針康法對(duì)腦缺血大鼠腦組織微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)及aFGF、PF4蛋白表達(dá)影響*

陳慧杰，唐 強(qiáng)△，朱路文，葉 濤 ，李 季 ，顏培宇，王 艷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

針康法對(duì)腦缺血大鼠腦組織微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)及aFGF、PF4蛋白表達(dá)影響*

陳慧杰1，唐 強(qiáng)1△，朱路文1，葉 濤2，李 季1，顏培宇2，王 艷1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討針康法對(duì)腦缺血后腦組織微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)及酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)、血小板第4因子(PF4)蛋白表達(dá)影響。方法：180只大鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組、康復(fù)組、針康組及假手術(shù)組。參照Longa線栓法制備永久的局灶性腦缺血模型。模型組和假手術(shù)組不給予任何干預(yù)，針刺組應(yīng)用頭穴叢刺針?lè)?，康?fù)組應(yīng)用跑臺(tái)訓(xùn)練，針康組應(yīng)用頭穴叢刺結(jié)合跑臺(tái)訓(xùn)練。電鏡觀察各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血半暗區(qū)皮層微血管內(nèi)皮的超微結(jié)構(gòu)，Western Blot 法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠缺血半暗區(qū)皮層aFGF及PF4蛋白表達(dá)。結(jié)果：微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu):術(shù)后3天，針刺組、康復(fù)組及針康組可見(jiàn)整個(gè)管腔內(nèi)充滿內(nèi)皮細(xì)胞，管周水腫程度減輕，但針康組的效果較好;術(shù)后7天時(shí)，針康組內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，微血管內(nèi)膜平整，管腔無(wú)狹窄,而針刺組和康復(fù)組微血管內(nèi)膜較針康組欠平整，微血管管腔狹窄;術(shù)后14天時(shí)，針康組微血管基膜是完整的，且內(nèi)皮細(xì)胞基本恢復(fù)正常,而針刺組及康復(fù)組微血管基膜稍顯不完整。aFGF及PF4蛋白表達(dá)：術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，較模型組比較，各干預(yù)組aFGF蛋白表達(dá)明顯升高(均P<0.05)，PF4蛋白均明顯降低(均P<0.05)；術(shù)后7天、14天，較針刺組、康復(fù)組比較，針康組aFGF蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)，PF4蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)。結(jié)論：針康法通過(guò)上調(diào)缺血腦組織aFGF，下調(diào)PF4蛋白表達(dá)，降低缺血腦組織血管內(nèi)皮的損傷。

腦缺血；針康法；酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；血小板第4因子；血管新生

腦缺血后大腦組織缺血、缺氧，局限性腦組織壞死或腦軟化，破壞了神經(jīng)血管單元的穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。腦缺血后神經(jīng)血管單元的重構(gòu)是促進(jìn)腦功能重塑的重要環(huán)節(jié)。血管新生能夠協(xié)調(diào)優(yōu)化神經(jīng)血管單元各組分，為其重構(gòu)提供必要的神經(jīng)血管底物。此過(guò)程受血管再生正、負(fù)性調(diào)節(jié)性質(zhì)血管因子調(diào)控。酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Acidic fibroblast growth factor，aFGF)為正性調(diào)節(jié)血管因子，血小板第4因子(Plateletfactor-4，PF4)為負(fù)性調(diào)節(jié)血管因子，二者在血管新生中起重要作用[1-2]。本研究探討針康法對(duì)腦缺血大鼠腦組織微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)及aFGF與PF4蛋白表達(dá)影響，探討針康法降低腦缺血后神經(jīng)功能障礙的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性大鼠(Sprague-Dawley系)，初始體質(zhì)量250～280 g，鼠齡10～12周，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供,合格證書(shū)編號(hào)SYXK(黑)2010007。SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，溫度要求23℃～25℃，濕度保持在50%～60%，12 h明暗人工光照循環(huán)。實(shí)驗(yàn)前3天進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練(15 m/min，30 min/天)，篩選可完成跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠180只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠的處理嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)條例。

將180只大鼠順序編號(hào)，計(jì)算機(jī)生成一個(gè)含180個(gè)數(shù)的隨機(jī)數(shù)字表，任意選擇表中一個(gè)數(shù)為起始點(diǎn)對(duì)應(yīng)大鼠編號(hào)1，從左至右，自上而下分別對(duì)應(yīng)1～180號(hào)大鼠。確定各編號(hào)的組別的方法是用表中隨機(jī)數(shù)字除以5得余數(shù)，余數(shù)0、1、2、3、4分別對(duì)應(yīng)假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組及針康組，最終各組隨機(jī)分入36只大鼠，依照此法，將各組的36只大鼠隨機(jī)分入3天、7天、14天3個(gè)亞組中(n=12)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中剔除造模失敗或死亡的大鼠，并繼續(xù)造模補(bǔ)充以保證最終進(jìn)行電鏡及Western Blot檢測(cè)時(shí)均有6只大鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑：aFGF 、PF4多克隆抗體(SANTA CRUZ)，羊抗兔IgG-HRP(BEYOTIME),β-actin抗體(WANLEIBIO)，TEMED(AMRESCO),PVDF膜(MILLIPORE)，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(FERMENTAS)。

儀器：一次性無(wú)菌針灸針(華佗牌)，Hettich Mikro 220冷凍離心機(jī)(HETTICH)，Multiskan FC型酶標(biāo)儀(THERMO)，Smart Simplicity型超純水系統(tǒng)(MERCK)，DYY-7C 型電泳儀電源、DYCZ-24DN型蛋白凝膠電泳儀、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)印電泳儀、WD-9405B 型脫色搖床、WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一),ZH-PT型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(徐州利華)。

1.3 永久性腦缺血模型制備

1.3.1 造模方法 參考Longa法[3]及前期實(shí)驗(yàn)研究[4]，通過(guò)阻閉大鼠大腦中動(dòng)脈(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)，造成永久的局灶性腦缺血。術(shù)前12 h停止供食不限水。用10%水合氯醛按0.35 ml/100 g體重標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射麻醉大鼠，術(shù)中動(dòng)物保持自主呼吸。頸部備皮，常規(guī)消毒后在頸正中切口，暴露大鼠的頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，先結(jié)扎頸總、頸外動(dòng)脈，再用微動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈分叉處血流，在其下方3～5 mm處剪一“V”型小口，將頭端過(guò)蠟的魚(yú)線送入血管，備活結(jié)以固定線栓，隨后松開(kāi)動(dòng)脈夾將魚(yú)線送入頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血流供應(yīng)。將活結(jié)扎死以固定線栓，消毒，縫合。假手術(shù)組大鼠不插入線栓，其余操作同模型組。

1.3.2 成模標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后24 h采用Longa標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行篩選，1～3分的MCAO大鼠納入本實(shí)驗(yàn)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：① 0分:正常，無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)；② 1分:提尾時(shí)偏癱側(cè)前肢屈曲；③ 2分:平地行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；④ 3分:向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈伴傾倒；⑤ 4分:意識(shí)障礙，不能自主行走。

1.4 各組干預(yù)方法

假手術(shù)組及模型組：術(shù)后回籠飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何治療，只給予同等條件抓取。

針刺組：術(shù)后24 h，采用頭穴叢刺針?lè)ㄖ委煛⒄涨捌趯?shí)驗(yàn)研究[4]，采用0.25 mm×25 mm針灸針，取百會(huì)穴及其左、右兩側(cè)各旁開(kāi)2 mm處的3個(gè)位置進(jìn)行針刺，由前向后刺入15 mm后快速捻轉(zhuǎn)1 min，留針2 h，每日1次。

康復(fù)組：術(shù)后24 h，采用循序漸進(jìn)的跑臺(tái)訓(xùn)練治療，方案如下：坡度：0°；速度：1～3天8 m/min,4～7天12 m/min,7天后15 m/min；時(shí)間：30 min/次。每日1次。

1.2.5 嚴(yán)格控制碘的攝入量 對(duì)于甲狀腺功能亢進(jìn)患者來(lái)說(shuō)，如果攝入碘過(guò)量會(huì)導(dǎo)致其臨床癥狀加重，不僅如此，碘攝入還會(huì)對(duì)采取131I治療患者的療效產(chǎn)生抑制作用。因此，護(hù)理人員要嚴(yán)格控制患者的碘攝入量，并指導(dǎo)患者掌握碘含量較高食物的識(shí)別方法，并介紹常見(jiàn)的碘含量較高的食物，如海帶、海魚(yú)、海蝦、海白菜、甘藍(lán)、海藻、卷白菜、昆布、大頭菜等。

針康組：術(shù)后24 h，采用針康法治療，即讓大鼠頭穴叢刺留針期間完成跑臺(tái)訓(xùn)練，每日1次。頭穴叢刺方案同針刺組，跑臺(tái)訓(xùn)練方案同康復(fù)組。

1.5 電鏡檢測(cè)

術(shù)后3天、7天、14天，各組大鼠干預(yù)結(jié)束后，用10%水合氯醛按0.5 ml/100 g體重深度麻醉，依次心內(nèi)灌注0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛各200 ml。對(duì)梗死周邊皮層缺血組織進(jìn)行定位，取1 mm×1 mm×1 mm組織塊置于3%戊二醛緩沖液和1%鋨酸后固定各1 h。脫水結(jié)束后，滲透包埋處理，半薄切片，轉(zhuǎn)移至光鏡下再定位，超薄切片，再分別入3%枸櫞酸鉛與0.1%醋酸鈉進(jìn)行雙重染色。透射電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.6 Western Blot檢測(cè)

術(shù)后3天、7天、14天，各組大鼠干預(yù)結(jié)束后，深度麻醉大鼠，置于冰面上快速斷頭取腦，分離大腦中動(dòng)脈梗死周邊皮層缺血組織，放入5 ml冷凍管中，液氮中速凍5 min后置于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

取一定量標(biāo)本，加入細(xì)胞裂解液處理后制成蛋白勻漿，經(jīng)低溫孵育后提取上清液。BCA法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)的總濃度，本實(shí)驗(yàn)上樣體積20 μl，含50 μg蛋白。用10% SDS-PAGE電泳分離目的蛋白(80 V,2.5 h), 然后將已分離的區(qū)帶電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(70 V,1.5 h)。置于TTBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉液內(nèi)室溫封閉1 h后，將膜放入已稀釋好的aFGF(1∶200)、PF4(1∶400)中，4℃過(guò)夜孵育。一抗孵育結(jié)束后，加入羊抗兔IgG-HRP二抗 (1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，之后加入ECL發(fā)光孵育5 min，顯影，凝膠成像儀上照相記錄后保存，用Gel-Pro Analyzer 4.0對(duì)圖中反應(yīng)條帶進(jìn)行相應(yīng)的定量分析。各組aFGF、PF4蛋白表達(dá)量記為aFGF、PF4與β-actin的灰度值比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組大鼠大腦皮層微血管豐富，排列緊密，管腔大小正常，內(nèi)皮細(xì)胞光滑無(wú)腫脹，基質(zhì)膜完整。術(shù)后3天，模型組血管周圍水腫嚴(yán)重，組織間隙增大，出現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖現(xiàn)象，同一視野下可見(jiàn)兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞核；與針刺組、康復(fù)組比較，針康組可見(jiàn)整個(gè)管腔內(nèi)充滿內(nèi)皮細(xì)胞，管周水腫程度減輕。術(shù)后7天，模型組缺血側(cè)皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞體積增大，基質(zhì)膜排列不齊，管周水腫程度加重；針康組內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，微血管內(nèi)膜平整，管腔無(wú)狹窄，而針刺組和康復(fù)組微血管內(nèi)膜較針康組欠平整，微血管管腔狹窄。術(shù)后14天，模型組缺血側(cè)皮層微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)回縮，基膜厚度增加，膜色加深，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管腔狹窄明顯或閉塞，管周仍有少量水腫；針康組缺血側(cè)大腦皮層微血管基膜已基本完整，內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)恢復(fù)正常；與針康組相比，針刺組、康復(fù)組微血管基膜稍呈不完整。具體見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦組織微血管內(nèi)皮的超微結(jié)構(gòu)注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：針刺組；D：康復(fù)組；E：針康組;a:術(shù)后3天(6000×)；b：術(shù)后7天(20500×)；c：術(shù)后14天(11500×)

2.2 各組大鼠腦組織aFGF蛋白的變化

各時(shí)間點(diǎn)，以假手術(shù)組aFGF蛋白表達(dá)情況作為標(biāo)準(zhǔn)參照，模型組aFGF蛋白表達(dá)明顯增加，差異顯著(均P<0.05)，伴隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，aFGF蛋白表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)趨勢(shì)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組及針康組aFGF蛋白表達(dá)增加，差異顯著(均P<0.05)。術(shù)后7天、14天，與針刺組、康復(fù)組比較，針康組aFGF蛋白表達(dá)增加，差異顯著(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)aFGF蛋白表達(dá)水平±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與針刺組比較，cP<0.05；與康復(fù)組比較，dP<0.05

2.3 各組大鼠腦組織PF4蛋白的變化

各時(shí)間點(diǎn)，以假手術(shù)組PF4蛋白表達(dá)情況作為標(biāo)準(zhǔn)參照，模型組PF4蛋白表達(dá)明顯增加，差異顯著(均P<0.05)，伴隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)；與模型組相比，針刺組、康復(fù)組及針康組PF4蛋白表達(dá)均減少，差異顯著(均P<0.05)。術(shù)后7天、14天，與針刺組、康復(fù)組比較，針康組PF4蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PF4蛋白表達(dá)水平±s)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與針刺組比較，cP<0.05；與康復(fù)組比較，dP<0.05

圖2 Western Blot檢測(cè)aFGF蛋白表達(dá)注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C:針刺組；D:康復(fù)組；E:針康組

圖3 Western Blot檢測(cè)PF4蛋白的表達(dá)注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C:針刺組；D:康復(fù)組；E:針康組

3 討論

針康法是腦卒中康復(fù)的新策略，是頭穴叢刺法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)的完美融合，具有“針康同步、動(dòng)態(tài)治療、整體康復(fù)”的特色。圍繞腦卒中后患者肌張力異常、平衡障礙、言語(yǔ)及認(rèn)知障礙等，課題組開(kāi)展了一系列研究，證實(shí)針康法明顯改善功能障礙，提高日常生活活動(dòng)能力，優(yōu)于單純頭穴叢刺或康復(fù)治療[5-9]?；A(chǔ)研究中，課題組從突觸形成和重建、神經(jīng)細(xì)胞再生、細(xì)胞凋亡、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等角度[10-14]，闡明了針康法降低腦缺血后神經(jīng)功能缺損的相關(guān)機(jī)制，但還有待于進(jìn)一步研究。

促血管因子及抑制血管因子之間動(dòng)態(tài)平衡的變化影響腦缺血后血管新生。促血管新生因子主要由VEGF及其受體、血管生成素及其受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)等組成。FGF屬于非特異性血管新生促進(jìn)因子，其成員包含酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (acidic fibroblast growth factor,aFGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等，它們既可以通過(guò)上調(diào)VEGF mRNA表達(dá)發(fā)揮間接的調(diào)節(jié)作用，又可直接作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，正性調(diào)控血管新生。既往研究顯示，腦缺血后1天即可檢測(cè)到aFGF在缺血半暗區(qū)皮層神經(jīng)元表達(dá)，在最初的2周內(nèi)表達(dá)量是不斷增加的[15]；而腦缺血后1天神經(jīng)元也存在bFGF陽(yáng)性表達(dá)，膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在2周內(nèi)也會(huì)不同程度表達(dá)bFGF蛋白[16-17]。腦內(nèi)注射外源性aFGF可明顯促進(jìn)MCAO大鼠缺血半暗區(qū)VEGF表達(dá)，使得微血管數(shù)量增多，神經(jīng)功能缺損情況得到改善[1]。

抑制血管生成因子具有抑制血管生成的作用，其作用途徑包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、微管形成、內(nèi)皮細(xì)胞遷移及胞外基質(zhì)重建等[18]。PF4是血小板特異性蛋白、一種內(nèi)源性血管新生抑制劑,它不僅參與很多人體重要的生理過(guò)程，如凝血、炎性趨化、免疫反應(yīng)及組織修復(fù)等，同時(shí)還涉及加重血管內(nèi)膜損傷病理過(guò)程[2]。PF4可與VEGF、FGF相互作用，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的肝素區(qū)域以減弱VEGF、bFGF的結(jié)合能力，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；且VEGF信號(hào)介導(dǎo)的PKC-MAP通路下游的水解酶——磷脂酶C2γ的酪氨酸化可被PF4干擾，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增生信號(hào)減弱[19-20]。另外，PF4可干擾基質(zhì)金屬蛋白酶[21]和整聯(lián)蛋白[22]所介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附及遷移過(guò)程，抑制血管新生。

前期研究發(fā)現(xiàn)，針康法可增加腦缺血大鼠缺血半暗區(qū)VEGF陽(yáng)性表達(dá)，上調(diào)bFGF蛋白表達(dá)，下調(diào)血管抑制素(AS)蛋白表達(dá)，改善缺損的神經(jīng)功能[4,23]。本研究結(jié)果顯示，針康法可改善缺血后血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組aFGF、PF4蛋白基礎(chǔ)表達(dá)和模型組aFGF、PF4蛋白均有不同程度上調(diào)，可能腦缺血后大量微血管缺血壞死，血管新生穩(wěn)態(tài)被打破，相關(guān)調(diào)控因子基礎(chǔ)值上調(diào)，與參與血管內(nèi)皮損傷過(guò)程有關(guān)；經(jīng)針刺、康復(fù)、針康治療后，血管新生朝著正性調(diào)控方向發(fā)展，aFGF蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，PF4蛋白表達(dá)有所下調(diào)，加速血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)。術(shù)后7天、14天，與針刺組和康復(fù)組比較，針康組的bFGF蛋白明顯升高，PF4蛋白明顯降低，表明針康法的正性調(diào)控作用比單一的針刺、康復(fù)訓(xùn)練更強(qiáng)，且這種優(yōu)勢(shì)在遠(yuǎn)期治療時(shí)更加明顯。

綜上,針康法能夠降低腦缺血大鼠缺血腦組織血管內(nèi)皮的損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)缺血腦組織血管再生促進(jìn)因子aFGF蛋白表達(dá)、下調(diào)血管抑制因子PF4蛋白表達(dá)、加快血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)相關(guān)。

[1] Cheng X,Wang Z,Yang J,et al.Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke[J].Neurological research,2011,33(7):675-680

[2] 王振義,李家增,阮長(zhǎng)耿,等.血栓與止血基礎(chǔ)理論與臨床[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2004

[3] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91

[4] 唐強(qiáng),姜云飛,朱路文,等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血區(qū)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子,血管抑制素蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(10):1151-1155

[5] 唐強(qiáng),朱冬梅,劉景隆,等.頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)治療急性腦梗死患者運(yùn)動(dòng)功能障礙的臨床觀察[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2004,10(11):697-698

[6] 張慧敏,唐強(qiáng),朱路文.針康法對(duì)腦卒中運(yùn)動(dòng)性失語(yǔ)患者抑郁的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):319-321

[7] 王艷,張立,李淑榮,等.頭穴叢刺結(jié)合認(rèn)知訓(xùn)練對(duì)腦梗死患者認(rèn)知功能障礙的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):316-318

[8] 邢艷麗,唐強(qiáng),魏鐵花.頭針結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療急性腦梗死[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2007,2(1):23-25

[9] 關(guān)瑩,張立,邢艷麗,等.針康法對(duì)腦卒中后痙攣狀態(tài)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):325-327

[10] 唐強(qiáng),朱路文,邢艷麗,等.針康法對(duì)腦缺血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及GAP-43,Nogo-A表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2015,31(1):54-57

[11] 唐強(qiáng),王宏宇,王艷,等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠運(yùn)動(dòng)功能及缺血區(qū)周圍內(nèi)皮素受體-β 表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2013,29(5):65-68

[12] 孔妍.針康法對(duì)腦缺血大鼠Caspase-3mRNA和蛋白表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2013,29(5):63-65

[13] 孫妲男,唐強(qiáng),鄭劍.針康法對(duì)糖尿病缺血性腦卒中大鼠外周血清NF-κB-p65,TNF-α表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2014,30(8):60-63

[14] 唐強(qiáng),劉宏光,王艷,等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠前肢運(yùn)動(dòng)功能及缺血區(qū)突觸素和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(10):973-976

[15] Hara Y,Tooyama I,Yasuhara O,et al.Acidic fibroblast growth factor-like immunoreactivity in rat brain following cerebral infarction[J].Brain research,1994,664(1):101-107

[16] Chen HH,Chien C-H,Liu HM.Correlation between angiogenesis and basic fibroblast growth factor expression in experimental brain infarct[J].Stroke,1994,25(8):1651-1657

[17] Lin TN,Te J,Lee M,et al.Induction of basic fibroblast growth factor (bFGF) expression following focal cerebral ischemia[J].Molecular brain research,1997,49(1):255-265

[18] 吳江雪,徐本玲,黃文林.血管生成抑制因子的研究進(jìn)展[J].癌癥,2005,24(3):376-384

[19] Soares AB,Demasi AP,Tincani AJ,et al.The increased PDGF-A,PDGF-B and FGF-2 expression in recurrence of salivary gland pleomorphic adenoma[J].Journal of clinical pathology,2012,65(3):272-277

[20] Perollet C,Han ZC,Savona C,et al.Platelet factor 4 modulates fibroblast growth factor 2 (FGF-2) activity and inhibits FGF-2 dimerization[J].Blood,1998,91(9):3289-3299

[21] Yu Y,Koike T,Kitajima S,et al.Temporal and quantitative analysis of expression of metalloproteinases (MMPs) and their endogenous inhibitors in atherosclerotic lesions[J].Histol Histopathol,2008,23(12):1503-1516

[22] Aidoudi S,Bujakowska K,Kieffer N,et al.The CXC-chemokine CXCL4 interacts with integrins implicated in angiogenesis[J].PLoS One,2008,3(7):e2657

[23] 朱路文,唐強(qiáng),李季,等.針康法對(duì)腦缺血大鼠腦組織VEGF,LN表達(dá)的影響[J].針灸臨床雜志,2015,31(10):71-74

Influence of Acupuncture-Rehabilitation Therapy on MicrovascularEndothelial Ultrastructure,Expression of aFGF andPF4 in Cerebral Ischemia Rats

CHEN Hui-jie1,TANG Qiang1,ZHU Lu-wen1，YE Tao2,LI Ji1,YAN Pei-yu2,WANG Yan1

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150001，China;2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China)

Objective：To investigate the influence of Acupuncture-Rehabilitation Therapy on microvascular endothelial ultrastructure and expression of acidic fibroblast growth factor (aFGF) and platelet factor-4 (PF4) in cerebral ischemia rats. Methods：Permanent focal cerebral ischemia was established in rats according to Longa methods. 180 rats were randomly divided into model group(group M), sham group(group C), acupuncture group(group A), rehabilitation group(group R) and acupuncture combined with rehabilitation group(group A-R). No treatment was given to group M and group C. Cluster needling of scalp acupuncture was given to group A. Treadmill training was used for group R. The combination therapy of acupuncture and treadmill training was used for group A-R. Ultrastructure of microvascular endothelial around penumbral cortex area, facilitated factor aFGF and inhibitory factor PF4 were observed and detected by electron microscopy at each time point by Western Blot method. Results：Microvessel endothelia ultrastructure：3 days after modeling, endotheliocytes were filled in lumen and edema around was relieved in group A, group R and group A-R, of which group A-R was better than the other two groups. 7 days after modeling, the proliferation of endotheliocytes was significant, microvascular endangium was smooth and no stricture developed in lumen in group A-R; Unsmooth microvascular endangium was found in the other two groups. 14 days after modeling, microvascular basement membrane was complete and endotheliocytes returned to almost normal in group A-R; Microvascular basement membrane was a bit incomplete both in group A and group R. Expression of revascularization facilitated factor aFGF and inhibitory factor PF4: At various time points, compared with group M, the expression of aFGF was all higher (P<0.05) and the expression of PF4 was all lower (P<0.05) in the three intervened groups. 7 days and 14 days after modeling, the expression of aFGF in group A-R was obviously higher (P<0.05) and the expression of PF4 protein was obviously lower (P<0.05) than those in group A and group R. Conclusion：Acupuncture-Rehabilitation Theray can reduce the vascular endothelial cell injury, which may be associated with the up-regulation of aFGF protein expression and down-regulation of PF4 protein expression.

Cerebral ischemia;Acupuncture-rehabilitation Therapy;Acidic fibroblast growth factor;Platelet factor-4;Angiogenesis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目,編號(hào)：81273818，81473762;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：2012RCL02。

陳慧杰(1982-),女，主治醫(yī)師，從事腦卒中康復(fù)工作。

△通訊作者：唐強(qiáng)(1963-),男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。

R246.6

A

1005-0779(2017)05-0065-05

2016-12-07