醬香型大曲細(xì)菌的多樣性

王曉丹，雷安亮，班世棟，邱樹毅*

1(貴州大學(xué)，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550025)2(貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義，563003)3(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

醬香型大曲細(xì)菌的多樣性

王曉丹1，3，雷安亮2，班世棟1，邱樹毅1，3*

1(貴州大學(xué)，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550025)2(貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義，563003)3(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

以醬香型大曲為研究對(duì)象，研究醬香型大曲細(xì)菌種群多樣性及功能基因預(yù)測(cè)。分別采用可培養(yǎng)稀釋平板法以及高通量測(cè)序方法分析大曲細(xì)菌群落組成，并結(jié)合功能基因篩選及高通量測(cè)序分析等宏基因組學(xué)研究手段，預(yù)測(cè)其相關(guān)基因功能。大曲細(xì)菌總數(shù)范圍在106～108CFU/g，可培養(yǎng)法分離到的51株Bacillussp.，1株Acinetobactersp.。確定醬香型大曲細(xì)菌的主體類群組成為以厚壁菌門(87.3%～91.8%)為主要類群，其次是放線菌門(3.3%～9.1%)，并發(fā)現(xiàn)了未曾報(bào)道過的藍(lán)細(xì)菌門Cyanobacteria(0.1%～1.5%)。確定了以Thermoactinomycessp.和Bacillussp.為主的醬香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，其相對(duì)含量占細(xì)菌總量的60%以上。通過第二代高通量測(cè)序方法還對(duì)大曲樣品中細(xì)菌的代謝功能基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

醬香型大曲；高通量測(cè)序；細(xì)菌多樣性；功能基因預(yù)測(cè)

白酒大曲的制作在中國已有2000多年的歷史，制曲過程中，經(jīng)40 d發(fā)酵，逐漸形成了以細(xì)菌、霉菌和酵母菌為主的群落結(jié)構(gòu)，其中，細(xì)菌尤其是耐高溫細(xì)菌的數(shù)量最多。目前對(duì)醬香大曲中細(xì)菌種類和功能的研究主要采用2種方式進(jìn)行，一是用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法從大曲中分離細(xì)菌，通過形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)鑒定細(xì)菌，一些研究表明，Bacillussp.是大曲中的優(yōu)勢(shì)菌，有很強(qiáng)的耐熱能力，在發(fā)酵體系中能夠生產(chǎn)大量高溫型淀粉酶，促進(jìn)大曲原料的降解[1]，同時(shí)能夠代謝產(chǎn)生多種游離氨基酸，經(jīng)過發(fā)酵體系美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生醬香風(fēng)味[2-3]；二是用新一代免培養(yǎng)技術(shù)研究大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，采用PCR-DGGE免培養(yǎng)技術(shù)研究大曲貯藏時(shí)的群落結(jié)構(gòu)，得出了與傳統(tǒng)可培養(yǎng)法類似的結(jié)果，并檢測(cè)到了可培養(yǎng)法中沒有檢出的菌種[4-5]，更全面地分析了大曲中的細(xì)菌的群落特征。醬香型大曲研究一般只研究醬香型大曲制曲時(shí)微生物的動(dòng)態(tài)變化，但是成品曲使用前還需要6個(gè)月的儲(chǔ)藏，以降低大曲的酸度和邪雜味，同時(shí)此過程又網(wǎng)羅了環(huán)境中微生物，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)又發(fā)生變化[6]，因此，結(jié)合大曲的制作工藝和醬香型白酒的制酒工藝，以白酒生產(chǎn)時(shí)所用的曲粉作為研究對(duì)象，更能準(zhǔn)確解析醬香型大曲中細(xì)菌的類群結(jié)構(gòu)及功能，從而為今后更加深入地研究細(xì)菌在醬香白酒風(fēng)味形成中的作用提供有意義的指導(dǎo)。

采用傳統(tǒng)茅臺(tái)高溫制曲工藝，選取貴州遵義地區(qū)的3個(gè)企業(yè)的生產(chǎn)用曲，通過可培養(yǎng)法和第二代高通量測(cè)序方法分析大曲中細(xì)菌群落組成，并基于宏基因組學(xué)技術(shù)，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，預(yù)測(cè)醬香型大曲細(xì)菌的功能基因，將有助于揭示大曲特征性細(xì)菌群落與優(yōu)質(zhì)醬香白酒品質(zhì)之間的重要關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

醬香型大曲制作以優(yōu)質(zhì)小麥為原料，加水潤糧3h左右，磨碎，加入5%～10%的曲母，37%～40%的水，攪拌均勻；加入曲模，腳踩成型，放置2 h后入曲房發(fā)酵40 d，在前14 d，每7 d翻曲1次，發(fā)酵結(jié)束后在曲倉儲(chǔ)藏3～6個(gè)月，粉碎后與高粱混合釀酒。研究共采集3種醬香型大曲MT01、ZJ01、ZX01。

1.2 細(xì)菌的分離鑒定

1.2.1 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

取樣品10 g，90 mL已滅菌的生理鹽水，于35 ℃，120 r/min搖床振蕩30 min。稀釋到合適的濃度梯度，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取菌懸液0.2 mL涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上， 35 ℃培養(yǎng)1 d，觀察菌落形態(tài)。挑選出不同的菌落形態(tài)進(jìn)行平板劃線，分離出單菌落。接種單菌落觀察菌落形態(tài)，并用革蘭氏染色法在光學(xué)顯微鏡(江南永新光學(xué)(南京)有限公司)下觀察菌落形態(tài)特征。

1.2.2 生理生化鑒定

對(duì)細(xì)菌分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、厭氧生長、吲哚試驗(yàn)等生理生化試驗(yàn)(《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》及《一般細(xì)菌常用鑒定方法》)。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

取LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)1 d菌液1 mL于1.5 mL離心管中，8 000 r/min離心3 min，棄上清；按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，擴(kuò)增引物為27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′)，和1492r (5′-GGT-TACCTTGTTACGAC TT-3′)。在25.0 μL PCR反應(yīng)體系下，2×Taq PCR Mastermix(天根生化科技(北京)有限公司)12.5 μL，0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃保持10 min。取2 μL電泳，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確定目的條帶后，利用凝膠回收試劑盒切膠回收DNA(寶生物工程(大連)有限公司)，并電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司測(cè)序完成，將測(cè)序得到的16S rDNA序列在NCBI上Blast比對(duì)鑒定。

1.3 高通量測(cè)序方法

取大曲0.25 g，按照Fast DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)試劑盒提取DNA。擴(kuò)增細(xì)菌16S V3～V5區(qū)，選擇F (5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3) 和R (5-CCGTCAATTCMTTT

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序建庫過程中的PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生嵌合體序列(chimera sequence)，測(cè)序過程中會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)突變等測(cè)序錯(cuò)誤，為了保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對(duì)有效序列進(jìn)行進(jìn)一步過濾和去除嵌合體處理，得到最終用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。運(yùn)用mothur軟件(version 1.31.2，http://www.mothur.org/)中uchime的方法去除嵌合體序列，標(biāo)準(zhǔn)如下：去除5’端引物錯(cuò)配堿基數(shù)> 1的序列；去除含有N(模糊堿基)的序列；去除含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列；去除長度≤150 bp的序列。對(duì)這些優(yōu)質(zhì)序列依據(jù)序列相似性，用軟件Qiime調(diào)用uclust對(duì)所有樣品的優(yōu)質(zhì)序列按0.97的相似度進(jìn)行聚類，將序列歸為1個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，去除無法分類的OTU，選取每一類中最長的序列作為OTU的代表序列。采用Blast的方法在Green gene經(jīng)每個(gè)分類水平注釋發(fā)現(xiàn)，在屬水平，注釋的序列最多，所以數(shù)據(jù)在屬水平分析。根據(jù)NCBI信息數(shù)據(jù)庫，將測(cè)序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹中，從整個(gè)分類系統(tǒng)上全面了解樣品中所有微生物的進(jìn)化關(guān)系和豐度差異。在本研究中，取豐度前100位的OTU表信息，應(yīng)用軟件MEGAN 4[7-8]進(jìn)行功能基因的預(yù)測(cè)和相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 醬香型大曲細(xì)菌群落組成

2.1.1 可培養(yǎng)方法解析醬香型大曲細(xì)菌群落組成

采用可培養(yǎng)方法，測(cè)定樣品中細(xì)菌總數(shù)大小順序?yàn)椋篫J01(1.85×108cfu/g)>MT01(3.6×107cfu/g)>ZX01(3.8×106cfu/g)，細(xì)菌作為大曲三大微生物類群之一，在釀造過程中呈現(xiàn)出種類多、功能多的特點(diǎn)，是發(fā)酵生香的動(dòng)力來源[9]，細(xì)菌多樣性和豐富度高的大曲具有更高的發(fā)酵品質(zhì)，對(duì)出產(chǎn)白酒良好風(fēng)味特征的形成造成重要影響。

共分離鑒定出的5種細(xì)菌，4種為Bacillussp.，1種為Acinetobactersp.，在MT01、ZX01、以及ZJ01大曲中的含量分別為29.70%、7.00%、48.10%和0.20%、0.10%、0.20%。其中Bacilluslicheniformis和Bacillusamyloliquefaciens在大曲中含量都比其他細(xì)菌多，是典型的嗜熱芽孢桿菌，也是大曲中產(chǎn)醬香功能細(xì)菌，在發(fā)酵體系中能產(chǎn)生大量淀粉酶以及蛋白酶[10-12]。在貴州遵義地區(qū)醬香大曲制曲過程中發(fā)現(xiàn)以厚壁菌門為主的49個(gè)細(xì)菌屬，其中以Thermoactinomycessp.和Bacillussp.為優(yōu)勢(shì)菌種，初步推測(cè)為地域性微生物類群[13-14]；在福建省福矛窖酒高溫大曲中同樣分離到Bacillussp.[15]；在濃香型大曲[16-17]同樣也發(fā)現(xiàn)了數(shù)量占優(yōu)的Bacilluslicheniformis等產(chǎn)香芽孢桿菌。Acinetobacterbaumannii又被稱為鮑曼不動(dòng)桿菌，為醫(yī)院感染的重要的條件致病菌，具有天然和獲得性耐藥能力[18]，目前還沒有其在白酒領(lǐng)域的研究報(bào)道。

可培養(yǎng)法可以分離得到單菌株，從而探究菌種的功能并應(yīng)用于實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)，但在不確定大曲菌群結(jié)構(gòu)的情況下，采用常用的分離培養(yǎng)基，故難以全面地分析大曲中細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)[19]。本研究中可培養(yǎng)法的鑒定結(jié)果只能檢出得細(xì)菌兩個(gè)屬，分析結(jié)果不夠全面，可能與采用未優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行分離篩選有較大的關(guān)系。

表1 可培養(yǎng)細(xì)菌種類

注：表1中的數(shù)據(jù)代表菌株的數(shù)量，“-”表示沒有該菌株。

2.1.2 免培養(yǎng)的方法

采用454 FLX+平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品細(xì)菌種群進(jìn)行分析，得到在各分類水平上(門、綱、目、科、屬)的物種組成比例以及群落結(jié)構(gòu)情況。細(xì)菌類群分析平均92%以上的序列可以注釋在科水平。有70%的序列可以注釋到屬的水平，16類細(xì)菌沒能注釋到屬。許多細(xì)菌均不能注釋到種的水平，5類的細(xì)菌只能注釋到目，說明該方法仍有缺陷。確定醬香型大曲細(xì)菌的主體類群組成為以厚壁菌門為主要類群，其次是放線菌門，芽孢桿菌目占細(xì)菌總數(shù)的一半以上。芽孢桿菌科Bacillaceae和高溫放線菌科Thermoactinomycetaceae是醬香型大曲細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種類。最終確定Actinopolysporaceae, Bacillaceae, Brevibacteriaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Streptomycetaceae, Thermoactinomycetaceae, Moraxellaceae, Pseudonocardiaceae, 和Planococcaceae.是醬香型大曲的細(xì)菌的科水平下類群結(jié)構(gòu)。

根據(jù)OUT聚類結(jié)果，在屬的層次下進(jìn)行分析3個(gè)樣品中共有的14個(gè)細(xì)菌類群，這與醬香大曲的制曲生產(chǎn)工藝有著密不可分的聯(lián)系[13-14]，這些細(xì)菌屬是醬香大曲的主要類群構(gòu)成，其中的Thermoactinomycesp.、Bacillussp.[13]、Lactobacillussp.、Acetobactersp.[20]等菌屬經(jīng)證實(shí)對(duì)醬香型白酒風(fēng)味品質(zhì)的形成有重要貢獻(xiàn)。

如圖1所示，MT01中有4個(gè)屬相對(duì)含量大于1%，相對(duì)含量均勻，主要以Firmicutes門(厚壁菌門)為主，占大曲細(xì)菌總量的81.0%，是主要細(xì)菌種屬；ZX01中有6個(gè)屬相對(duì)含量大于1%，Thermoactinomycessp.超過總量的50%，其代謝功能對(duì)大曲品質(zhì)的影響很大；ZJ01中有4個(gè)屬相對(duì)含量大于1%，Bacillussp.的相對(duì)含量與MT01相近，Thermoactinomycessp.含量略高于MT01低于ZX01。

圖1 三種醬香型大曲MT01、ZX01、ZJ01細(xì)菌種群比例圖Fig1 Scale map of bacterial population in three kinds of Maotai-flavor Daqu: MT01, ZX01, ZJ01注：未注釋到屬的細(xì)菌分別在MT01,ZX01和ZJ01占細(xì)菌總數(shù)的15.70%, 16.6%、10.70%。未被檢測(cè)的序列在3個(gè)樣本的比例分別為0.00%, 0.10%和0.20%。

采用可培養(yǎng)方法分析大曲中細(xì)菌群體主要由Bacillussp.組成，免培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)Thermoactinomycessp.與Bacillussp.為主要優(yōu)勢(shì)菌群，在發(fā)酵溫度超過60 ℃的高溫制曲中，Thermoactinomycessp.數(shù)量高于Bacillussp.，這表明在醬香型大曲中同樣扮演了重要的角色。劉洋、姚粟等從山東扳倒井芝麻香型高溫大曲中分離得到1株Zm60菌株，經(jīng)鑒定屬于Thermoactinomycesvulgaris，確定其具有堿性磷酸鹽酶、酯酶、類脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性，在芝麻香型白酒風(fēng)味的形成中具有不可忽視的作用[21]。這也說明該菌屬在醬香大曲中是否具有類似功能就值得進(jìn)行深入研究。醬香型大曲中的細(xì)菌種類繁多，主體類群結(jié)構(gòu)相似。溫度為高溫大曲細(xì)菌群落形成的重要因素，通過40 d的固態(tài)發(fā)酵，從45 ℃升溫期到65 ℃高溫期再回落到45 ℃的降溫期，大曲細(xì)菌類群均呈現(xiàn)一定程度的增長，成熟期品溫接近環(huán)境溫度時(shí)，細(xì)菌總量趨于穩(wěn)定[22]，以嗜熱性Thermoactinomycessp.、Bacillussp.為主的細(xì)菌特征性種群結(jié)構(gòu)基本形成。

因此，通過本研究發(fā)現(xiàn)，在研究白酒釀造微生物的細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)時(shí)，可以先通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品的細(xì)菌組成有明確的了解，再根據(jù)這一結(jié)論設(shè)計(jì)不同的培養(yǎng)方法，獲得可培養(yǎng)的細(xì)菌，進(jìn)一步研究其在大曲中的功能。

此外，在免培養(yǎng)分析過程中也發(fā)現(xiàn)，使用16S細(xì)菌和古菌數(shù)據(jù)庫：RDP、Silva、Greengene進(jìn)行比對(duì)，40%的細(xì)菌均不能注釋到種的水平，有含量高達(dá)16%的16類細(xì)菌沒能注釋到屬，5類細(xì)菌只能注釋到目，說明該方法仍有缺陷。

2.2 大曲細(xì)菌功能多樣性預(yù)測(cè)

通過第二代高通量測(cè)序方法不僅能分析細(xì)菌的類群組成，還可以以序列分析為主，采用與已知功能基因進(jìn)行序列比對(duì)的方式來預(yù)測(cè)醬香大曲樣品中細(xì)菌群落的功能基因組成，并繪制功能基因柱狀圖反映菌種功能基因的種類以及其豐度信息。結(jié)果見圖2。

圖2 功能基因的柱狀圖功能基因的種類及其豐度信息Fig.2 Bar graph of functional genes. Information about species and abundance of functional genes

從功能基因的種類及其豐度信息來看，環(huán)境信息處理功能中膜運(yùn)輸是所有功能基因豐度最高的；新陳代謝最為豐富，其中氨基酸代謝與碳水化合物代謝均十分豐富；此外，對(duì)遺傳信息處理、有機(jī)物的合成、細(xì)胞過程及信號(hào)等方面的功能基因也進(jìn)行了預(yù)測(cè)。在這些功能基因中值得關(guān)注的是在大曲中的微生物都預(yù)測(cè)到了萜類代謝、聚酮類化合物、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等功能，而其中萜類代謝功能大曲中豐度很高，一些研究也表明，萜類尤其是萜烯類物質(zhì)同樣是藥香型白酒中一類重要的香氣成分，在發(fā)酵及陳釀過程中逐漸釋放出來[23]，聚酮化合物作為微生物代謝生產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)菌體細(xì)胞的穩(wěn)定有重要作用[24]，研究的結(jié)果無疑暗示著醬香大曲中細(xì)菌在這類物質(zhì)代謝合成上的重要貢獻(xiàn)。啤酒微生物功能分析獲取了乳桿菌的基因序列及1824個(gè)預(yù)測(cè)基因的功能信息[25]；在人和動(dòng)物胃腸道微生物類群多樣性及功能性探究中，Swanson 對(duì)狗糞便微生物的宏基因組進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)擬桿菌門Bacteroidetes和厚壁菌門Firmicutes是優(yōu)勢(shì)菌群，動(dòng)物胃腸道中還含有種類和數(shù)量豐富的生物質(zhì)降解酶類[26]；同樣在土壤研究領(lǐng)域，賀紀(jì)正等[27]采用第二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)一步探討不同類型土壤微生物群落的演化特點(diǎn)和驅(qū)動(dòng)因子。

根據(jù)上述的預(yù)測(cè)結(jié)果，可以進(jìn)一步對(duì)大曲細(xì)菌群落的功能性做出科學(xué)推測(cè)，在大曲中細(xì)菌群落的控制代謝以及信號(hào)分子的相互作用功能基因大量存在，這暗示著細(xì)菌群落在大曲中必然參與到各種物質(zhì)代謝的過程之中，是醬香大曲中的關(guān)鍵微生物類群，通過大曲細(xì)菌功能多樣性的預(yù)測(cè)，再次證實(shí)了醬香大曲中細(xì)菌群落在原料降解及風(fēng)味形成中的重要功能。

3 結(jié)論

分別采用可培養(yǎng)方法和免培養(yǎng)技術(shù)來分析醬香型白酒大曲中的細(xì)菌微生物種群，從物種分類水平上詳細(xì)描述了醬香型大曲細(xì)菌群落的特征性結(jié)構(gòu)，同時(shí)通過功能基因組成的預(yù)測(cè)，證實(shí)醬香型大曲中的細(xì)菌種群主要具有環(huán)境信息處理功能、控制代謝功能以及遺傳信息處理功能，加深了對(duì)大曲細(xì)菌群落的功能性特征的了解，從而為今后大曲細(xì)菌多樣性及功能性的深入研究提供了新的思路。

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Research on bacterial diversity of Maotai-flavor Daqu

WANG Xiao-dan1，3, LEI An-liang1,2, BAN Shi-dong1, QIU Shu-yi1*

1(Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University, Guiyang 550025,China)2(Guizhou Zhenjiu Co., Ltd.，Zunyi 563003, China)3(School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In this study, we investigated the bacterial diversity and functional genes prediction of the Maotai-flavorDaqusamples. The bacterial diversities in three kinds of Maotai-flavorDaqusamples were analyzed via the dilution-plate method and high-throughput sequencing method. The results showed that the total number of bacteria colonies was in the range of 106-108CFU/g, and a total of 51 strains ofBacillussp. and only 1 strain ofAcinetobactersp. were identified by the dilution-plate method. Meanwhile, Firmicutes (87.3%-91.8%) were demonstrated to be the dominant bacterial phylum in the three Maotai-flavorDaqusamples via the high-throughput sequencing method. Intriguingly, Cyanobacteria (0.1%-1.5%) were firstly identified in this study. Moreover,Thermoactinomycessp. andBacillussp., with the relatively abundances > 60%, were also demonstrated to be the dominant bacterial genera in the three Maotai-flavorDaqusamples. Furthermore, the metabolic functional genes prediction was also investigated via the high-throughput sequencing method.

Maotai-flavorDaqu; high-throughput sequencing; bacterial diversity; functional genes prediction

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705012

博士，副教授(邱樹毅教授為通訊作者，E-mail:syqiu@gzu.edu.cn)。

貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合支撐[2016]2340);貴州省工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合GZ字[2014]3012);貴州省重大專項(xiàng)項(xiàng)目(黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6012)

2016-11-03，改回日期：2017-01-04