氯化鋰對激素性股骨頭壞死大鼠股骨頭微觀結(jié)構(gòu)的影響

李云矗，孫平，徐剛，徐成福

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院)

氯化鋰對激素性股骨頭壞死大鼠股骨頭微觀結(jié)構(gòu)的影響

李云矗1，孫平1，徐剛2，徐成福2

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院)

目的 探討氯化鋰對激素性股骨頭壞死(S-ONFH)大鼠股骨頭微觀結(jié)構(gòu)的影響及意義。方法 將30只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、氯化鋰組，每組10只。氯化鋰組和模型組采用大腸桿菌內(nèi)毒素聯(lián)合大劑量激素沖擊法建立S-ONFH模型，末次注射激素24 h，氯化鋰組給予氯化鋰140 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)8周。模型組和空白對照組均給予等量生理鹽水灌胃。各組灌胃8周處死，取右側(cè)股骨頭行HE染色，觀察股骨頭組織病理學(xué)改變及股骨頭壞死發(fā)生情況；取左側(cè)股骨頭進(jìn)行顯微CT檢查，記錄骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。結(jié)果 HE染色顯示，空白對照組骨小梁完整，排列規(guī)則，骨陷窩內(nèi)有骨細(xì)胞填充；模型組骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂并有狹窄或斷裂，廣泛存在以空骨陷窩為標(biāo)志的壞死骨；氯化鋰組骨小梁形態(tài)較好，未見明顯狹窄或斷裂，存在空骨陷窩，但數(shù)量較模型組少。空白對照組、模型組、氯化鋰組分別有0、8、3只出現(xiàn)股骨頭壞死，組間兩兩比較P均<0.05。與空白對照組比較，模型組和氯化鋰組Tb.N、Tb.Th均降低，Tb.Sp均增高，但模型組變化更明顯(P均<0.05)。模型組BMD、BV/TV均低于空白對照組和氯化鋰組(P均<0.05)。結(jié)論 氯化鋰灌胃可改善S-ONFH大鼠股骨頭微觀結(jié)構(gòu)，對股骨頭具有一定保護(hù)作用。

激素性股骨頭壞死；氯化鋰；骨量；骨微觀結(jié)構(gòu)；大鼠

激素性股骨頭壞死(S-ONFH)是由于長期應(yīng)用激素類藥物而導(dǎo)致的、以股骨頭塌陷為特征的代謝性疾病，是臨床公認(rèn)的難治性骨科疾病[1，2]。研究證實，骨細(xì)胞活性改變在S-ONFH的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。破骨細(xì)胞分化和活性升高可提高骨吸收速率；而成骨細(xì)胞分化障礙及其脂肪變或活性降低則使骨形成受到抑制，隨后出現(xiàn)骨吸收與骨形成失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)成分缺失和修復(fù)障礙[3,4]。臨床上針對S-ONFH的治療原則是抑制破骨細(xì)胞增殖及骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[5]。研究發(fā)現(xiàn)，鋰鹽在增強(qiáng)成骨代謝的同時還可抑制破骨代謝[6]。但目前氯化鋰預(yù)防及治療S-ONFH的基礎(chǔ)及臨床研究報道均較少。為此，我們于2016年2～9月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：清潔級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±30)g，許可證號：SCXK(黑)20013001，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；于牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)館模型室按照標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度22～26 ℃，相對濕度37%～42%，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h，光照強(qiáng)度150～200 Lx、每12 h晝夜交替，噪音<50 dB；自由攝食飲水，每籠5只。主要試劑：大腸桿菌內(nèi)毒素(L2880，美國Sigma公司)，注射用甲潑尼松龍琥珀酸鈉(A07056，美國Pfizer公司)，氯化鋰(746460-100G，美國Sigma公司)，水合氯醛(H37022673，上海山浦化工有限公司)，伊紅試劑、蘇木素試劑(C-0021，北京博奧森生物技術(shù)有限公司) 。主要儀器：顯微CT(Micro CT，瑞士SCANCO公司)，切片機(jī)(HM315，德國美康公司)，光學(xué)顯微鏡(80i，日本Nikon公司)，數(shù)碼照相機(jī)(D7100，日本Nikon公司)。

1.2 建模與分組處理 將30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、氯化鋰組，每組10只。氯化鋰組和模型組參照董玉雷等[7]的方法建立S-ONFH模型，方法如下：大腸桿菌內(nèi)毒素20 μg/kg腹腔注射2次，間隔24 h；末次注射內(nèi)毒素24 h，給予甲潑尼龍琥珀酸鈉40 mg/kg臀肌注射3次，每次間隔24 h?？瞻讓φ战M僅注射等量生理鹽水。末次注射甲潑尼龍琥珀酸鈉24 h，氯化鋰組參照牛銀波等[8]的方法給予氯化鋰140 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)8周。模型組和空白對照組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 氯化鋰對S-ONFH大鼠股骨頭影響的觀察

1.3.1 一般情況 觀察各組建模及處理過程中的精神狀態(tài)、活動、飲食、存活等情況。

1.3.2 股骨頭大體情況 各組處理8周，腹腔注射過量水合氯醛，頸椎脫臼處死。取出左、右兩側(cè)股骨，肉眼觀察股骨頭外觀、色澤及關(guān)節(jié)面軟骨情況。

1.3.3 股骨頭組織病理學(xué)改變 將各組右側(cè)股骨頭置于多聚甲醛溶液固定72 h，置于10% EDTA-Tris緩沖液中脫鈣，待脫鈣完全后，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚切片。常規(guī)進(jìn)行HE染色，由牡丹江醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室協(xié)助完成，由2位病理科醫(yī)師獨立采用盲法觀察組織病理學(xué)改變。股骨頭壞死標(biāo)準(zhǔn)參照Ikemura等[1]的方法，即出現(xiàn)骨髓細(xì)胞碎片、骨小梁空骨陷窩或骨小梁內(nèi)骨細(xì)胞核固縮，并伴隨周圍骨髓細(xì)胞的壞死則定義為股骨頭壞死。記錄各組股骨頭壞死的發(fā)生情況。

1.3.4 股骨頭微觀結(jié)構(gòu) 采用Micro CT檢查。將各組左側(cè)股骨頭標(biāo)本置于多聚甲醛溶液固定，送往杭州越波生物科技有限公司進(jìn)行Micro CT檢查。選擇20 μm數(shù)量級進(jìn)行薄層掃描，掃描電壓為80 kV，電流為160 μA，全掃描過程均在多聚甲醛溶液固定下完成。掃描結(jié)束后，使用Micro View2.2軟件對整個股骨頭圖像進(jìn)行三維重建，對比觀察各組的三維重建圖。手工選取股骨頭內(nèi)直徑為2 mm、高1.48 mm的圓柱體作為感興趣區(qū)域(ROI)，分析該選定區(qū)域的骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各組均存活，空白對照組建模及處理過程中精神狀態(tài)、活動、飲食均無明顯變化。氯化鋰組和模型組注射大腸桿菌內(nèi)毒素第1、2天出現(xiàn)寒顫、蜷縮，飲食、活動均減少，精神狀態(tài)較差；注射甲潑尼龍琥珀酸鈉1周后，活動、飲食恢復(fù)正常，四肢負(fù)重未見明顯異常。氯化鋰組和模型組處理8周末均出現(xiàn)輕度跛行，以模型組較為明顯。

2.2 股骨頭大體情況 空白對照組股骨頭直徑約2 mm，呈圓形，顏色均一、呈淡紅色，表面覆蓋一層光滑軟骨。氯化鋰組和模型組股骨頭可見片狀軟骨下壞死，軟骨變薄，顏色呈暗紅色，以模型組較為明顯。

2.3 股骨頭組織病理學(xué)改變 HE染色顯示，空白組骨小梁完整，排列規(guī)則，骨陷窩內(nèi)有骨細(xì)胞填充；模型組骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂并有狹窄或斷裂，廣泛存在以空骨陷窩為標(biāo)志的壞死骨；氯化鋰組骨小梁形態(tài)較好，未見明顯狹窄或斷裂，存在空骨陷窩，但數(shù)量較模型組少。空白對照組、模型組、氯化鋰組分別有0、8(80%)、3(30%)只出現(xiàn)股骨頭壞死，組間兩兩比較P均<0.05。

2.4 股骨頭微觀結(jié)構(gòu) Micro CT三維重建圖：空白對照組骨小梁粗厚，清晰可見，排列規(guī)則、緊密，股骨頭表面光滑、無塌陷；模型組骨小梁變細(xì)，排列混亂、稀疏，骨小梁間距增大，并出現(xiàn)大量的骨小梁微骨折，股骨頭表面毛糙不平、塌陷面積較大；氯化鋰組骨小梁較細(xì)，排列部分混亂，骨小梁間距較小，部分骨小梁出現(xiàn)微骨折，股骨頭表面塌陷面積較小。股骨頭微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)：與空白對照組比較，模型組和氯化鋰組Tb.N、Tb.Th均降低，Tb.Sp均增高，但模型組變化更明顯(P均<0.05)。模型組BMD、BV/TV均低于空白對照組和氯化鋰組(P均<0.05)，空白對照組和氯化鋰組BMD、BV/TV比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組股骨頭微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

骨代謝是指骨不斷進(jìn)行的重建過程，骨重建過程包括破骨細(xì)胞黏附在舊骨區(qū)域并消化骨基質(zhì)、溶解礦物質(zhì)形成骨吸收陷窩；同時成骨細(xì)胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化形成新骨[9]。在正常情況下，骨的吸收和形成處于動態(tài)平衡，骨重建過程不會造成骨量及BMD改變，更不會引起骨壞死。而在股骨頭壞死狀態(tài)下，股骨頭骨代謝的改變造成骨吸收加速、新骨形成減慢，從而導(dǎo)致股骨頭局部發(fā)生骨質(zhì)疏松，誘發(fā)骨壞死，在持續(xù)應(yīng)力作用下造成股骨頭骨小梁發(fā)生斷裂，最終引起股骨頭塌陷[10]。

研究表明，鋰鹽對骨代謝有積極的影響。鋰鹽通過抑制糖原合成激酶3β的活性，激活經(jīng)典Wnt信號通絡(luò)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，從而增強(qiáng)骨組織的成骨代謝[11]；還可以通過抑制破骨細(xì)胞RANKL基因的表達(dá)而降低破骨細(xì)胞增殖、分化，抑制破骨代謝[12]。近年研究顯示，鋰鹽可以促進(jìn)小鼠骨形成[13]、改善骨質(zhì)疏松[14]，增加大鼠BMD[15]，為鋰鹽治療骨壞死提供了良好的理論基礎(chǔ)。目前評價骨微觀結(jié)構(gòu)最好的方法是Micro CT掃描，已受到越來越多研究者的青睞，并將其成功應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松動物模型骨微觀結(jié)構(gòu)的觀察。Micro CT可清楚顯示骨小梁微觀結(jié)構(gòu)，同時結(jié)合軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)計量學(xué)分析。骨組織形態(tài)計量學(xué)可直觀反映骨組織的三維參數(shù)。BMD是評價骨皮質(zhì)厚度、骨小梁結(jié)構(gòu)和骨量的重要指標(biāo)，也是衡量骨丟失程度的指標(biāo)之一[16]。BV/TV、Tb.Sp、Tb.N及Tb.Th均可反映骨組織結(jié)構(gòu)的完整性。BV/TV是骨小梁體積占骨組織體積的百分比，反映骨量變化。Tb.N和Tb.Th用于描述骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)，也可反映骨量變化。Tb.Sp是指骨小梁之間的平均距離，用來反映骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)，Tb.Sp越大表明骨小梁之間的距離越大，骨的結(jié)構(gòu)越差，力學(xué)強(qiáng)度越小。

本研究以成年SD大鼠作為研究對象，通過大腸桿菌內(nèi)毒素聯(lián)合大劑量激素沖擊建立S-ONFH模型，方法與董玉雷等[7]、童培建等[17]報道相同；并參照沈興潮等[18]的方法，采用Micro CT評價S-ONFH動物模型的股骨頭微觀結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均降低，Tb.Sp升高，結(jié)合模型組股骨頭大體情況以及組織病理學(xué)改變，說明成功建立S-ONFH模型。本研究氯化鋰組BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th較模型組增高，Tb.Sp較模型組降低；股骨頭大體情況觀察顯示，氯化鋰組和模型組股骨頭均可見片狀軟骨下壞死，軟骨變薄，顏色呈暗紅色，以模型組較為明顯；組織病理學(xué)觀察顯示，氯化鋰組骨小梁形態(tài)較好，未見明顯狹窄或斷裂，存在空骨陷窩，但數(shù)量較模型組少。以上均說明，氯化鋰可明顯改善S-ONFH大鼠股骨頭的微觀結(jié)構(gòu)，在骨壞死修復(fù)過程中使骨小梁數(shù)量、形態(tài)等均趨近正常，同時又能明顯提高BMD，具有預(yù)防或延緩S-ONFH的作用。分析原因，可能是氯化鋰一方面可抑制破骨代謝，保持骨小梁不被破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收所破壞，另一方面可以有效促進(jìn)壞死區(qū)成骨代謝，促進(jìn)股骨頭壞死區(qū)的修復(fù)。

綜上所述，氯化鋰可改善S-ONFH大鼠股骨頭的微觀結(jié)構(gòu)，對股骨頭壞死的發(fā)生具有一定預(yù)防作用。本研究只設(shè)定了單個觀察時間點和單個給藥劑量，在后續(xù)的研究中將進(jìn)行多個時間點和多個給藥劑量的動態(tài)觀察，以探討給藥時間和給藥劑量對氯化鋰預(yù)防S-ONFH作用的影響。結(jié)合組織學(xué)、生物化學(xué)和基因?qū)W等檢測手段探討氯化鋰預(yù)防S-ONFH的作用機(jī)制是未來研究的方向。

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山東衛(wèi)生報刊社

Effects of lithium chloride on microstructure of femoral head in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

LIYunchu1,SUNPing,XUGang,XUChengfu

(1MudanjiangMedicalUniversity,Mudanjiang157011,China)

Objective To investigate the effect of lithium chloride on microstructure of femoral head in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (S-ONFH) and its significance. Methods Thirty SD rats were randomly divided into the blank control group, model group and lithium chloride group, with 10 rats in each group. In the lithium chloride group and model group, we used escherichia coli endotoxin combined with large dose of steroid shock to make the rat models of the S-ONFH. At 24 h after the last injection of steroid, rats in the lithium chloride group were given lithium chloride (140 mg/kg) by gavage, 1 time per day for 8 weeks. Rats in the model group and the blank group were given equal amount of normal saline. Rats were sacrificed and HE staining was performed on the right femoral head. Histopathological changes and necrosis of the femoral head were observed. The left femoral head was used for micro CT examination, and each bone mineral density (BMD), bone volume fraction (BV/TV), trabecular space (Tb.Sp), trabecular bone number (Tb.N), trabecular bone thickness (Tb.Th) were recorded. Results HE staining showed that the trabecular bone in the blank group was complete and regularly arranged, and the bone lacunae were filled with bone cells; the trabecular bone in the model group was disorder, narrow, and fractured, and the marked necrosis of bone widely existed in the empty bone lacunae; the trabecular bone shape in the lithium chloride group was better without obvious stenosis or fracture. However, there were empty bone lacuna in the lithium chloride group which was less than that in the model group. In the blank control group, model group and lithium chloride group, 0, 8 (80%) and 3 (30%) rats with femoral head necrosis were found, respectively (allP<0.05). Compared with the blank control group, the Tb.N and Tb.Th of the model group and the lithium chloride group were all decreased, Tb.Sp was increased, but these in the model group expressed more significantly (allP<0.05), the BMD and BV/TV in the model group was lower than that of the the blank control group and lithium chloride group (allP<0.05). Conclusion Lithium chloride can increase the bone mass of S-ONFH rat femoral head and improve its microstructure, and it has a protective effect on the femoral head.

steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (S-ONFH); lithium chloride; bone mass; bone microstructure; rats

牡丹江醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新科研項目(2014YJSCX-12)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(ZSSD201623)。

李云矗(1991-)，男，碩士研究生在讀，研究方向為激素性股骨頭壞死的預(yù)防與治療。E-mail: 664159525@qq.com

孫平(1973-)，女，副教授，研究方向為炎癥與腫瘤的關(guān)系。E-mail: spmy73@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.005

R681.8

A

1002-266X(2017)16-0016-04

2016-11-02)