季德勝蛇藥通過(guò)調(diào)控miR-335抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖作用機(jī)制探討

張玉 邵建國(guó) 陳琳 卞兆連 刁花玉 達(dá)坤林

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季德勝蛇藥通過(guò)調(diào)控miR-335抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖作用機(jī)制探討

張玉 邵建國(guó) 陳琳 卞兆連 刁花玉 達(dá)坤林

目的 探討季德勝蛇藥對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞增殖作用的影響并進(jìn)一步從miRNA層面探討其抑制增殖的調(diào)控機(jī)制。方法 以肝癌Huh-7細(xì)胞為模型，制備不同濃度的兔含藥血清后培養(yǎng)Huh-7細(xì)胞，并同時(shí)設(shè)置相應(yīng)濃度的對(duì)照組。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-335入Huh-7細(xì)胞后對(duì)該細(xì)胞增殖能力的影響；采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)qRT-PCR檢測(cè)季德勝蛇藥含藥血清對(duì)Huh-7細(xì)胞中miR-335的調(diào)控作用；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)季德勝蛇藥含藥血清對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖能力的影響；Western-blot檢測(cè)miR-335潛在靶向Bcl-w表達(dá)水平的變化。結(jié)果 miR-335過(guò)表達(dá)后CCK-8實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，其OD值顯著降低(P<0.01)。含藥血清干預(yù)下，與對(duì)照組相比，同等濃度的蛇藥組miR-335表達(dá)水平較高，且在一定濃度范圍內(nèi)含藥血清濃度越高，miR-335在Huh-7細(xì)胞中的表達(dá)也相繼增高；此外，CCK-8實(shí)驗(yàn)下季德勝蛇藥含藥血清組都較正常血清組OD值低，且濃度越高，其OD值越低，都有較明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上調(diào)miR-335后，Huh-7細(xì)胞Bcl-w蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論 季德勝蛇藥通過(guò)調(diào)控miR-335能抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖。

季德勝蛇藥； 人肝癌細(xì)胞； miR-335； Bcl-w

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球居第五位。目前HCC患者的5年生存率不到10%，死亡率位于各大惡性腫瘤第二位[1-2]。HCC確診時(shí)已多屬中、晚期，又由于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡逃避、血管生成以及腫瘤耐藥等復(fù)雜的生物學(xué)行為也為HCC的根治帶來(lái)一定的困難，預(yù)后極差[3-4]。因此，深入研究腫瘤在這些復(fù)雜生物學(xué)惡性表型形成中的信號(hào)傳遞及調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。季德勝蛇藥片是中國(guó)特色中成藥之一，能夠清熱解毒，活血化瘀止痛。目前主要用于治療蛇蟲(chóng)咬傷，但近年來(lái)在臨床實(shí)踐中運(yùn)用該藥治療肝癌也起到一定療效。因此本研究旨在觀察季德勝蛇藥對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞增殖作用影響并進(jìn)一步探討該特色藥對(duì)Huh-7細(xì)胞中miR-335表達(dá)水平及靶蛋白Bcl-w表達(dá)變化的影響，從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平為該藥的抗癌作用機(jī)制提供新視角，并為HCC發(fā)病機(jī)制及治療方法提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6只中國(guó)大耳白兔，體質(zhì)量(3.0±0.5) kg，購(gòu)于南通大學(xué)動(dòng)物房(許可證號(hào)：SYXK(蘇)2012-0031)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料：白兔基礎(chǔ)飼料，購(gòu)買于南通大學(xué)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)期間各組實(shí)驗(yàn)白兔均服用自來(lái)水，自由飲食。

1.2 人肝癌Huh-7細(xì)胞

購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)，由上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保種培養(yǎng)并友情提供。

1.3 主要試劑與儀器

季德勝蛇藥:購(gòu)買于南通市第三人民醫(yī)院，產(chǎn)于南通精華制藥集團(tuán)股份有限公司，藥品批號(hào)：21150612。DMEM高糖完全培養(yǎng)基:立菲生物有限公司；胎牛血清：Invitrogen公司；胰蛋白酶：Invitrogen公司；Mimics:上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CCK-8試劑：上海同仁有限公司；RT-PCR試劑盒：廣州復(fù)能基因有限公司；Bcl-w抗體：武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；蛋白抽提及濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天有限公司；GeneAmp PCR System 9700、CFX Connect Real-time System、RT-6000酶標(biāo)儀(深圳雷桂生命科學(xué)有限公司)；紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(南通銀河生物科技有限公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔板(Corning公司)。

1.4 兔含藥血清的制備

大耳白兔6只，分為正常對(duì)照組和蛇藥組。蛇藥組給藥劑量為1540 mg/(kg·d)，劑量為正常成人標(biāo)準(zhǔn)體重的10倍，每天相同時(shí)間灌胃1次，每天給藥總?cè)萘繛?0 mL/kg；另對(duì)照組給予相同容量的生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃7天，第8天禁食不禁水，于當(dāng)天相同時(shí)刻灌胃4小時(shí)后心臟穿刺取血，分離兔血清。

1.5 Huh-7細(xì)胞的傳代及培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至95%左右時(shí)，加入適量的胰酶消化；待大部分細(xì)胞變圓時(shí)輕輕倒掉胰酶，加入5 mL完全培養(yǎng)基終止胰酶消化細(xì)胞，用無(wú)菌吸管吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞面至細(xì)胞脫落。將上述細(xì)胞懸液分瓶，加入新的完全培養(yǎng)基后置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞，分別鋪于96孔板，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，設(shè)空白調(diào)零孔，孔板周圍予以PBS充填。每孔接種約4×103個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后分別于24小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí)取出一塊96孔板，每孔加入10 μL CCK-8試劑及100 μL PBS，于2.5小時(shí)后在RT-6000酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其OD值。每組8個(gè)OD值，去除最大與最小值，其余6個(gè)值計(jì)算出平均值及方差。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 季德勝蛇藥含藥血清對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞中miR-335的調(diào)控作用

待肝癌Huh-7細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰蛋白酶消化后接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置各濃度含藥血清及相應(yīng)濃度的對(duì)照組血清，分別加入6孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA，qRT-PCR檢測(cè)Huh-7細(xì)胞中miR-335的表達(dá)水平。

1.8 季德勝蛇藥含藥血清對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞增殖的影響

待肝癌細(xì)胞傳至3～4代，生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，用胰蛋白酶消化后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入約4000個(gè)細(xì)胞，每組各8孔，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每孔各150 μL，培養(yǎng)6小時(shí)待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)上清液，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基100 μL，12小時(shí)后吸棄培養(yǎng)上清液，分別配制5%、10%、20%的含藥血清(5%的含藥血清配制方法即100 μL的總培養(yǎng)液中含5 μL的藥物血清，依此類推)加入含藥血清培養(yǎng)液。加藥后分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)取出一塊96孔板，每孔加入10 μL CCK-8試劑及100 μL PBS，于2.5小時(shí)后在RT-6000酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)其OD值。

1.9 Huh-7細(xì)胞Western-blot實(shí)驗(yàn)

miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞蛋白。進(jìn)行蛋白定量(BCA法)后加入1X上樣緩沖液，制作SDS電泳膠，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉和孵育抗體，化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，Photoshop進(jìn)行蛋白圖像的采集及后期處理檢測(cè)靶蛋白Bcl-w的表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-335轉(zhuǎn)染效率

將miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)Huh-7細(xì)胞中miR-335表達(dá)水平的變化，其實(shí)驗(yàn)組miR-335含量顯著較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，其OD值顯著降低，說(shuō)明miR-335過(guò)表達(dá)能顯著抑制Huh-7細(xì)胞增殖(P<0.01)。而空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組Huh-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間段OD值變化比較

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.01; 與陰性對(duì)照組比較，bP<0.01。

2.3 季德勝蛇藥含藥血清對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞中miR-335的調(diào)控作用

結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，5%及10%濃度的含藥組miR-335表達(dá)水平較高，且在20%的濃度范圍內(nèi)含藥血清濃度越高，miR-335在Huh-7細(xì)胞中的表達(dá)也相繼增高。而不含藥血清對(duì)照組之間miR-335表達(dá)水平變化不明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度季德勝蛇藥含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞中miR-335的調(diào)控作用

2.4 季德勝蛇藥含藥血清對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同一濃度下，同一時(shí)間點(diǎn)，季德勝蛇藥含藥血清組都較正常血清組其OD值低，除5%濃度48小時(shí)的OD值差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他都有較明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度下，濃度越高，其OD值越低。見(jiàn)表2。說(shuō)明季德勝蛇藥含藥血清能抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖，且濃度越高對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖抑制越明顯。

2.5 Huh-7細(xì)胞Western-blot實(shí)驗(yàn)

在本研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)在Huh-7細(xì)胞中高表達(dá)miR-335，隨后Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞后其靶蛋白Bcl-w的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-335后，Huh-7細(xì)胞Bcl-w蛋白表達(dá)水平降低，表明miR-335可能是通過(guò)抑制其靶基因Bcl-w的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控作用。見(jiàn)圖2。

表2 兩組血清干預(yù)下Huh-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間段OD值變化比較

注： 與同時(shí)段、同濃度正常血清相比，aP<0.05，bP<0.01。

圖2 WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-335過(guò)表達(dá)入HuH-7細(xì)胞后靶蛋白Bcl-w的表達(dá)情況

3 討論

季德勝蛇藥片具有清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀、鎮(zhèn)靜排膿等作用，是一種傳統(tǒng)的中成藥，主要用于治療蛇傷。它是國(guó)家級(jí)秘方,具體成分不祥，但所知的四種成分均有抗腫瘤作用。七葉一枝花有止血、抗腫瘤、細(xì)胞毒、抗炎、抗菌抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等多功能的生理作用[5]；蟾酥提取液可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞走向凋亡[6]；蜈蚣提取液主要作用于癌癥腫瘤血管，能幫助誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死[7]；地錦草中的槲皮素成分能在肝腫瘤細(xì)胞和乙肝病毒中起到一定的抑制作用[8]。近年來(lái)它在諸多疾病的治療中都起到了一定的療效，其中關(guān)于季德勝蛇藥治療肝炎[9]、肝纖維化[10]乃至肝癌[11]相關(guān)的報(bào)導(dǎo)屢見(jiàn)不鮮，但其內(nèi)在具體的調(diào)控機(jī)制卻很少有報(bào)導(dǎo)。因此本實(shí)驗(yàn)將以miRNA表達(dá)水平為著眼點(diǎn)來(lái)探討中醫(yī)藥治療肝癌未來(lái)可能性的靶點(diǎn)。

miRNA是約19～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA。最新研究發(fā)現(xiàn)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，miRNAs在肝癌中的價(jià)值越來(lái)越引起人們的關(guān)注，它與肝癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、凋亡密不可分。人們通過(guò)對(duì)不同臨床分期、不同病理特征的肝癌miRNAs的研究，尋找出與腫瘤診斷、分期、療效及預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志性miRNAs。如在肝臟最豐富的miRNA:miR-122[12]，能調(diào)節(jié)24種肝細(xì)胞中特定基因的表達(dá)水平并參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞成熟。miRNA在肝癌中還能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，如：miR-26a[13]直接通過(guò)針對(duì)D2和E2兩個(gè)細(xì)胞周期蛋白誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯。Bcl-w與多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密不可分，如：肝癌、大腸癌、膽囊癌及胃癌等；在細(xì)胞凋亡的有關(guān)研究中Bcl-2被最早發(fā)現(xiàn)，它的成員都能調(diào)控并決定細(xì)胞凋亡過(guò)程[14-15]。Bcl-w基因?qū)τ贐cl-2家族中抗凋亡基因成員來(lái)說(shuō)發(fā)現(xiàn)的較晚，是現(xiàn)在細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)，分子組織學(xué)上與Bcl-2有較高的同源性。

大多數(shù)關(guān)于中醫(yī)藥能發(fā)揮其抑制癌細(xì)胞增殖等功能是通過(guò)中藥及其有效成分調(diào)節(jié)編碼蛋白的腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[16-17],并沒(méi)有將miRNA當(dāng)成中醫(yī)藥治療腫瘤未來(lái)可能性的靶點(diǎn)。假設(shè)中醫(yī)藥通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA靶基因相關(guān)的表達(dá)，使異常表達(dá)的miRNA基因趨向正常化，最終能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等，起到防治腫瘤的效用。如果這種假說(shuō)成立，那么所調(diào)控的miRNA可能是中藥直接或間接調(diào)節(jié)的靶基因，因此，可以從miRNA水平揭示中醫(yī)藥防治腫瘤的調(diào)控機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究過(guò)表達(dá)miR-335入Huh-7細(xì)胞后，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)miR-335對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞后能顯著抑制Huh-7細(xì)胞增殖，說(shuō)明miR-335在肝癌中可能扮演一個(gè)抑癌因子的角色。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)季德勝蛇藥含藥血清干預(yù)下肝癌Huh-7細(xì)胞中miR-335表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)季德勝蛇藥含藥血清在一定濃度范圍內(nèi)濃度越高，miR-335在Huh-7細(xì)胞中的表達(dá)也相繼增高。本研究中通過(guò)不同濃度的季德勝蛇藥含藥血清來(lái)干預(yù)肝癌Huh-7細(xì)胞后檢測(cè)Huh-7細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)季德勝蛇藥含藥血清能抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖，且濃度越高對(duì)Huh-7細(xì)胞增殖抑制越明顯。最后總結(jié)出季德勝蛇藥含藥血清通過(guò)調(diào)節(jié)miR-335能抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖。在本研究中，筆者通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)在Huh-7細(xì)胞中高表達(dá)miR-335，隨后Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-335過(guò)表達(dá)入Huh-7細(xì)胞后其靶蛋白Bcl-w的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-335后，Huh-7細(xì)胞Bcl-w蛋白表達(dá)水平降低，表明miR-335可能是通過(guò)抑制其靶基因Bcl-w的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的。但目前實(shí)驗(yàn)尚存在某些不足之處：其一，含藥血清對(duì)肝癌Huh-7細(xì)胞中miR-335的調(diào)控作用及增值影響只限定在20%的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而對(duì)20%的濃度之外的影響尚不知曉。其二，若能進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討季德勝蛇藥干預(yù)Huh-7細(xì)胞后其細(xì)胞Bcl-w的表達(dá)情況，得到的結(jié)論是Bcl-w表達(dá)降低，且濃度越高，降低的越明顯，則更說(shuō)明miR-335與Bcl-w可能是季德勝蛇藥抑制細(xì)胞增殖的通路之一，因此有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

總之，季德勝蛇藥含藥血清通過(guò)調(diào)節(jié)miR-335能抑制肝癌Huh-7細(xì)胞增殖，進(jìn)一步反映出miR-335將有望成為中藥直接或間接調(diào)節(jié)的靶基因，從miRNA基因水平闡述中藥作用的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，為中藥防治腫瘤提供有效的分子靶點(diǎn)，且也為季德勝蛇藥治療肝癌提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯： 禹佳)

Mechanism discussion ofJiDeShengSheyaoinhibiting liver cancer cell Huh-7 proliferation through regulating miR-335

ZHANGYu，SHAOJianguo，CHENLin，etal.

Thethirdpeople’sHospitalofNantong，Nantong226000,China

SHAOJianguo，E-mail:shaojianguo4144@163.com

Objective To discuss the mechanism ofJiDeShengSheyaoinhibiting liver cancer cell Huh-7 proliferation through regulating miRNA.Methods Cell Huh-7 were used as the model for study . Rabbits were given Jidesheng Sheyao by gastrogavage to prepare medicated serum. Then Huh-7 was cultured with medicated serum by different concentration. At the same time, the corresponding concentrations of the control group were set up. The effect of miR-335 on Huh-7 cells proliferation was tested by CCK-8 assay. QRT-PCR was used to detect the regulation function of miR - 335 on human liver cancer Huh-7 cell. The effect ofJideshengSheyaomedicated serum on Huh-7 cells proliferation was tested by CCK-8 assay. The effect of miR-335 on potential target protein Bcl-w was tested by Western-blot. Results The OD value of the experimental group was decreased significantly compared with blank control group and the negative control group by CCK-8 assay after up-regulation of miR-335 (P<0.01).The miR-335 expression level was higher compared with the control group in the same concentration of snake medicine group. In a certain concentration range, the expression of miR-335 in Huh-7 cells increased with increasing serum concentration; In addition, the OD value ofJiDeShengSheyaomedicated serum group were lower compared with normal serum, and the concentration were higher , its OD value were lower by CCK 8 experimental. They had also a significant statistical difference (P<0.01,P<0.001). After raising miR-335, the Bcl-w protein expression levels in Huh-7 cells were lower. ConclusionJiDeShengSheyaocan inhibite liver cancer Huh-7 cell proliferation through regulating miR-335.

JideshengSheyao； Huh-7； miR-335； Bcl-w

江蘇省衛(wèi)生廳面上項(xiàng)目(H201453)；南通市社會(huì)事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計(jì)劃(HS2014061)；2014年度江蘇省南通市市級(jí)應(yīng)用研究計(jì)劃(BK2014073)；南通市科技局:新型臨床診療技術(shù)攻關(guān)(MS22015105)

226000 南通市第三人民醫(yī)院中醫(yī)科(張玉、達(dá)坤林),肝病研究所(邵建國(guó)、陳琳、卞兆連、刁花玉)

張玉(1991- )，碩士，住院醫(yī)師。研究方向:中西醫(yī)結(jié)合消化內(nèi)科。E-mail：1198963491@qq.com

邵建國(guó)(1965- )，博士，主任醫(yī)師，教授。研究方向：消化系統(tǒng)疾病臨床研究。E-mail:shaojianguo4144@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.015

2016-06-14)