光聲光譜技術(shù)鑒別肺炎克雷伯菌的實(shí)驗(yàn)研究

陳文麗，張 曄，宋瑞珍，董友玲，張亞娟，高紅梅

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光聲光譜技術(shù)鑒別肺炎克雷伯菌的實(shí)驗(yàn)研究

陳文麗，張 曄，宋瑞珍，董友玲，張亞娟，高紅梅

目的 探索應(yīng)用光聲光譜技術(shù)(photoacoustic spectroscopy，PAS)檢測(cè)細(xì)菌氣態(tài)揮發(fā)物(volatile compounds, VCs)，作為一種無(wú)創(chuàng)、快速鑒定肺炎克雷伯菌的新方法。方法 利用PAS分別對(duì)肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌，以及空白對(duì)照組35 ℃培養(yǎng)24 h后產(chǎn)生的VCs進(jìn)行檢測(cè)，獲得各細(xì)菌VCs和空白組的光聲光譜圖，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較，觀(guān)察肺炎克雷伯菌與空白組、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌之間VCs光聲光譜圖的差異。結(jié)果 同種細(xì)菌之間及空白組之間光聲光譜圖基本重合，表明光聲光譜分析儀性能穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好；肺炎克雷伯菌VCs與空白組的光聲光譜圖存在明顯差異，同時(shí)肺炎克雷伯菌VCs在1142和1160波數(shù)附近出現(xiàn)了波峰，而其他三組檢測(cè)細(xì)菌(鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌)均未出現(xiàn)。結(jié)論 應(yīng)用PAS通過(guò)對(duì)肺炎克雷伯菌VCs進(jìn)行檢測(cè)分析，可以將肺炎克雷伯菌與鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌及銅綠假單胞菌進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的特征峰位于1142和1160波數(shù)段附近。

揮發(fā)性代謝產(chǎn)物；光聲光譜；肺炎克雷伯菌；鑒定

肺炎克雷伯是目前國(guó)內(nèi)院內(nèi)感染最常見(jiàn)的條件致病菌之一。近年來(lái)，由于各種有創(chuàng)技術(shù)的大量開(kāi)展、抗菌藥物的不當(dāng)使用及激素和免疫抑制藥的廣泛應(yīng)用，肺炎克雷伯感染的發(fā)病率、耐藥率及病死率逐年上升，危害日漸嚴(yán)重[1-5]。肺炎克雷伯感染的早期病原學(xué)診斷對(duì)臨床抗生素的合理選擇具有重要價(jià)值。細(xì)菌鑒別的方法主要有生化法、培養(yǎng)法、色譜及質(zhì)譜法等，臨床以培養(yǎng)法最為常用[6-10]。這些方法各有利弊，如生化法操作方便、簡(jiǎn)單，但準(zhǔn)確性差；培養(yǎng)法最為可靠，但培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)[11]。目前，臨床中尚缺乏肺炎克雷伯菌快速、準(zhǔn)確的鑒別技術(shù)，從而嚴(yán)重制約了肺炎克雷伯菌感染性疾病的臨床診斷和治療。

本研究通過(guò)應(yīng)用光聲光譜分析儀對(duì)肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等4種革蘭陰性菌的氣態(tài)揮發(fā)物的檢測(cè)，獲取4種細(xì)菌氣態(tài)揮發(fā)物的光聲光譜圖，并分別將肺炎克雷伯菌與其他3種菌的VCs光聲光譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，獲得肺炎克雷伯菌的特征峰，旨在通過(guò)特征峰來(lái)對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行識(shí)別。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)儀器 光聲光譜分析儀(型號(hào)：PASTA-10001)，由中國(guó)航天科技集團(tuán)某研究所協(xié)助研制，主要參數(shù)：氣體采樣容積為30 ml；檢測(cè)時(shí)間30 min；檢測(cè)精度PPb級(jí)；在0～40 ℃的工作條件下，其測(cè)量結(jié)果不會(huì)因環(huán)境溫度和氣壓的變化而產(chǎn)生漂移。光聲光譜分析儀的基本檢測(cè)原理來(lái)自于氣體的比爾朗伯吸收定律，即光聲池中的待測(cè)氣體吸收光能量后產(chǎn)生脈沖壓力波，引起周?chē)晧旱淖兓?，并被光學(xué)微音器檢測(cè)到，其聲壓信號(hào)的幅度與待測(cè)氣體的濃度成正比，可利用比爾朗伯定律計(jì)算出該待測(cè)氣體的濃度值[6-10](圖1)。

圖1 光聲光譜技術(shù)檢測(cè)原理

1.2 培養(yǎng)儀器 雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶(圖2)為自行設(shè)計(jì)制作，其特征：(1)密閉，相對(duì)不受干擾；(2)雙通道，單向氣流，便于取樣。恒溫恒濕培養(yǎng)箱(型號(hào)TH70-HWS-350,北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司), 控溫范圍:5～50 ℃，溫度波動(dòng)度：±0.5 ℃；(3)血溶培養(yǎng)皿(型號(hào)103，上海微蒙生物科技有限公司)，內(nèi)徑103 mm,外徑108 mm。

1.3 菌種 肺炎克雷伯菌ATCC46117標(biāo)準(zhǔn)菌株、大腸埃希菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株、銅綠假單胞菌ATCC27853標(biāo)準(zhǔn)菌株、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606標(biāo)準(zhǔn)菌株，均由武警總醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室提供。

圖2 玻璃氣密樣品取樣瓶

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 氣體收集 (1)細(xì)菌組：分別挑取單菌落肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌接種在血溶培養(yǎng)皿上，每種細(xì)菌各接種2個(gè)培養(yǎng)皿并相應(yīng)地標(biāo)記為肺克組1和肺克組2、銅綠組1和銅綠組2、大腸組1和大腸組2、鮑曼組1和鮑曼組2； (2)空白組：2個(gè)空白血溶培養(yǎng)皿，并相應(yīng)地標(biāo)記為空白組1和空白組2；(3)細(xì)菌組和空白組均分別置于玻璃氣密樣品取樣培養(yǎng)24 h后對(duì)瓶中的頂空氣體進(jìn)行取樣檢測(cè)，并用止血鉗夾閉密閉取樣瓶?jī)蓚?cè)的橡皮管，放于35 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4.2 氣體檢測(cè) (1)將培養(yǎng)好的取樣瓶自培養(yǎng)箱中取出，將其上端橡膠管直接接入光聲光譜分析儀的進(jìn)氣口；(2)打開(kāi)連接進(jìn)氣口的橡膠管上的止血鉗，對(duì)取樣瓶中的氣體真空抽氣并進(jìn)行檢測(cè)，獲得初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(檢測(cè)波數(shù)范圍為1000～1250 1/cm)；重復(fù)上述方法檢測(cè)其他取樣瓶中的氣體；(3)對(duì)各組初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Originpro 8.5繪圖軟件繪出初始光聲光譜圖(X值表示波數(shù) 1/cm，Y值表示幅值au)。

1.4.3 光聲光譜圖的分析比較 (1)同一細(xì)菌組之間、同一空白組之間的光聲光譜圖進(jìn)行比較，判斷儀器的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性；(2)肺克組分別和空白組、鮑曼組、大腸組以及銅綠組的光聲光譜圖進(jìn)行比較，獲取肺炎克雷伯菌的特征峰，并通過(guò)特征峰來(lái)對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行識(shí)別。

2 結(jié) 果

2.1 肺克組與空白組光聲光譜比較 圖3顯示，肺克組和空白組的光聲光譜比較結(jié)果(部分放大圖)，肺克組1和肺克組2、空白組1和肺克組2的光聲光譜圖形基本吻合，表明實(shí)驗(yàn)中使用的光聲光譜分析儀穩(wěn)定性較好，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好；在1142、1160波數(shù)段，肺克組出現(xiàn)波峰，而對(duì)照組為較平滑的曲線(xiàn)，考慮上述波數(shù)段為肺炎克雷伯桿菌特征性代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的波數(shù)位置。

圖3 肺克組和空白組35 ℃下培養(yǎng)24 h后光聲光譜結(jié)果(部分放大)

2.2 肺克組與鮑曼組光聲光譜比較 圖4顯示，肺克組和鮑曼組的光聲光譜比較結(jié)果(部分放大圖)，可以看出，各細(xì)菌組1和組2的圖譜基本重合，提示實(shí)驗(yàn)采用的光聲光譜分析儀穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。肺克組(包括組1和組2)在1142和1160兩個(gè)波數(shù)段均出現(xiàn)了波峰，而鮑曼組(包括組1和組2)均為較平滑的曲線(xiàn)，這與圖3中顯示的結(jié)果相似。

圖4 肺克組和鮑曼組35 ℃下培養(yǎng)24 h后光聲光譜結(jié)果(部分放大)

2.3 肺克組與大腸組光聲光譜比較 圖5顯示，肺克組和大腸組的光聲光譜比較結(jié)果(部分放大圖)，可以看出，各細(xì)菌組1和組2的圖譜基本重合，提示實(shí)驗(yàn)采用的光聲光譜分析儀穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。肺克組(包括組1和組2)在1142和1160兩個(gè)波數(shù)段均出現(xiàn)了波峰，而大腸組(包括組1和組2)均為較平滑的曲線(xiàn)，這與圖3、4中顯示的結(jié)果相似。

圖5 肺克組和大腸組35 ℃下培養(yǎng)24 h后光聲光譜結(jié)果(部分放大)

2.4 肺克組與銅綠組光聲光譜比較 圖6顯示，肺克組和銅綠組的光聲光譜比較結(jié)果(部分放大圖)，可以看出，各細(xì)菌組1和組2的圖譜基本重合，提示實(shí)驗(yàn)采用的光聲光譜分析儀穩(wěn)定性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。肺克組(包括組1和組2)在1142和1160兩個(gè)波數(shù)段均出現(xiàn)了波峰，而銅綠組(包括組1和組2)均為較平滑的曲線(xiàn)，這與圖3、4、5中顯示的結(jié)果相似。

圖6 肺克組和銅綠組35 ℃下培養(yǎng)24 h后光聲光譜結(jié)果(部分放大)

3 討 論

傳統(tǒng)培養(yǎng)皿為非密閉的裝置，在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)菌代謝產(chǎn)生的微量氣體易彌散于周?chē)h(huán)境中，而這些極低濃度的氣體擴(kuò)散后會(huì)明顯影響檢測(cè)結(jié)果?；谏鲜隹紤]，我們自行設(shè)計(jì)了氣體采集密閉取樣瓶(簡(jiǎn)稱(chēng)取樣瓶)，其主要特征為：(1)玻璃材質(zhì)，無(wú)色透明，便于觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；(2)完全密閉，不受外界空氣的干擾，并能夠濃集細(xì)菌培養(yǎng)24 h期間所產(chǎn)生的全部微量氣體，有利于檢出；(3)雙通道，單向氣流，便于取樣。

在微量氣體檢測(cè)技術(shù)上，筆者選擇的是光聲光譜分析儀，該分析儀將先進(jìn)的光聲光譜技術(shù)與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)相結(jié)合，是近年來(lái)興起的一種能夠?qū)ξ⒘繗怏w進(jìn)行快速、可靠地檢測(cè)的新技術(shù)。其特征：(1)紅外激光光源，波長(zhǎng)可調(diào)節(jié)，測(cè)量范圍廣，選擇性高；(2)運(yùn)用先進(jìn)的硅微電子機(jī)械系統(tǒng) (micro electrom echanical system，MEMS)懸臂梁光學(xué)微音器，靈敏度及精確度進(jìn)一步提高；(3)體積小，密閉金屬外殼，受外界干擾?。?4)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)化，程序可控，操作簡(jiǎn)單；(5)與質(zhì)譜、色譜及傳感器法相比，檢測(cè)周期短，僅為35 min左右，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)潔；(6)樣品前處理便捷，樣品用量少，檢測(cè)靈敏度及穩(wěn)定性較高。

考慮到細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中易受外界環(huán)境因素的影響，如溫度、濕度、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間等，有可能導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生VCs的不同，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在細(xì)菌培養(yǎng)及檢測(cè)過(guò)程中，各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均盡量控制在相同條件下進(jìn)行，減少上述混雜因素的干擾，并選擇了對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)較適宜的溫度(35 ℃)，培養(yǎng)時(shí)間也選擇在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝較活躍的時(shí)期——對(duì)數(shù)期(24 h)，以提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性及精確性。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者檢測(cè)了4種革蘭陰性菌的VCs和空白組的VCs，獲得了不同細(xì)菌和空白組的VCs光聲光譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同種細(xì)菌之間、空白組之間的圖形基本吻合，表明實(shí)驗(yàn)中使用的光聲光譜分析儀穩(wěn)定性好，同種細(xì)菌產(chǎn)生的VCs較穩(wěn)定，且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

肺克組與鮑曼組、大腸組、銅綠組、空白組的比較發(fā)現(xiàn)，肺克組在1142和1160波數(shù)附近出現(xiàn)波峰，而鮑曼組、大腸組、銅綠組以及空白組均未出現(xiàn)。因此可根據(jù)上述特征波峰將肺克組與鮑曼組、大腸組、銅綠組、空白組進(jìn)行區(qū)分。我們認(rèn)為，1142和1160可能為肺克組VCs所處的特征波數(shù)位置。在既往相關(guān)研究中，尚未見(jiàn)到有關(guān)肺炎克雷伯菌VCs特征波峰的報(bào)導(dǎo)。2012年李絢梅等[11]曾利用固相萃取及氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(SPME-GCMS)研究發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯桿菌的特征性揮發(fā)物為丁基羥基甲苯。由于本研究尚未進(jìn)一步分析1142和1160波數(shù)所對(duì)應(yīng)的氣態(tài)成份。因此，本研究中發(fā)現(xiàn)的1142和1160特征峰所代表的氣態(tài)物質(zhì)究竟與李絢梅等發(fā)現(xiàn)的丁基羥基甲苯是否存在怎樣的相關(guān)性，目前尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究來(lái)揭示。

目前，檢測(cè)VCs的方法主要有氣相色譜法、質(zhì)譜法、傳感器或電子鼻法和PAS等[1-9]。其中，氣相色譜法與質(zhì)譜法的檢測(cè)模式均是需先明確目標(biāo)氣體，再檢測(cè)目標(biāo)氣體的存在與否，即“逆推法”；傳感器或電子鼻法則是先通過(guò)氣味傳感器進(jìn)行識(shí)別，對(duì)整體混合物的生物揮發(fā)性特征作出響應(yīng)，并以某種相似屬性重新組合排列，進(jìn)而進(jìn)行區(qū)別，即“順比較法”。而光聲光譜法既可以通過(guò)“順比較法”，對(duì)比不同細(xì)菌VCs的光聲光譜圖間的差異來(lái)區(qū)分目標(biāo)菌，又可以通過(guò)“逆推法”進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)氣體的存在。因此，其靈敏度和選擇性也大大提升，這也是該方法的優(yōu)點(diǎn)所在。

總之，通過(guò)光聲光譜技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等4種細(xì)菌VCs，并根據(jù)其峰位和峰型的不同，可以將肺炎克雷伯菌與其它3種革蘭陰性菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌)進(jìn)行區(qū)分，并發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的特征峰位于1142、1160波數(shù)附近。光聲光譜技術(shù)檢測(cè)VCs為細(xì)菌的鑒定提供了一種簡(jiǎn)單、快速的方法，有望成為臨床早期病原學(xué)檢測(cè)的新技術(shù)。

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(2017-03-11收稿 2017-04-12修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Application of photoacoustic spectroscopy to initial identification of Klebsiella pneumoniae

CHEN Wenli, ZHANG Ye, SONG Ruizhen, DONG Youling, ZHANG Yajuan, and GAO Hongmei.
Department of Respiration, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039，China

Objective To develop a noninvasive, quick and reliable method for the identification of Klebsiella pneumonia by detecting its volatile compounds (VCs) using photoacoustic spectroscopy (PAS).Methods Photoacoustic spectroscopy trace analyzer (PASTA) was used to conduct the analysis of bacterial volatile compounds (VCs), such as the volatile metabolites of Klebsiella pneumonia, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The bacteria were cultured at 35 ℃ and measurement of VCs was performed after 24 hours. After that, the difference in the PAS of VCs between Klebsiella pneumonia, blank, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa was observed.Results The PAS of VCs was basically similar between the same type of bacteria or between the blank groups, indicating that the adopted PASTA was of good performance and the experiment could be easily repeated. Obvious difference in the PAS of VCs was observed between Klebsiella pneumonia and the blank groups, suggesting that new VCs were generated by Klebsiella pneumonia. Besides, the PAS of VCs showed obvious peaks of Klebsiella pneumonia at wave 1142 and 1160 while the PAS of VCs of the other three types of bacteria was smooth at these two wave numbers.Conclusions Identification of Klebsiella pneumonia could be conducted by PAS. The characteristic peak may be located at wave 1142 and 1160.

volatile compounds；photoacoustic spectroscopy；klebsiella pneumonia； identification

陳文麗，本科學(xué)歷，主治醫(yī)師。

100039 北京，武警總醫(yī)院呼吸科

高紅梅，E-mail:gaohm777@sina.com

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