靈芝等已完成基因組測序、前期研究積累相對較多的藥用植物，制定中長期育種科研規(guī)劃，借助基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、翻譯組、小RNA組、表觀遺傳組、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因編輯、合成生物學(xué)等日新月異的分子生物學(xué)技術(shù)和信息技術(shù)，盡快建立藥用植物分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)體系，相信這些新技術(shù)的應(yīng)用必將為藥用植物種質(zhì)創(chuàng)新帶來重大突破。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 黃昆.大豆遺傳圖譜的構(gòu)建[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（7）：121.

[2] 李燦東.大豆QTL作圖群體與定位方法研究進(jìn)展[J].大豆科技，2014（3）：20.

[3] Yamamoto T，Kimura T，Shoda M，et al. Genetic linkage maps constructed by using an interspecific cross between Japanese and European pears[J]. Theor Appl Genet，2002，106（1）： 9.

[4] Hurme P，Sillanp M J，Arjas E，et al. Genetic basis of climatic adaptation in scots pine by bayesian quantitative trait locus analysis[J]. Genetic，2000，156（3）： 1309.

[5] Grattapaglia D，Sederoff R. Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and Eucalyptus urophylla using a pseudo-testcross： mapping strategy and RAPD markers[J]. Genetics，1994，137（4）： 1121.

[6] Litt M，Luty J A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene[J]. Am J Hum Genet，1989，44（3）： 397.

[7] Williams J G，Kubelik A R，et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J]. Nucleic Acids Res，1990，18（22）： 6531.

[8] Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Thero Appl Genet，2001，103（2）： 455.

[9] Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al. AFLP： a new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Res，1995，23（21）： 4407.

[10] Lai E，Riley J，Purvis L，et al. A 4-Mb high-density single nucleotide polymorphism-based map around human APOE[J]. Genomics，1998，54（1）： 31.

[11] Lander E S，Green P，Abrahamson J，et al. Mapmaker： an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations[J]. Genomics，1987，1（2）： 174.

[12] Stam P. Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package： joinmap[J]. Plant J，1993，3（5）： 739.

[13] de Givry S，Bouchez M，Chabrier P，et al. Carhta gene： multipopulation integrated genetic and radiation hybrid mapping[J]. Bioinformatics，2005，21（8）： 1703.

[14] 阮成江，何禎詳，欽佩.我國農(nóng)作物QTL定位研究的現(xiàn)狀和進(jìn)展[J].植物學(xué)通報，2003，20（1）：10.

[15] Sax K. The Association of size differences with seed-coat pattern and pigmentation in Phaseolus vulgrais [J]. Genetics，1923，8（6）： 552.

[16] Lander E S，Botstein D. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps[J]. Genetics，1989，121（1）： 185.

[17] Zeng Z B. Precision mapping of quantitative trait loci[J]. Genetics，1994，136（4）： 1457.

[18] Kao C H，Zeng Z B，Teasdale R D. Multiple interval mapping for quantitative trait loci[J]. Genetics，1999，152（3）： 1203.

[19] 朱軍.運(yùn)用混合線性模型定位復(fù)雜數(shù)量性狀基因的方法[J].浙江大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1999，33（3）：327.

[20] Basten C J，Weir B S，Zeng Z B. Zmap-a QTL cartographer[C]. Guelph，Ontario，Canada：Proccedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production： Computing Strategies and Software，1994.

[21] Wang D L，Zhu J，Li Z K，et al. Mapping QTLs with epistatic effects and QTL×environment interactions by mixed linear model approaches[J]. Theor Appl Genet，1999，99（7）： 1255.

[22] Yang J，Zhu J，Willians R W. Mapping the genetic architecture of complex traits in experimental population[J]. Bioinformatics，2007，23（12）： 1527.

[23] Yang J，Hu C C，Hu H，et al. QTLNetwork： mapping and visualizing genetic architecture of complex traits in experimental population[J]. Bioinformatics，2008，24（5）： 721.

[24] Flint-Garcia S A，Thuillet A C，Yu J，et al. Maize association population： a high-resolution platform for quantitative trait locus dissection[J]. Plant J，2005，44（6）： 1054.

[25] Flint-Garcia S A，Thornsberry J M，Buckler E S. Structure of linkage disequilibrium in plants[J]. Annu Rev Plant Biol，2003，54（4）： 357.

[26] 金亮，包勁松.植物性狀-標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2009，7（6）：1048.

[27] Thornsberry J M，Goodman M M，Doebley J，et al. Dwarf8 polymorphisms associate with variation in flowering time[J]. Nat Genet，2001，28（3）： 286.

[28] Rafalski J A. Association genetics in crop improvement[J]. Curr Opin Plant Biol，2010，13（2）： 1.

[29] Rafalski A，Morgante M. Corn and humans： recombination and linkage disequilibrium in two genomes of similar size[J]. Trends Genetics，2004，20（2）： 103.

[30] 王榮煥，王天宇，黎裕.關(guān)聯(lián)分析在作物種質(zhì)資源分子評價中的應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報，2007，8（3）：366.

[31] Yu J，Holland J B，MeMullen M D，et al. Genetic design and statistical power of nested association mapping in maize[J]. Genetics，2008，178（1）： 539.

[32] Izadi-Darbandi A，Yazdi-Samadi B. Marker-assisted selection of high molecular weight glutenin alleles related to bread-making quality in Iranian common wheat （Triticum aestivum L.） [J]. J Genet，2012，91（2）： 193.

[33] Tanweer F A，Rafii M Y，Sijam K，et al. Introgression of blast resistance genes （Putative Pi-b and Pi-kh） into elite rice cultivar MR219 through marker-assisted selection[J]. Front Plant Sci，2015，6（32）： 1002.

[34] Wang Z X，Yano M，Yamanouchi U，et al. The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes[J]. Plant J，1999，19（1）： 55.

[35] Sharma T R，Madhav M S，Singh B K，et al. High-resolution mapping，cloning and molecular characterization of the Pi-k （h） gene of rice，which confers resistance to Magnaporthe grisea[J]. Mol Genet Genomics，2005，274（6）： 569.

[36] Sureshkumar S，Tamilkumar P，Senthil N，et al. Marker assisted selection of low phytic acid trait in maize （Zea mays L.） [J]. Hereditas，2014，151（1）： 20.

[37] Lohithaswa H C，Jyothi K，Sunil Kumar K R，et al. Identification and introgression of QTLs implicated in resistance to sorghum downy mildew （Peronosclerospora sorghi （Weston and Uppal） C. G. Shaw） in maize through marker-assisted selection[J]. J Genet，2015，94（4）： 741.

[38] Knoll J，Ejeta G. Marker-assisted selection for early-season cold tolerance in sorghum： QTL validation across populations and environments[J]. Theor Appl Genet，2008，116（4）： 541.

[39] Gao P，Liu S，Zhu Q L，et al. Marker-assisted selection of Fusarium wilt-resistant and gynoecious melon （Cucumis melo L.） [J]. Genet Mol Res，2015，14（4）： 16255.

[40] Zhang J，Song Q，Cregan P B，et al. Genome-wide association study，genomic prediction and marker-assisted selection for seed weight in soybean （Glycine max） [J]. Theor Appl Genet，2016，129（1）： 117.

[41] 陳偉，范楚川，欽潔，等.分子標(biāo)記輔助選擇改良甘藍(lán)型油菜種子油酸和亞麻酸含量[J].分子植物育種，2011，9（2）：190.

[42] Shokeen B，Choudhary S，Sethy N K，et al. Development of SSR and gene-targeted markers for construction of a framework linkage map of Catharanthus roseus[J]. Ann Bot，2011，108（2）： 321.

[43] Feng S，Zhao H，Lu J，et al. Preliminary genetic linkage maps of Chinese herb Dendrobium nobile and D. moniliforme[J]. J Genet，2013，92（2）： 205.

[44] Zhan Q Q，Sui C，Wei J H，et al. Construction of genetic linkage map of Bupleurum chinense DC. using ISSR and SSR markers[J]. Acta Pharmaceutica Sin，2010，45（4）： 517.

[45] Liu L，Ma X，Wei J，et al. The first genetic linkage map of Luohanguo （Siraitia grosvenorii） based on ISSR and SRAP markers[J]. Genome，2011，54（1）： 19.

[46] 宗成堃，宋振巧，陳海梅，等.利用SSR、SRAP和ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建首張丹參遺傳連鎖圖譜[J].藥學(xué)學(xué)報，2015，50（3）：360.

[47] Zhang Q，Li L，vanBuren R，et al. Optimization of linkage mapping strategy and construction of a high-density American lotus linkage map[J]. BMC Genomics，2014，15（1）： 372.

[48] 劉甜.利用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建高密度丹參連鎖圖譜[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[49] 耿立召，劉傳亮，李付廣.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與基因槍轟擊法結(jié)合在植物遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報，2005（1）：205.

[50] Shaw C H，Leemans J，Shaw C H，et al. A general method for the transfer of cloned genes to plant cells[J]. Gene，1983，23（3）： 315.

[51] Klein R M，Wolf E D，Wu R，et al. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells[J]. Biotechnology，1987，24（6117）：384.

[52] Hess D. Investigation on the intra- and interspecific transfer of anthocyanin genes using pollen as vectors[J]. Zeitschrift Fuer Pflanzenphyxiologie，1980，98（4）： 321.

[53] Bytebier B，Deboeck F，De Greve H，et al. T-DNA organization in tumor cultures and transgenic plants of the monocotyledon Asparagus officinalis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1987，84（15）： 5345.

[54] Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J]. Plant J，1994，6（2）： 271.

[55] 馮麗玲.青蒿反義鯊烯合酶基因轉(zhuǎn)化培育青蒿素高產(chǎn)植株的研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[56] 曾雯雯.羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與CS基因的轉(zhuǎn)化研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2015.

[57] 化文平，劉文超，王喆之，等.干涉丹參SmORA1對植物抗病和丹參酮類次生代謝的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（3）：491.

[58] 毛碧增，孫麗，劉雪輝.基因槍轉(zhuǎn)化雙價防衛(wèi)基因獲得抗立枯病白術(shù)[J].中草藥，2008，39（1）：99.

[59] Yashodahara V，Sadanandam A. Biolistic transformation of Scoparia dulcis L[J]. Physiol Mol Biol Plants，2016，22（1）： 61.

[60] Ceasar S A，Rajian V，Prykhozhij S V，et al. Insert，remove or replace： a highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9[J]. Biochim Biophys Acta，1863（9）： 2333.

[61] Zhang Y，Liang Z，Zong Y，et al. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA[J]. Nat Commun，2016，7： 12617.

[62] Kim Y G，Cha J，Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes： zinc finger fusions to Fok Ⅰ cleavage domain[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（3）： 1156.

[63] Kay S，Hahn S，Marois E，et al. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator[J]. Science，2007，318（5850）： 648.

[64] Christian M，Cermak T，Doyle E L，et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J]. Genetics，2010，186（2）： 757.

[65] Barrangou R，F(xiàn)remaux C，Deveau H，et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science，2007，315（5819）： 1709.

[66] Jinek M，Chylinski K，F(xiàn)onfara I，et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science，2012，337（6096）： 816.

[67] Cong L，Ran F A，Cox D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science，2013，339（6121）： 819.

[68] Zetsche B，Gootenberg J S，Abudayyeh O O，et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system[J]. Cell，2015，163（3）： 759.

[69] Gao F，Shen X Z，Jiang F，et al. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute[J]. Nat Biotechnol，2016，34（7）： 768.

[70] Qi Y，Zhang Y，Zhang F，et al. Increasing frequencies of site-specific mutagenesis and gene targeting in Arabidopsis by manipulating DNA repair pathways[J]. Genome Res，2013，23（3）： 547.

[71] Townsend J A，Wright D A，Winfrey R J，et al. High frequency modification of plant genes using engineered zinc finger nucleases[J]. Nature，2009，459（7245）： 442.

[72] Shan Q，Wang Y，Li J，et al. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system[J]. Nat Protoc，2014，9（10）： 2395.

[73] Wang Y，Cheng X，Shan Q，et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J]. Nat Biotechnol，2014，32（9）： 947.

[74] Zhou H，He M，Li J，et al. Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system[J]. Sci Rep，2016，6： 37395.

[75] Pan C，Ye L，Qin L，et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient and heritable targeted mutagenesis in tomato plants in the first and later generations[J]. Sci Rep，2016，6： 24765.

[76] Ren C，Liu X，Zhang Z，et al. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in Chardonnay （Vitis vinifera L.） [J]. Sci Rep，2016，6： 32289.

[77] Sun Z，Li N，Huang G，et al. Site-specific gene targeting using transcription activator-like effector （TALE）-based nuclease in Brassica oleracea[J]. J Intergr Plant Biol，2013，55（11）： 1092.

[78] Peer R，Rivlin G，Golobovitch S，et al. Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in perennial fruit trees[J]. Planta，2015，241（4）： 941.

[79] Jia H，Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA[J]. PLoS ONE，2014，9（4）： e93806.

[80] Tabata S，Kaneko T，Nakamura Y，et al. Sequence and analysis of chromosome 5 of the plant Arabidopsis thaliana[J]. Nature，2000，408（6814）： 823.

[81] Goff S A，Ricke D，Lan T H，et al. A draft sequence of the rice genome （Oryza sativa L. ssp. japonica） [J]. Science，2002，296（5565）： 92.

[82] Tuskan G A，Difazio S，Jansson S，et al. The genome of black cottonwood，Populus trichocarpa （Torr. & Gray） [J]. Science，2006，313（5793）： 1596.

[83] Huang S，Li R，Zhang Z，et al. The genome of the cucumber，Cucumis sativus L[J]. Nat Genet，2009，41（12）： 1275.

[84] Feuillet C，Eversole K. Plant science. Solving the maze[J]. Science，2009，326（5956）：1071.

[85] Schmutz J，Cannon S B，Schlueter J. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean[J]. Nature，2010，463（7278）： 178.

[86] 劉蓉蓉.高等植物基因組測序回顧與展望[J].生物技術(shù)通報，2011（5）：11.

[87] Gamble T. Using RAD-seq to recognize sex-specific markers and sex chromosome systems[J]. Mol Ecol，2016，25（10）： 2114.

[88] Mhora T T，Ernest E G，Wisser R J，et al. Genotyping-by-sequencing to predict resistance to lima bean downy mildew in a diversity panel[J]. Phytopathology，2016，106（10）： 1152.

[89] Ye Y，Cai M，Ju Y，et al. Identification and validation of SNP markers linked to dwarf traits using SLAF-Seq technology in Lagerstroemia[J]. PLoS ONE，2016，11（7）： e0158970.

[90] Wu K，Liu H，Yang M，et al. High-density genetic map construction and QTLs analysis of grain yield-related traits in sesame （Sesamum indicum L.） based on RAD-Seq techonology[J]. BMC Plant Biol，2014，14（1）： 274.

[91] Velmurugan J，Mollison E，Barth S，et al. An ultra-high density genetic linkage map of perennial ryegrass （Lolium perenne） using genotyping by sequencing （GBS） based on a reference shotgun genome assembly[J]. Ann Bot，2016，118（1）： 71.

[92] Ma J Q，Huang L，Ma C L，et al. Large-scale SNP discovery and genotyping for constructing a high-density genetic map of tea plant using specific-locus amplified fragment sequencing （SLAF-seq） [J]. PLoS ONE，2015，10（6）： e0128798.

[93] Lin M，Cai S，Wang S，et al. Genotyping-by-sequencing （GBS） identified SNP tightly linked to QTL for pre-harvest sprouting resistance[J]. Theor Appl Genet，2015，128（7）： 1385.

[94] Li B，Tian L，Zhang J，et al. Construction of a high-density genetic map based on large-scale markers developed by specific length amplified fragment sequencing （SLAF-seq） and its application to QTL analysis for isoflavone content in Glycine max[J]. BMC Genomics，2014，15（1）： 1086.

[95] Zhao X，Huang L，Zhang X，et al. Construction of high-density genetic linkage map and identification of flowering-time QTLs in orchardgrass using SSRs and SLAF-seq[J]. Sci Rep，2016，6： 29345.

[96] Peng Y，Hu Y，Mao B，et al. Genetic analysis for rice grain quality traits in the YVB stable variant line using RAD-seq[J]. Mol Genet Genomics，2016，291（1）： 297.

[97] Xiong H，Shi A，Mou B，et al. Genetic diversity and population structure of cowpea （Vigna unguiculata L. Walp） [J]. PLoS ONE，2016，11（8）： e0160941.

[98] 王堯龍，黃璐琦，袁媛，等.藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2015，40（11）：2055.

[99] Luo H，Sun C，Sun Y，et al. Analysis of the transcriptome of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponin-biosynthetic genes and genetic markers[J]. BMC Genomics，2011，12（Suppl 5）： S5.

[100] Huang L L，Yang X，Sun P，et al. The first Illumina-based de novo transcriptome sequencing and analysis of safflower flower[J]. PLoS ONE，2012，7（6）： e38653.

[101] Yang L，Ding G，Lin H，et al. Transcriptome analysis of medicinal plant Salvia miltiorrhize and identification of genes related to tanshinone biosynthesis[J]. PLoS ONE，2013，8（11）： e80464.

[102] Van Moerkercke A，F(xiàn)abris M，Pollier J，et al. CathaCyc，a metabolic pathway database built from Catharanthus roseus RNA-Seq data[J]. Plant Cell Physiol，2013，54（5）： 673.

[103] Itkin M，Davidovich-Rikanati R，Cohen S，et al. The biosynthetic pathway of the nonsugar，high-intensity sweetener mogroside Ⅴ from Siraitia grosvenorii[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（47）： E7619.

[104] Peleman J D，van der Voort J R. Breeding by design[J]. Trends Plant Sci，2003，8（7）： 330.

[105] 王建康，李慧慧，張學(xué)才，等.中國作物分子設(shè)計(jì)育種[J].作物學(xué)報，2011，37（2）：191.

[106] 孫立洋，賈香楠，陳曉陽，等.分子設(shè)計(jì)育種研究進(jìn)展及其在林木育種中應(yīng)用[J].世界林業(yè)研究，2010，23（4）：26.

[107] Dai Z，Lu Q，Luan X et al. Development of a platform for breeding by design of CMS restorer lines based on an SSSL library in rice （Oryza sativa L.） [J]. Breed Sci，2016，66（5）： 768.

[108] Faux A M，Gorjanc G，Gaynor R C，et al. AlphaSim： software for breeding program simulation[J]. Plant Genome，2016，9（3）： 1.

[109] Ma J，Wingen L U，Orford S，et al. Using the UK reference population Avalon × Cadenza as a platform to compare breeding strategies in elite western european bread wheat[J]. Mol Breed，2015，35（2）： 70.

[110] Ithin M，Heinig U，Tzfadia O，et al. Biosynthesis of antinutritional alkaloids in solanaceous crops is mediated by clustered genes[J]. Science，2013，341（6142）： 175.

[111] Frusciante S，Diretto G，Bruno M，et al. Novel carotenoid cleavage dioxygenase catalyzes the first dedicated step in saffron crocin biosynthesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（33）： 12246.

[112] Müller T M，Bttcher C，Morbitzer R，et al. Transcription activator-like effector nuclease-mediated generation and metabolic analysis of camalexin-deficient cyp71a12 and cyp71a13 double knockout lines[J]. Plant Physiol，2015，168（3）： 849.

[113] Jiang W Z，Henry I M，Lynagh P G，et al. Significant enhancement of fatty acid composition in seeds of the allohexaploid，Camelina sativa，using CRISPR/Cas9 gene editing[J]. Plant Biotechnol J，2016，doi： 10.1111/pbi.12663.

[114] Alagoz Y，Gurkok T，Zhang B，et al. Manipulating the biosynthesis of bioactive compound alkaloids for next-generation metabolic engineering in opium poppy using CRISPR-Cas 9 genome editing technology[J]. Sci Rep，2016，6： 30910.

[115] Shi J，Gao H，Wang H，et al. ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions[J]. Plant Biotechnol，2017，15（2）： 207.

[116] Wang F，Wang C，Liu P，et al. Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene OsERF922[J]. PLoS ONE，2016，11（4）： e0154027.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]