基于計時庫侖技術的可再生型三磷酸腺苷適配體電化學傳感器的研究

盧瑩+田燕+王莉+楊耀+姚曉林

摘 要 構建了一種可再生型三磷酸腺苷（ATP）適配體計時庫侖電化學傳感器。將一條短鏈DNA通過AuS鍵自組裝固定在電極表面， ATP的核酸適配體與該短鏈DNA雜交而結合在電極表面。帶負電的DNA通過靜電吸引結合電解液中的六氨合釕（RuHex）陽離子。當傳感器和靶分子ATP孵育后，ATP與核酸適配體結合，使適配體鏈從電極表面解離，電極表面吸附的DNA量減少，結合RuHex的量隨之降低。通過計時庫侖技術檢測RuHex響應信號降低的量 ，可以對ATP進行定量測定。此傳感器的電化學響應信號與ATP濃度對數(shù)值呈線性關系，線性檢測范圍為0.001～100 μmol/L，檢出限（S/N=3）為0.5 nmol/L。此傳感器檢測靶分子ATP后，可以通過簡單的操作步驟再生，再生5次后的響應信號為初始信號的90%以上。采用此傳感器檢測大鼠腦透析液中ATP的含量為（19.2±3.7） nmol/L （n=3）。

關鍵詞 核酸適配體； 計時庫侖； 傳感器； 三磷酸腺苷； 再生

1 引 言

生物傳感技術在疾病預警與診斷、臨床治療等方面具有良好的應用價值[1～3]。許多生理和病理過程相關的生物活性分子在人體內含量低、易降解、難于被檢測，因此開發(fā)和篩選選擇性好、靈敏度高的識別元件一直是相關研究者關注的熱點[4～6]。核酸適配體作為一種新型生物傳感識別元件，被越來越多地應用于基礎和應用研究[7～10]。核酸適配體是通過系統(tǒng)配體進化技術篩選得到的特定序列的DNA或RNA寡核苷酸鏈，與靶標之間具有高選擇性和強親和力，某些靶標分子與核酸適配體之間的選擇性和親和力甚至強于其天然配體[11～13]。與天然配體相比，核酸適配體具有制備成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。

三磷酸腺苷（ATP）在能量代謝、信號轉導、神經(jīng)發(fā)育等生命過程中起關鍵作用[14，15]。文獻報道的檢測ATP的方法包括熒光法[16]、化學發(fā)光法[17]、生物發(fā)光法[18]和電化學方法等[19]。ATP在生物體液中的濃度為109～108 mol/L，建立高選擇性、高靈敏度的ATP檢測方法對于科研工作者是一個具有挑戰(zhàn)性的課題[20，21]。電化學方法具有靈敏度高、檢測限低的優(yōu)點，核酸適配體作為識別元件具有良好的選擇性，而利用核酸適配體電化學傳感器檢測ATP已成為當前的熱點研究課題之一[22～25]。

利用核酸適配體作為識別元件的電化學傳感器通常采用標記電化學活性基團的DNA鏈作為標記探針，將核酸適配體對于靶標的識別過程轉換為電化學響應信號[26～30]。與免標記的電化學傳感器相比，標記探針型的核酸適配體電化學傳感器的構建過程較為繁瑣，制備成本也相對較高。六氨合釕（RuHex）作為一種電活性的分子，其自身帶正電荷，如果將DNA鏈固定在電極表面，RuHex會通過靜電吸附的方式結合在帶負電荷的DNA骨架上[31]。通過檢測吸附于電極表面的RuHex的響應信號可以實現(xiàn)針對固定在電極表面的DNA鏈的定量測定?；谝陨显?，Shen等[32]將腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）的核酸適配體與其互補鏈雜交形成的雙鏈DNA固定在電極表面作為識別元件，構建了一種免標記型核酸適配體電化學傳感器。AMP與電極表面的適配體結合，從而與其互補鏈解離，電極表面固定的DNA的總量隨之減少，導致吸附在電極表面的RuHex的量減少，從而實現(xiàn)對AMP的定量測定，檢測范圍為1.0×107～1.0×103 mmol/L，檢出限低于0.1 μmol/L。Jiao等[33]報道了一種檢測凝血酶的核酸適配體計時庫侖電化學傳感器，采用納米金作為信號放大元件，檢測凝血酶的線性范圍為0.1～18.5 nmol/L，檢出限為30 pmol/L。Li等[34]構建了利用納米金放大檢測ATP的計時庫侖型傳感器，檢測線性范圍為1.0×109～1.0×105 mmol/L，檢出限為0.2 nmol/L。 Qiu[35]和Du[36]等構建的計時庫侖型核酸適配體傳感器可以再生，再生處理后傳感器至少可重復使用3次。

本研究將與ATP核酸適配體其中一段序列互補的短鏈DNA固定在電極表面，核酸適配體與短鏈DNA雜交結合，構建了一種計時庫侖型ATP核酸適配體電化學傳感器。在電解液中加入電化學活性分子RuHex，帶負電荷的DNA通過靜電作用吸附RuHex。當在體系中加入ATP時，ATP與核酸適配體結合形成特定的二級結構，從而與互補鏈解離，從電極表面脫落下來，電極表面的DNA的總量減少，吸附在電極表面的RuHex的總量也相應減少，計時庫侖響應信號降低。根據(jù)傳感器響應信號的降低實現(xiàn)對靶分子ATP的檢測。檢測后的電極表面與無標記的核酸適配體孵育，重新雜交，即可實現(xiàn)傳感器表面的再生。本研究構建的傳感器具有普適性，制備和再生方法簡單。利用此傳感器檢測了大鼠腦透析液中ATP的濃度，與文獻報道結果一致， 表明此傳感器可用于實際生物樣品中的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660B電化學工作站（上海辰華儀器公司）。電化學測定采用三電極體系：DNA修飾的金電極（Φ=2 mm，）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，Pt絲為對電極。

DNA序列（見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。三磷酸腺苷（ATP）、三磷酸胞苷（CTP）、三磷酸鳥苷（GTP）和三磷酸尿苷（UTP），購于上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris，美國Amresco公司）；六氨合釕（RuHex，美國Sigma公司）；3巰基丙酸（MPA，Acros公司（Geel， Belgium））；大鼠腦透析液（北京夢和崇勝科技有限責任公司），腦透析液取自大鼠右腹側海馬腦區(qū)，透析探針膜長度為4 mm，人工腦脊液灌流流速為3 μL/min，灌流平衡90 min后，在低溫的環(huán)境下開始收集透析液，收集到的腦透析液未經(jīng)進一步處理。本研究所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水（MilliporeD 24UV純水儀，法國Millipore公司）。

2.2 傳感器的制備和再生

金電極依次用粒徑為0.30和0.05 μm的Al2O3粉懸濁液拋光，然后依次用丙酮和超純水各超聲清洗5 min。清洗過的電極在0.5 mol/L H2SO4溶液中以0.5 V/s的掃速在0.2～1.6 V的電位范圍內掃描，直至得到典型的清潔金電極特征循環(huán)伏安圖。將50 μL CDNA溶液滴涂在電極表面，使巰基標記的CDNA通過自組裝的方式固定在金電極表面。隨后取50 μL 10 μmol/L ADNA滴涂在此電極表面，孵育2 h，使ADNA與CDNA雜交形成雙鏈結構。將電極浸入0.1 mmol/L MPA溶液中10 min，再依次使用乙醇和超純水充分清洗電極以除去電極表面殘余的MPA及吸附不牢固的分子。

2.3 電化學測定

電化學檢測在含有50 μmol/L RuHex的20 mmol/L TrisHCl的緩沖液中進行，計時庫侖電化學檢測脈沖寬度為600 mV，脈沖周期為250 ms；差示脈沖伏安檢測的電位范圍0.5～0 V，脈沖寬度為0.05 s。

3 結果與討論

3.1 傳感器的設計方案

本研究構建的ATP適配體計時庫侖電化學傳感器的傳感機理見圖1。首先將5′巰基標記的CDNA通過AuS鍵自組裝的方式固定在電極表面，ATP適配體通過雜交的方式與CDNA結合， 從而固定在電極表面。由于DNA磷酸骨架帶負電，當加入RuHex后，電極表面固定的DNA通過靜電吸引結合RuHex，此時可以檢測到RuHex的電化學響應信號。檢測ATP時，ATP與適配體結合形成特定的二級結構，導致適配體DNA鏈與CDNA解離，從電極表面脫落下來。由于電極表面固定的DNA量減少，通過靜電吸引作用吸附在電極表面的RuHex的量也隨之減少，RuHex的響應信號也隨之降低。通過檢測RuHex信號的降低，可以實現(xiàn)對ATP分子的定量測定。檢測結束后，將ATP適配體與電極表面固定的CDNA再次雜交， 即可實現(xiàn)傳感器的再生。

3.2 核酸適配體傳感器對于靶標的響應

RuHex和DNA寡核苷酸鏈可以在靜電吸引的作用下形成RuHexDNA復合結構，在含有RuHex的電解液里，固定了DNA的金電極的差示脈沖伏安（DPV）掃描圖有兩個氧化峰[32]，在0.15 V處的氧化峰歸屬于RuHex擴散控制峰，位于0.32 V 處的氧化峰是吸附在電極表面的RuHex的特征峰。DPV曲線如圖2所示，與CDNA固定在金電極上掃描得到的DPV曲線相比， CDNA與ADNA雜交后的0.32 V處的氧化峰電流明顯增大。采用此電極檢測100 μmol/L ATP，掃描得到DPV曲線， 在0.32 V處的氧化峰電流明顯降低，表明電極表面固定的DNA的量減少，進而導致吸附在電極表面的RuHex的量也相應減少。

3.3 電極制備條件的優(yōu)化

考察了CDNA的濃度對于電極表面固定的CDNA的量以及雜交ADNA后檢測1 mmol/L ATP的DPV響應信號的影響。電極表面固定DNA的密度可通過計時庫侖技術測定[29]。選取修飾電極所用的CDNA濃度分別為0.5、1、5、10和50 μmol/L，電極表面固定的CDNA密度隨修飾電極所用CDNA濃度的升高而增大。當該電極結合核酸適配體后，檢測1 mmol/L ATP所得到的響應信號ΔQ也隨之升高。ΔQ的計算方法見3.4節(jié)。當修飾電極用的CDNA濃度高于10 μmol/L時，電極表面固定的CDNA的密度以及后續(xù)檢測ATP的響應信號的增加趨于平緩，表明電極表面固定的CDNA密度接近飽和。因此后續(xù)實驗選擇10 μmol/L CDNA修飾電極。

此外，選擇了一條27個堿基的寡核苷酸鏈（RDNA）進行了對比實驗，RDNA 3′端的12個堿基與CDNA的3′端的12個堿基互補，其余堿基均為T。傳感器的計時庫侖響應信號值與CDNA雜交ADNA基本相同，證明DNA的序列對于電極的初始信號沒有影響。但該電極與1 mmol/L ATP孵育后，修飾電極的計時庫侖響應信號無明顯變化，證明RDNA不能識別ATP。

3.4 ATP的檢測

圖3A為采用計時庫侖技術在dsDNA修飾的金電極上測得的Anson曲線。圖中曲線由上至下所檢測的ATP的濃度分別為0、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L。而當檢測ATP的濃度為1 mmol/L時，所得曲線與檢測100 μmol/L ATP所得到的曲線幾乎重合，證明此傳感器檢測100 μmol/L ATP時已達到檢測上限。由于選用的第一個脈沖電勢為0.55 V，此時電極表面的吸附物種以還原態(tài)形式存在，假設氧化態(tài)物種的擴散系數(shù)等于還原態(tài)物種的擴散系數(shù)D（cm2 s1），根據(jù)Cottrell公式可得：

其中， Qad為吸附態(tài)的RuHex發(fā)生氧化反應時的法拉第電量。在本實驗條件下，其余參數(shù)均可視為常數(shù)。 F為法拉第常數(shù)，n為電子轉移數(shù)，A為電極面積，C0O為氧化態(tài)RuHex的初始濃度，D為還原態(tài)RuHex的擴散系數(shù)，Qdl為電極表面形成雙電層所需電量。由公式（1）可知，在公式中其它各參數(shù)均為常數(shù)的前提下，Qad與Q（t）值成正比。Qad值可以在Anson曲線上由t=0處的截距得到。由圖3B可知，ATP濃度在1 nmol/L～100 μmol/L范圍內的對數(shù)值與Anson曲線t=0處截距的增加值（ΔQ）成正比（ΔQ（μC）=0.085lgCATP （nmol/L） + 0.014， R=0.995）。傳感器的檢出限為0.5 nmol/L（S/N=3）。使用此傳感器檢測了大鼠腦透析液中ATP的含量，計算得大鼠腦透析液中ATP濃度為（19.2±3.7） nmol/L （n=3）， 與文獻[22]報道的結果相符。

3.5 傳感器的選擇性

考察了傳感器對ATP 類似物CTP、GTP和UTP的響應。CTP、GTP和UTP濃度均為 1 mmol/L，ATP的濃度為100 μmol/L。圖4結果表明，采用本傳感器檢測100 μmol/L ATP的響應信號ΔQ為檢測1 mmol/L的CTP、GTP和UTP響應信號10倍以上，說明所構建的核酸適配體傳感器檢測ATP具有良好的選擇性。

3.6 傳感器的再生

將傳感器CDNA固定在電極表面，核酸適配體通過雜交的方式與CDNA結合。在檢測ATP樣品后，核酸適配體從電極表面解離下來，因此傳感器的再生僅需將檢測后的傳感器與10 μmol/L ADNA溶液在室溫下溫育2 h，使ADNA與電極表面固定的CDNA重新雜交即可實現(xiàn)。圖5顯示了此傳感器及經(jīng)過5次再生的傳感器檢測1 mmol/L ATP前后的電化學響應信號。經(jīng)過5次再生后的電極對ATP的響應仍能達到電極初始響應的90%以上。證明此本傳感器能夠反復再生使用，可有效地降低檢測成本。

4 結 論

構建了一種可再生的核酸適配體ATP計時庫侖電化學傳感器。將核酸適配體的互補鏈CDNA固定在電極表面，核酸適配體通過雜交的方式與CDNA結合。靶分子與核酸適配體結合，使其從電極表面解離，電極表面吸附的RuHex隨之減少，因此計時庫侖信號降低。本傳感器設計方案具有普適、簡單的特點，而且傳感器易于再生。使用本傳感器檢測大鼠腦透析液中的ATP的含量結果與文獻報道結果相符，表明本傳感器可用于實際生物樣品測定。

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