超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用快速測定酒中3種甜味劑

洪 健，周大寨，唐巧玉

(生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000)

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超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用快速測定酒中3種甜味劑

洪 健，周大寨*，唐巧玉

(生物資源保護(hù)與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000)

建立了超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(UPLC/MS-TOF)快速、高靈敏度測定酒中3種甜味劑安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素的定量分析方法.不同類型的酒類樣品經(jīng)超純水稀釋后，以0.1%甲酸水-甲醇溶液作為流動相，采用等度洗脫方式在Endeavorsil C18(1.8 μm，100 mm×2.1 mm)色譜柱上進(jìn)行分離，以電噴霧離子源ESI負(fù)離子模式下進(jìn)行定性、定量分析.實驗結(jié)果表明，在最佳條件下，3種甜味劑在7min內(nèi)實現(xiàn)完全分離；方法的最低檢測限(以信噪比S/N的3倍計)為1～8 μg/L，定量限(以信噪比S/N的10倍計)為3.33～26.7 μg/L；在1～320 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.998；3種甜味劑在配制酒中的回收率為96.33%～104.16%，精密度(RSD)為0.17%～1.36%；在清香型白酒中的回收率為92.38%～100.36%，精密度(RSD)為0.98%～1.85%；在果酒中的回收率為99.97%～103.88%，精密度(RSD)為0.52%～1.59%.該方法具有靈敏度高，分析速度快，且重現(xiàn)性好的優(yōu)點，可用于酒類樣品中甜味劑的快速檢測.

超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜；酒；甜味劑

安賽蜜(acesulfame, AK)、糖精鈉(sacharin sodium, SA)和甜蜜素(sodium cyclamate, SC)是常用的人工合成食品添加劑，作為甜味劑，可改善食品口感，調(diào)節(jié)風(fēng)味，提高食品品質(zhì).近年來，隨著食品添加劑的廣泛使用，甜味劑在食品中的應(yīng)用越來越廣泛，研究發(fā)現(xiàn)，糖精鈉、甜蜜素等甜味劑的使用可能會損害腎功能，致癌致畸，對健康造成危害[1].我國在《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB2760-2014中明確規(guī)定了甜味劑的種類和限量標(biāo)準(zhǔn)[2].以酒類產(chǎn)品為例，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定只允許在配制酒中添加少量的甜味劑，其他酒類產(chǎn)品禁止添加任何甜味劑.由于酒產(chǎn)品的種類繁多，部分廠家可能存在甜味劑使用不規(guī)范等問題，導(dǎo)致食品安全檢測任務(wù)繁重.因此，建立甜味劑快速、準(zhǔn)確的檢測方法對于酒類安全控制具有重大意義.

目前，檢測甜味劑的方法很多[3]，如高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[1]、紫外分光光度法[4]、氣相色譜法[5]、離子色譜法[6]等.其中紫外分光光度法、液相色譜法與氣相色譜法靈敏度低，易出現(xiàn)假陽性[7]，液相色譜-質(zhì)譜法具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點，可實現(xiàn)安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素的同時檢測[8-11]，但該方法存在檢測速度慢、效率低等問題.雖然關(guān)于酒產(chǎn)品中甜味劑檢測方法的報道有很多，但目前尚未見到利用超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC/MS-TOF)來檢測酒產(chǎn)品中的甜味劑.UPLC/MS-TOF具有質(zhì)量分析精確、靈敏度高、采集速度快、定性定量分析準(zhǔn)確的功能.該儀器使用MassHunter工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其分析功能強(qiáng)大，可實現(xiàn)多種分析應(yīng)用，包括小分子和大分子化合物的譜圖分析、鑒定以及定性和定量.本文通過建立超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法(UPLC/MS-TOF)同時測定酒類中三種常用甜味劑，為酒產(chǎn)品的監(jiān)督和管理提供更快速便捷、準(zhǔn)確可靠的理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

采用Agilent Technologies 1290超高壓液相色譜和6224飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測甜味劑，其配有電噴霧電離(ESI)源.通過Agilent Masshunter工作站和數(shù)據(jù)處理軟件對信號進(jìn)行采集和處理；實驗用水為超純水(Milipore, Bedford，MA，USA)；超聲波清洗器(PS-30型 深圳市潔匯超聲洗凈設(shè)備有限公司).

安賽蜜(acesulfame，AK，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限公司，批號SB05-217-2008，1 mg/mL)，糖精鈉(sacharin sodium，SA，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限公司，批號GBW(E)100166，1 mg/mL)，甜蜜素(sodium cyclamate，SC，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限公司，批號GBW(E)100173，10 mg/mL)；甲醇和甲酸均為色譜純，購自DIKMA公司；酒類樣品來源于公司送檢樣品.(A類為配制酒；B類為清香型白酒；C類為果酒).所有試劑使用前均用濾膜過濾(孔徑：0.45 μm，直徑：5 cm，購自上海市新亞凈化器件廠).

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜分析條件

色譜柱：Endeavorsil C18(購自DiKMA公司，1.8 μm，100 mm×2.1 mm)；流動相：A相，甲酸-水溶液(0.1∶100，V/V)；B相，甲醇溶液；等度洗脫，比例為65%的甲酸水溶液，35%的甲醇；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；色譜柱溫度：30 ℃.

1.2.2 質(zhì)譜分析條件

離子源：ESI電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)模式掃描；干燥氣溫度：350 ℃，流速10 L/min；霧化器壓力0.310 MPa，毛細(xì)管電壓3 500 V，毛細(xì)管出口電壓175 V，錐孔電壓65 V；氮氣：純度不低于99.999 %；選擇負(fù)離子(EIC)采集方式，其中采集速度為1.5 spectra·s-1，掃描范圍m/z 50～3 000；選定的分子離子[M-H]-的質(zhì)荷比分別為：161.993(安賽蜜)，181.999(糖精鈉)，178.062(甜蜜素).

1.2.3 校準(zhǔn)曲線的制作

3種甜味劑安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)品的母液質(zhì)量濃度分別為1、1、10 mg/mL，分別以超純水配置成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，糖精鈉和甜蜜素置于4 ℃下保存，安賽蜜保存在-20 ℃，有效期為1月.臨用前分別量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液并用超純水逐級稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素混合標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、160、320 μg/L.按所設(shè)UPLC/MS-TOF條件進(jìn)樣5 μL，測定進(jìn)樣濃度與相應(yīng)質(zhì)譜峰面積的關(guān)系.

1.2.4 樣品預(yù)處理

移取50 mL的酒類樣品于燒杯中，沸水浴蒸發(fā)至少量液體，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，用超純水定容，混勻后過膜(孔徑：0.45 μm，直徑：5 cm)待測.若樣品中甜味劑含量太高，則用超純水稀釋至線性范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度.

1.2.5 精密度與回收率的測定

向酒類樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.4的方法進(jìn)行預(yù)處理，按色譜和質(zhì)譜分析條件進(jìn)行檢測，對酒類樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，計算精密度和回收率.具體過程為：對樣品進(jìn)行預(yù)處理并稀釋后，向樣品中添加100 μg/L的甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)液，混勻，待測.每個加標(biāo)樣品做6個重復(fù)測定.

2 結(jié)果和分析

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

流動相的比例和種類在色譜分離中起著非常重要的作用.為了得到最佳分離效果，本實驗對色譜的分離條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化.首先對流動相的選擇進(jìn)行了探索，分別對乙腈-水, 乙腈-水-甲酸，甲醇-水、甲醇-水-甲酸等組合體系進(jìn)行對照實驗.結(jié)果表明, 甲酸水-甲醇組合體系得到的色譜峰和質(zhì)譜總離子流圖效果相對更好，通過改變甲酸水-甲醇的比例，將有機(jī)相從25%調(diào)至35%，發(fā)現(xiàn)隨著流動相中有機(jī)相比例的增加，3種甜味劑的流出順序不變，但保留時間逐漸減小，為了在最短的時間內(nèi)得到最好的分離效果，實驗選擇有機(jī)相比例為35%.同時該實驗對等度洗脫與梯度洗脫的效果進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，運用等度洗脫能使3種待測物在7 min 內(nèi)實現(xiàn)完全分離(圖1).其次優(yōu)化了流速、柱溫對分離效果的影響，該實驗對比了0.1～0.5 mL/min范圍內(nèi)的流速，發(fā)現(xiàn)流速為0.2 mL/min時, 三種甜味劑的分離效果最佳.同時，隨著柱溫的升高(20～35 ℃), 分析時間縮短.為了在最短的時間和最少的溶劑消耗中獲得最佳的分離效率，最終確定以流速0.2 mL/min、柱溫30 ℃為最佳實驗條件.三種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品和A類樣品的總離子流及選擇離子流色譜圖如圖1所示.

圖1 三種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的總離子流圖及選擇離子流色譜圖Fig.1 The election current(EIC) and total ion current(TIC) mass chromatogram of three sweeteners and sample

2.2 質(zhì)譜檢測條件優(yōu)化

在ESI的模式下，對3種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)譜信號強(qiáng)度進(jìn)行ESI+和ESI-電離模式的掃描.結(jié)果表明，3種甜味劑在ESI-模式下均有較強(qiáng)的質(zhì)譜信號，而在ESI+模式下只有甜蜜素顯示出質(zhì)譜信號，但其質(zhì)譜信號強(qiáng)度低于ESI-模式.因此該實驗選用ESI-電離模式，圖2為3種甜味劑的質(zhì)譜圖.

圖2 3種甜味劑的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrum of three sweeteners

2.3 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在對樣品進(jìn)行測定時，樣品色譜峰的保留時間應(yīng)該與標(biāo)準(zhǔn)品保持一致，由于UPLC/MS-TOF具有基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)在電離源霧化電離的程中，其對目標(biāo)物的霧化電離會產(chǎn)生抑制作用.因此對背景進(jìn)行扣除之后，在同樣的條件下，得到的樣品譜圖中各離子相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)溶液在相應(yīng)濃度下得到的譜圖進(jìn)行對比，其最大相對偏差不能超過歐盟委員會中規(guī)定[12]的范圍，以此來判斷該樣品中是否存在相對應(yīng)的被測物.根據(jù)各目標(biāo)組分的質(zhì)譜特性，配置相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜和質(zhì)譜的條件下進(jìn)行測定，以待測物在質(zhì)譜中的峰面積對標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(C，μg/L)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3).由圖3可知，3種甜味劑在相應(yīng)的測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.998.利用在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點的響應(yīng)值進(jìn)行推算，以信噪比S/N的3倍所對應(yīng)化合物的含量作為檢出限(LOD)，S/N的10倍確定為最低定量限(LOQ)，得到3種甜味劑的LOD和LOQ如表1所示.由表1可知，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素的檢測限(LOD)分別為8、4、1 μg/L，定量限(LOQ)分別為26.7、13.3、3.33 μg/L.

圖3 3種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve line of three sweeteners

甜味劑線性范圍/(μg·L-1)線性方程相關(guān)系數(shù)LOD/(μg·L-1)LOQ/(μg·L-1)安賽蜜26.7～500Y=0.0003x-7.69740.9994826.7糖精鈉13.3～500Y=0.0002x-5.45200.9979413.3甜蜜素3.33～500Y=0.0001x-0.91690.999913.33

2.4 樣品的回收率和精密度

通過向酒類樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液來計算精密度和回收率(表2)，結(jié)果表明，在A、B、C三類樣品中，添加標(biāo)準(zhǔn)品均得到了較好的回收率和精確度.3種甜味劑在A類樣品中的回收率為96.33%～104.16%，精密度(RSD)為0.17%～1.36%；在B類樣品中的回收率為92.38%～100.36%，精密度(RSD)為0.98%～1.85%；在C類樣品中的回收率為99.97%～103.88%，精密度(RSD)為0.52%～1.59%.

表2 2種添加劑在酒類樣品中的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

2.5 樣品測定

按照本實驗所建立的方法，對某公司送檢的6份酒類樣品中3種甜味劑安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素進(jìn)行了定性定量分析，檢測結(jié)果見表3.在6個樣品中，均檢測出含有甜蜜素，其中配制酒與果酒中檢出含量最多，在30.04 mg/L與37.84 mg/L之間，清香型白酒中甜蜜素含量較低，在0.017 mg/L與0.07 mg/L之間；檢出含有糖精鈉的樣品1份，為清香型白酒，含量很低，為0.012 mg/L；在6個樣品中，均未檢測出安賽蜜，出現(xiàn)該種情況認(rèn)為有兩種可能：一是為了改善酒的口味人工添加了甜味劑，另一種可能是釀制或調(diào)制過程中的原材料本身就含有或添加了甜味劑.考慮到所測酒類樣品均為公司送檢樣品，這說明在市場上銷售的各種配制酒、果酒更有可能非法添加甜味劑.有些酒類樣品的甜味劑為低劑量添加，有些甜味劑的添加則高于國家標(biāo)準(zhǔn)，需引起高度重視，應(yīng)對潛在的食品安全風(fēng)險.

表3 酒類樣品甜味劑測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用快速測定酒類產(chǎn)品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素這3中甜味劑的分析方法，在流動相為0.1%甲酸-水，有機(jī)相比例為35 %，流速為0.2 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃，ESI-電離模式的條件下，3種甜味劑在7min內(nèi)達(dá)到最佳分離效果，此方法的優(yōu)勢在于樣品前處理簡單，酒類樣品的濃縮方便，可以對3種甜味劑進(jìn)行同時檢測并具有良好的回收率和精密度，降低了工作量，為酒類產(chǎn)品中低劑量、復(fù)合甜味劑的檢測提供了快速準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù).

[1] 吳世嘉,王洪新,陶冠軍.超高壓液相色譜-質(zhì)譜同時測定白酒中6種微量甜味劑的方法研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2010,29(5):670-676.

[2] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB2760-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[3] 劉婷,吳道澄.食品中甜味劑的檢測方法[J].中國調(diào)味品,2011,36(3):1-12.

[4] 桑宏慶,于秋生.紫外分光光度法測定甜蜜素[J].檢測與分析, 2006,9(11): 29-29

[5] 岳志堅.毛細(xì)管氣相色譜法測定白酒中甜蜜素、糖精鈉和安賽蜜[J].理化檢驗 (化學(xué)分冊),2008(8):785.

[6] 卜宇宏,李明,李靜.離子色譜測定白酒中甜蜜素[J].釀酒,2011,38 (5):71-73.

[7] ZYGLERA,WASIK A,NAMIESNIK J.Analytical methodologies for determination of artificial sweeteners in foodstuffs[J].Trends Analyt Chem,2009,28(9):1082-1102.

[8] 王群,丁軼聰.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定酒類中甜蜜素含量的探討和改進(jìn)[J].化學(xué)分析計量,2012,21(4):62-64.

[9] 曾紹東,杜海群,郭宏斌,等.超高壓液相色譜-質(zhì)譜法測定水果中添加的3種人工合成甜味劑[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2013,4(1):239-244.

[10] 馬作江,柏雪,蔡學(xué),等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定酒類中的4種甜味劑[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2013,4(4):1185-1189.

[11] 陳鑫.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飲料和蛋糕中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素[J].質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督研究,2014,1(1):1-13.

[12] European Commission.Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results[Z].official journal of the European communities,2002,L221:8.

責(zé)任編輯：高 山

Rapid Determination of Three Sweeteners Content in Liquor by Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

HONG Jian,ZHOU Dazhai*,TANG Qiaoyu

(Hubei Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization,Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

A rapid and sensitive quantitative analysis method for three sweeteners (acesulfame, saccharin sodium and sodium cyclamate) in liquor samples by ultra-performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry (UPLC-TOF-MS) was established. After the sample was diluted by ultrapure water,a 0.1% formic acid water-methanol solution was used as the mobile phase and subjected to isocratic elution at Endeavorsil C18(available from DiKMA, 1.8 μm，100 mm×2.1 mm) , and the three kinds of sweeteners were determined by quantitative analysis by electrospray ionization source ESI negative ion mode. The experimental results show that under the optimal conditions,three sweeteners achieve full separation within 7 min.The detection limit (LOD, S/N=3) was 1.0～8.0 μg /mL,(LOQ,S/N=10) was 3.33～26.7 μg/L.There was a good linearity between the three sweeteners in the range of 1 ～ 320 μg / L,the correlation coefficient was over 0.998.the recoveries in the liquor samples of compound liquor were in the range of 96.33%～104.16%,RSD were in the range of 0.17%～1.36%;the recoveries in the liquor samples of flavor types liquor were in the range of 92.38%～100.36%, RSD were in the range of 0.98%～1.85%; the recoveries in the liquor samples of fruit liquor were in the range of 99.97%～103.88%,RSD were in the range of 0.52%～1.59%.The method is sensitive, adaptable and reproducible to the rapid determination of sweeteners in liquor samples.

UPLC-TOF-MS;liquor;sweetener

2017-04-10.

湖北省教育廳青年項目(Q20131908)；2014年度湖北省本科高?！皩I(yè)綜合改革”試點項目(2014029).

洪健(1989-)，女，碩士，主要從事植物生理生化的研究;*

周大寨(1976-)，男(土家族)，碩士，高級實驗師，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)的研究.

1008-8423(2017)02-0162-05

10.13501/j.cnki.42-1569/n.2017.06.012

TS262.3；TS261.7

A