參附注射液對(duì)慢性心衰大鼠心功能及心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響*

李石清宋潔，2張春椿張水利張婷#許健

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 復(fù)旦大學(xué) 上海 200433

實(shí)驗(yàn)研究

參附注射液對(duì)慢性心衰大鼠心功能及心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響*

李石清1宋潔1，2張春椿1張水利1張婷1#許健1

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

2 復(fù)旦大學(xué) 上海 200433

參附注射液 慢性心衰 鈣離子 心功能 實(shí)驗(yàn)研究

本實(shí)驗(yàn)主要研究參附注射液對(duì)慢性心衰大鼠心功能及心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，探討參附注射液改善心衰的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料：雄性SD大鼠30只，體重200±20g[寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物批號(hào)：SVXK(寧)2011-0001]；參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20043117，批號(hào)：140106050）；0.9%氯化鈉注射液（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院）；Ca2+熒光試劑Fluo-3/ AM、咖啡因（Sigma，美國(guó)）；II型膠原酶（Worthington，美國(guó)）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器：ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司），UC-6超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），1/10000精密電子分析天平、Delta 320-S型PH計(jì)（Mettler Toledo公司），JB-90-1型磁力攪拌器（上海天平儀器廠），H-7650透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司），Acuson sequoia 512高頻超聲診斷儀（德國(guó)西門子公司），LeicaTCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司），HL-2型恒流泵（上海滬西分析儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 慢性心衰大鼠模型制備及分組：采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠慢性心衰模型[1]。成年雄性SD大鼠采用氣體麻醉機(jī)麻醉，沿胸骨左緣第3、4肋間開(kāi)胸，暴露心臟打開(kāi)心包，在左心耳和肺動(dòng)脈圓錐之間用5/0無(wú)損傷縫合針結(jié)扎左冠脈前降支，進(jìn)針深度控制在0.1cm，注意避免心肌撕裂。肉眼可見(jiàn)左心室前壁顏色變白，標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高，即為結(jié)扎成功，立即將心臟送回胸腔，排盡胸腔空氣，再對(duì)胸腔逐層縫合，閉合胸腔，自然清醒后飼養(yǎng)。將造模成功大鼠隨機(jī)分為心力衰竭組（CHF）和參附注射液（SFI）處理組，每組10只。另設(shè)假手術(shù)組（Sham組），10只，除只穿線不結(jié)扎冠脈外，其余步驟一致。參附注射液處理組用6ml/kg參附注射液腹腔注射給藥，假手術(shù)組和心力衰竭組給予同等劑量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 超聲心動(dòng)指標(biāo)測(cè)定：采用Acuson sequoia 512高頻超聲診斷儀，探頭頻率8.5MHZ，掃描速度100mm/s。氣體麻醉機(jī)麻醉大鼠，連續(xù)測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期的左室前壁舒張末期厚度（LVAWd）、左室前壁收縮末期厚度（LVAWs）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、左室后壁收縮末期厚度（LVPWs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），取其平均值。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察：按照常規(guī)透射電鏡樣品制備技術(shù)制樣[2]，取心臟部分心肌組織，經(jīng)前固定、漂洗、后固定、脫水、浸透、包埋、修片、切片及染色后，置于透射電子顯微鏡下觀察，拍照記錄其超微結(jié)構(gòu)。

2.4 單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離：采用標(biāo)準(zhǔn)酶解分離技術(shù)得到心力衰竭組和假手術(shù)組單個(gè)心室肌細(xì)胞[3]，雄性SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，迅速開(kāi)胸取出心臟掛于Langendorff逆行性灌流系統(tǒng)，游離主動(dòng)脈行主動(dòng)脈插管，分別用無(wú)鈣臺(tái)式液和含72mmol/L Ca2+、0.6mg/mlⅡ型膠原酶和2mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)的臺(tái)式液逆向灌流，消化終點(diǎn)以心臟變軟等現(xiàn)象為標(biāo)準(zhǔn)；剪下心室組織，在37℃Kraft-Bruhe（KB）液中將其剪碎，并用廣口吸管吹打1min，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，室溫沉淀10min，棄上清液，KB液重懸，室溫靜置1～2h后備用。

2.5 熒光染色及分組給藥：將靜置后的心肌單細(xì)胞先與鈣熒光指示劑Fluo-3/AM(10μmol/L)室溫避光孵育30min，然后用KB液漂洗3次，每次10min。室溫放置30min后置于含細(xì)胞外液的細(xì)胞池中，胞外灌流10min。參附注射液（SFI）隨胞外灌流液作用于心肌細(xì)胞，分別按0、1.25%SFI、2.5%SFI、5%SFI和10%SFI與細(xì)胞外液混合，每組重復(fù)6次。

2.6 大鼠心肌細(xì)胞鈣釋放峰值實(shí)驗(yàn)：采用Leica TCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)光采用5%的低能量，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)505nm。掃描頻率為400Hz，每條線包含1024個(gè)像素，采樣速率為2ms/線。物鏡為40倍油鏡，數(shù)值孔徑值（NA）為1.25。選擇合適的心肌細(xì)胞（橫紋清晰，桿狀，表面干凈平整，無(wú)自發(fā)收縮等），掃描線與細(xì)胞縱軸平行且位于垂直切面中間，掃描5秒后，給予咖啡因刺激測(cè)得肌漿網(wǎng)（SR）內(nèi)可釋放的鈣容量。圖像處理采用自編的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像處理軟件。鈣瞬變（ACT）的強(qiáng)弱以標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度的凈變化即#F/F0=(F-F0)/F0表示，其中F表示某一時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0表示本底熒光強(qiáng)度[4]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 心衰模型相關(guān)心功能指標(biāo)的測(cè)定：雄性成年SD大鼠行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)后，肉眼可見(jiàn)左心室前壁顏色變白，標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖顯示術(shù)后心電圖ST段抬高，造模成功。4周后，高頻超聲診斷儀測(cè)定心功能相關(guān)指標(biāo)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠心功能指標(biāo)的測(cè)定（±s，n=10）

注：與Sham組比較，**P＜0.01；與CHF組比較，##P＜0.01。

組別Sham組CHF組SFI組LVAWd(mm) 1.98±0.24 1.48±0.24**1.89±0.19##LVAWs(mm) 3.41±0.39 2.00±0.29**2.72±0.37##LVPWd(mm) 2.01±0.29 1.70±0.19**1.95±0.21##LVPWs(mm) 3.56±0.35 2.25±0.39**2.81±0.20##LVIDd(mm) 7.34±0.40 9.20±0.65**4.89±0.72##LVIDs(mm) 3.80±0.25 6.70±0.78**4.89±0.72##LVFS(%) 84.13±0.94 57.75±7.11**72.93±1.07##LVEF(%) 48.11±1.07 27.12±4.45**37.48±0.86##

3.2 參附注射液對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響：各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，Sham組大鼠心肌肌纖維整齊排列，肌絲之間的線粒體結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部嵴清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)腫脹或破裂（圖1a）。CHF組大鼠心肌出現(xiàn)大面積肌絲溶解、斷裂、松散，大部分肌絲排列疏松并且有出現(xiàn)錯(cuò)位，線粒體電子密度增大，一部分線粒體的嵴結(jié)構(gòu)模糊不清，且出現(xiàn)溶解現(xiàn)象（圖1b）。SFI組大鼠心肌肌絲結(jié)構(gòu)排列整齊，可見(jiàn)輕度溶解，線粒體結(jié)構(gòu)完整，大部分嵴結(jié)構(gòu)完整可見(jiàn)（圖1c）。

3.3 單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離：本實(shí)驗(yàn)中，剛分離下的心肌細(xì)胞存活率達(dá)80%左右，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，Z線清晰，橫紋分明。見(jiàn)圖2。

3.4 參附注射液對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響：靜息狀態(tài)下肌漿網(wǎng)（SR）內(nèi)鈣容量可通過(guò)咖啡因誘發(fā)的鈣瞬變（CCT）來(lái)衡量[3]。心肌細(xì)胞經(jīng)Fluo-3/AM孵育處理，以噴射咖啡因前作為本底熒光對(duì)照，采用激光掃描共聚焦顯微鏡線掃描模式記錄單個(gè)心肌細(xì)胞SR內(nèi)的鈣容量。重復(fù)6次取平均值，得到表2。結(jié)果顯示，CHF組較Sham組熒光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度變化的平均值（ΔF/F0）均明顯降低（P＜0.01）（圖3b）。SFI組各濃度處理后的CHF大鼠與不處理（0 SFI組）相比，大鼠心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及平均值（ΔF/F0）均顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），且呈濃度依賴性（圖3b）；但5%和10%SFI處理組間未見(jiàn)顯著差異（圖3b）。Sham組大鼠心肌細(xì)胞給予不同濃度的SFI（1.25%，2.5%，5%，10%）處理后，熒光強(qiáng)度隨濃度增加而增大（P＜0.05），5%與10%濃度SFI處理組間未見(jiàn)顯著差異（圖3a）。圖3c顯示，不同濃度SFI處理CHF組后，熒光強(qiáng)度變化的整體趨勢(shì)均低于SFI相應(yīng)濃度處理后的假手術(shù)組。這些結(jié)果表明，參附注射液可增大心肌細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣容量。

圖1 參附注射液對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響（bar=500nm）

圖2 分離得到的單個(gè)心室肌細(xì)胞（bar=20μm）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞鈣釋放含量的測(cè)定（±s，n=6）

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞鈣釋放含量的測(cè)定（±s，n=6）

注：與Sham組0 SFI處理后比較，**P＜0.01；與CHF組0 SFI處理后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組Sham組CHF組正常細(xì)胞外液+參附注射液處理10%SFI 33.40±2.73**7.73±0.86##0 SFI 12.60±2.31 2.28±0.59 1.25%SFI 18.55±1.86**4.89±0.18#2.5%SFI 24.18±1.53**5.23±0.23#5%SFI 31.10±1.27**7.02±0.57##

圖3 參附注射液對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

4 討論

心力衰竭（簡(jiǎn)稱心衰）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，主要是由于神經(jīng)-體液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)改變等多因素導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，導(dǎo)致心臟射血或舒張功能障礙，從而產(chǎn)生以活動(dòng)耐量受限、肺瘀血以及外周水腫為主要臨床表現(xiàn)的一系列病理生理改變[5-6]。參附注射液由紅參和附子兩味藥構(gòu)成，源自《濟(jì)生方》中的參附湯。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人參益氣固脫、大補(bǔ)元?dú)?，附子回?yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)。靜脈滴注參附注射液，有益氣活血、回陽(yáng)救脫、強(qiáng)心生脈之效[7]。現(xiàn)代藥理研究表明，人參與附子均具有強(qiáng)心和抗心肌缺血的藥理作用。

本實(shí)驗(yàn)采用氣體麻醉對(duì)大鼠行左前降支結(jié)扎術(shù)建立大鼠心力衰竭模型，無(wú)需開(kāi)胸、插管，手術(shù)快、創(chuàng)口小、動(dòng)物出血少，避免了氣管插管對(duì)呼吸道的損傷，減少手術(shù)創(chuàng)傷，提高了模型的存活率，本模型是低心輸出量型心衰模型[1]，經(jīng)歷了從心肌梗死、代償性心肌肥厚到心衰等過(guò)程，較好地模擬了充血性心力衰竭的生理病理演變過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)較假手術(shù)組發(fā)生明顯改變，肌絲排列錯(cuò)位紊亂或斷裂溶解，線粒體聚集或無(wú)規(guī)律零散分布，線粒體發(fā)生腫脹、融合、嵴消失或變短，在線粒體周邊可見(jiàn)較多糖原聚集，提示存在心肌細(xì)胞代謝及能量利用障礙。而參附注射液（6ml/kg）按腹腔給藥，每日1次，持續(xù)4周，透射電鏡結(jié)果顯示其可明顯改善心力衰竭大鼠的上述癥狀，提示心肌細(xì)胞能量代謝功能改善，可為心肌細(xì)胞收縮提供ATP[2，4]，這很可能是其整體心臟功能改善的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另一方面，參附注射液處理后的心衰大鼠心功能指標(biāo)與心衰組相比有明顯改善，LVPWd/LVPWs，LVAWd/LVAWs，LVIDd/LVIDs均明顯減小，而LVEF、LVFS則明顯增大，這一結(jié)果顯示了參附注射液可以有效減輕代償性心肌肥大，從而恢復(fù)和改善慢性心衰大鼠的心臟舒張收縮功能。大鼠心肌細(xì)胞鈣釋放峰值實(shí)驗(yàn)顯示，心力衰竭組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)咖啡因觸發(fā)熒光強(qiáng)度的峰值明顯低于假手術(shù)組，說(shuō)明心力衰竭組大鼠肌漿網(wǎng)鈣儲(chǔ)量明顯降低，導(dǎo)致收縮期鈣釋放減小，影響心肌的收縮力。經(jīng)一定濃度（1.25%、2.5%、5%、10%）的參附注射液處理后，發(fā)現(xiàn)咖啡因觸發(fā)的鈣釋放熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且呈濃度依賴性，提示參附注射液可能改善心衰心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)鈣儲(chǔ)量，增加收縮期鈣瞬變的幅度，從而增強(qiáng)心肌收縮力，有助于心衰大鼠心功能的恢復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從整體動(dòng)物、細(xì)胞以及超微結(jié)構(gòu)等水平都證實(shí)了參附注射液可以改善心力衰竭大鼠的心功能，其機(jī)制可能是增加肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量，減少心衰時(shí)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷，從而達(dá)到改善心衰、保護(hù)心臟的作用。本研究結(jié)果為參附注射液用于臨床治療心力衰竭提供了新的理論依據(jù)。

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2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目基于心肌保護(hù)蛋白及離子通道的參附藥對(duì)“扶陽(yáng)固脫”改善心衰的配伍機(jī)制研究，編號(hào)：81373991

#通訊作者：張婷，E-mail：elaine.zt@gmail.com