綠豆遺傳圖譜構(gòu)建研究進展

劉晨旦，張澤燕，張耀文

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

綠豆遺傳圖譜構(gòu)建研究進展

劉晨旦1，張澤燕2，張耀文2

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

綠豆（Vigna radiata L.）是我國傳統(tǒng)出口商品，具有重要的醫(yī)用及食用價值。與玉米、小麥等大宗作物相比，綠豆的遺傳研究在分子標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建等方面進展緩慢，其品種改良及種質(zhì)資源利用僅局限于常規(guī)育種手段。分別從綠豆的育種、分子遺傳研究、基于綠豆遺傳連鎖圖的綠豆抗豆象研究以及抗旱研究等方面進行了綜述，希望對促進國內(nèi)綠豆的遺傳研究以及育種進程有所裨益。

綠豆；遺傳圖譜；研究進展

綠豆（Vigna radiata L.）屬于豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna），染色體組為2n＝22[1]。綠豆中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的醫(yī)用及食用價值。

我國是綠豆起源地之一，擁有類型多樣的綠豆品種資源。綠豆具有生育期短、適應(yīng)性廣、固氮能力好等優(yōu)點，是我國重要的糧食經(jīng)濟作物；同時，又是重要的營養(yǎng)保健食品。綠豆可加工成豆芽、粉絲、粉皮、綠豆糕等多種多樣的食品，在國內(nèi)外市場備受青睞，社會經(jīng)濟價值十分重要。目前，國內(nèi)外對綠豆的各項研究僅處于常規(guī)育種、新品種選育等階段，在分子水平上的遺傳研究還比較滯后，僅有5張綠豆的遺傳圖譜。

1 綠豆育種研究進展

綠豆種質(zhì)資源的保存與利用是各項研究的物質(zhì)基礎(chǔ)。到目前為止，國內(nèi)外收集有3萬份的綠豆種質(zhì)資源[2]。

從1978年起，綠豆種質(zhì)資源研究正式列入國家課題，并開展了一系列的相關(guān)研究。目前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所已開始對核心樣本進行農(nóng)藝性狀的精準(zhǔn)鑒定，并對一些重要品質(zhì)性狀如蛋白、淀粉含量等進行測試及DNA分子標(biāo)記分析，以期為綠豆的育種及遺傳研究等提供豐富的信息[3]。

近幾十年來，綠豆新品種選育的進程相對緩慢，但綠豆的各個主要生產(chǎn)國都取得了一定的成效。近年來，我國綠豆的品種選育工作進展迅速，對我國綠豆的產(chǎn)業(yè)發(fā)展起到了推進作用。

遺傳誘變作為一項現(xiàn)代育種新技術(shù)，已成為創(chuàng)造新種質(zhì)的重要方法。綠豆是自花授粉作物，且人工雜交率低，而遺傳誘變是獲得特異基因型的有效方法之一。我國學(xué)者早在1996年就對綠豆進行了衛(wèi)星搭載空間誘變研究，并獲得了一些穩(wěn)定的綠豆變異品系，表明空間誘變可能為綠豆遺傳育種開辟新的途徑[4]。我國科研人員利用γ射線誘變成功培育了晉綠豆2號，該品種適應(yīng)性廣，產(chǎn)量高，深受廣大種植戶歡迎[5]。

在分子育種方面，與大宗作物相比，綠豆分子育種進程緩慢。抗豆象基因已被發(fā)掘及定位，有助于抗豆象品種的選育；但抗旱基因仍無進展。希望可以加快綠豆的育種進程以及遺傳研究，為分子標(biāo)記輔助育種提供可能。

2 綠豆分子遺傳研究進展

隨著綠豆分子遺傳研究工作的開展，有5張遺傳連鎖圖譜已被發(fā)布，但綠豆全染色體連鎖群的圖譜未尚發(fā)布。而作為豇豆屬的小豆、豌豆全基因組測序已經(jīng)完成，豇豆屬中的分子標(biāo)記具有通用性，為綠豆遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建與發(fā)展提供全新思路。

2.1 綠豆的基因組結(jié)構(gòu)特點

綠豆（2n＝2x＝22）是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna）植物的一個種，英文名為mungbean。綠豆的基因組較小，約為0.60 pg/IC（579 Mbp）[6]。綠豆基因組的結(jié)構(gòu)屬于真核生物基因組基本結(jié)構(gòu)模式中的中間類型，基因組不大，重復(fù)順序部分所占比例也較小，約占35%。但它的結(jié)構(gòu)形式是多樣的，幾乎包括了從典型的短周期鑲嵌型（較短單拷貝順序和較短重復(fù)順序構(gòu)成相嵌單位）到典型的長周期鑲嵌型（DNA重復(fù)順序和單拷貝順序都以很長的區(qū)段存在并相連接）之間的一切中間形式，呈現(xiàn)一種在2種基本基因組模式間連續(xù)分布的狀態(tài)[7]。

2.2 綠豆的分子遺傳作圖

2.2.1 已構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖譜綠豆分子遺傳研究的重要環(huán)節(jié)就是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，是基因定位與克隆乃至基因組結(jié)構(gòu)與功能研究的重要基礎(chǔ)。綠豆在發(fā)展中國家種植比較多，屬于小宗作物，與主要的農(nóng)作物相比，其基礎(chǔ)研究處于相對劣勢。目前，綠豆仍然面臨著諸多問題，如引物匱乏、已知基礎(chǔ)序列少等，主要原因是由于綠豆是閉花授粉作物，種內(nèi)多態(tài)性低；在分子生物學(xué)研究方面，對綠豆的研究還較少，可用于共享的基因組信息也非常少。分子標(biāo)記技術(shù)在近幾年雖然快速發(fā)展，但綠豆的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建工作仍進展緩慢。表1是近幾年來已經(jīng)構(gòu)建的綠豆的5張遺傳連鎖圖譜[8]。

表1 已構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖譜

2.2.2 綠豆與其他豆科作物的遺傳連鎖圖比較最初，豆科植物基因組的比較研究主要是以RFLP標(biāo)記作圖為基礎(chǔ)的，其著眼于同屬或同族的親緣關(guān)系較近的物種間的比較。綠豆也是如此，會大量利用其他豆科作物的探針來構(gòu)建綠豆的遺傳連鎖圖譜，如利用普通菜豆、豇豆、大豆等的探針，這也為綠豆與其他豆科作物基因組的比較提供了一定的條件[9]。MENANCIO-HAUTEA等[10]在對熱帶豆類的基因組進行比較后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在綠豆與豇豆基因組的連鎖群中存在10處的同源區(qū)域，其中，最長的4個保守片段位于綠豆的第1，2，3，7連鎖群，與豇豆的第2，7，1，4連鎖群相對應(yīng)。比較綠豆和小豆的連鎖圖，發(fā)現(xiàn)二者之間也存在保守片段。ISEMURA等[11]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆連鎖圖譜中第1，2，3，4，8，11的連鎖群分別與小豆連鎖圖譜中的第1，4，10，8，2，9連鎖群相對應(yīng)。但是綠豆與豇豆和小豆之間的基因組保守程度相比，綠豆和普通菜豆之間的保守程度相對較高。BOUTIN等[12]將比較的范圍擴大到豇豆屬、菜豆屬和大豆屬之間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于RFLP標(biāo)記的綠豆的連鎖圖譜同普通菜豆的連鎖圖譜存在大范圍的重疊現(xiàn)象，并且，置換現(xiàn)象也大量存在[13]。

2.3 基于綠豆遺傳連鎖圖的抗豆象研究

綠豆象是對于豇豆屬食用豆類作物危害非常嚴(yán)重的倉儲害蟲[14]，其嚴(yán)重地影響這些作物的產(chǎn)量以及質(zhì)量[15]。因此，選育抗蟲品種是亟待解決的問題。

2.3.1 綠豆抗豆象基因的遺傳原理KITAMURA等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2群體的抗豆象性符合3∶1的分離規(guī)律。YOUNG等[17]研究證明，抗豆象性是由1對等位基因來控制的。1998年程須珍等[18]以TC1966作為父本、中綠1號作為母本配制雜交組合,并對其生長得到的F2種子進行了人工室內(nèi)接蟲，鑒定結(jié)果符合3∶1，證明TC1966的抗豆象特性是由1對顯性基因來控制的。至今，抗豆象的遺傳研究大部分都是針對抗豆象野生種TC1966的研究，然而對于抗豆象栽培種綠豆的研究還比較少。

2.3.2 綠豆抗豆象基因的分子標(biāo)記KAGA等[19]利用479個隨機引物,分別在抗蟲親本TC1966和感蟲親本Osaka-ryokuto間篩選，得到8個多態(tài)性較好且與抗豆象基因連鎖的RAPD標(biāo)記。YOUNG等[17]以58個TC1966和感蟲栽培種VC3890的雜交F2為材料進行RFLP分子標(biāo)記試驗，結(jié)果將抗豆象基因（Bruc）定位在第8連鎖群上，并找到了與其連鎖的6個標(biāo)記，最近的一個標(biāo)記與目標(biāo)抗性基因的距離為3.6 cM。KAGA等[19]用TC1966為材料進一步進行RFLP分析，將TC1966的抗豆象基因Br定位在第9連鎖群上，同時繪制了Br基因的遺傳連鎖圖譜，找到了與其緊密連鎖的13個RFLP標(biāo)記，其中6個RFLP標(biāo)記與Br基因的遺傳距離為0.2 cM。

2.4 基于綠豆遺傳連鎖圖的抗旱研究

干旱是一種世界性災(zāi)害，它是影響我國綠豆生產(chǎn)的主要因素之一。據(jù)報道，我國每年大約有667萬hm2的面積得不到灌溉，因干旱造成的糧食減產(chǎn)達700億～800億kg。旱災(zāi)已經(jīng)成為我國第一大自然災(zāi)害[20-21]。

在我國，綠豆的主產(chǎn)區(qū)集中在東北、西北及華北地區(qū)。由于降雨量少，我國西北干旱以及半干旱地區(qū)的主產(chǎn)區(qū)基本上無法正常灌溉，因此，伏旱經(jīng)常發(fā)生，干旱已成為限制這些地區(qū)綠豆生產(chǎn)發(fā)展的主要因素。篩選抗旱的種質(zhì)資源、培育抗旱品種，是我國綠豆生產(chǎn)發(fā)展急需解決的問題[20-21]。

2014年11月，綠豆全基因組測序完成，這是首個豇豆屬作物全基因組測序的物種；到2015年1月底，小豆全基因組測序也公開發(fā)表，這無疑為綠豆、小豆等豇豆屬作物的基因組學(xué)研究揭開了新的一面，將有力促進近緣種作物中基因發(fā)掘、定位等工作的開展。國內(nèi)外關(guān)于綠豆遺傳研究及圖譜構(gòu)建方面的研究，幾乎都是關(guān)于綠豆抗豆象方面的，而對于抗旱方面的遺傳研究幾乎沒有。因此，抗旱綠豆遺傳圖譜的構(gòu)建尤為重要。希望后期在抗旱方面的遺傳研究也可以有所進展，為抗旱品種的選育及利用奠定基礎(chǔ)。

3 討論與展望

當(dāng)前的綠豆遺傳連鎖圖譜主要存在以下問題。

（1）至今已成功構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖連鎖群數(shù)目（9～14）與綠豆的染色體基數(shù)11是不一致的，這可能是因為已構(gòu)建的連鎖圖譜的標(biāo)記位點太少或連鎖區(qū)段存在著高重組的現(xiàn)象[22]。（2）至今已經(jīng)構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖，密度都偏低，且均勻性也比較差，因此，基于連鎖圖譜的基因精細定位和分子標(biāo)記輔助育種等研究都具有很多困難。并且，目前構(gòu)建的綠豆圖譜大多使用RAPD和RFLP標(biāo)記，其中，RAPD屬于顯性標(biāo)記，信息度低，穩(wěn)定性差，不能很好地區(qū)分雜合基因型和純合基因型；開始被廣泛應(yīng)用于作物分子遺傳連鎖圖構(gòu)建的是RFLP標(biāo)記，但RFLP標(biāo)記也存在很多弊端，且其在實際應(yīng)用方面也存在諸多缺陷，如難以進行不同群體圖譜間的比較分析和難以應(yīng)用于基于圖譜的分子標(biāo)記輔助育種等[23]?，F(xiàn)在，SSR分子標(biāo)記深受歡迎，因其為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、試驗周期短、且在植物的基因組中廣泛分布的優(yōu)點，它能夠解決RFLP標(biāo)記所存在的問題，因此，SSR分子標(biāo)記成為作物遺傳圖譜構(gòu)建的首選分子標(biāo)記[24]。（3）目前，構(gòu)建的綠豆遺傳連鎖圖譜所使用的均為初級的作圖群體，后期如果想要完成對基因的精細定位工作，還必須要構(gòu)建綠豆的次級作圖群體（如目標(biāo)近等基因系群體，QTL-NIL）。初級作圖群體大部分的群體數(shù)目都偏小，在200個以下，應(yīng)構(gòu)建密度更高、更加飽和的綠豆遺傳連鎖圖，因此，需要發(fā)展數(shù)目較大的群體。

如今，由于綠豆象小種可能會發(fā)生變異，導(dǎo)致抗蟲品種逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦邢x品種，因此，需要培育具有較永久抗性的抗豆象品種。關(guān)于抗豆象基因的遺傳定位研究目前已經(jīng)起步，這就為后期更深入的研究及其發(fā)展提供了一定的技術(shù)平臺。與此同時，應(yīng)該充分利用分子標(biāo)記，實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種，還可以定位出抗豆象基因，并成功構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。

由于綠豆是自花授粉作物，選育抗豆象的綠豆品種存在一定的難度。若可以把其他豆科作物中的抗豆象基因?qū)氲骄G豆中，就可以提高綠豆抗性。此外，對于防治病蟲害，也面臨著抗蟲材料較少及能否長久抗病蟲害的問題。因此，在實際工作中，應(yīng)該加快培育抗豆象品種的進程，為后期工作奠定基礎(chǔ)。

干旱直接制約綠豆的生產(chǎn)與發(fā)展，選育優(yōu)質(zhì)抗旱品種是當(dāng)前綠豆發(fā)展亟待解決的問題。之前，科研工作者在綠豆的抗旱鑒定等方面作了大量的研究工作，并且已取得了一定的進展。綠豆抗旱是一個復(fù)雜的機理，并且不同的作物適應(yīng)干旱的方式也大不相同[25]。所以，今后對于綠豆抗旱生理生態(tài)的研究應(yīng)該更加全面，加強綜合比較方面的研究。此外，今后工作的重點還應(yīng)該結(jié)合分子生物學(xué)手段，在分子水平上研究綠豆的抗旱機制，并且積極致力于綠豆抗旱基因的發(fā)掘及定位，為后期抗旱遺傳圖譜的構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

利用常規(guī)育種與分子育種相結(jié)合的手段選育出高產(chǎn)、抗病、抗蟲（主要是抗豆象）、抗旱的綠豆新品種。繼續(xù)綠豆品種資源的篩選工作，結(jié)合分子標(biāo)記進行一些農(nóng)藝性狀的輔助選擇研究。

在綠豆遺傳圖譜的構(gòu)建以及基因定位等方面，充分利用并開發(fā)綠豆的DNA分子標(biāo)記，進行綠豆分子水平的遺傳研究，包括分子標(biāo)記輔助育種、QTL作圖研究等；將其他作物中的抗豆象、抗旱和其他抗性基因?qū)氲匠Ｒ?guī)栽培的綠豆品種中，這將是綠豆分子育種研究的重點。

［1］趙丹，程須珍，王麗俠，等.綠豆遺傳連鎖圖譜的整合[J].作物學(xué)報，2010，36（6）：932-939.

［2］鄭卓杰，王述民，宗緒曉，等.中國食用豆類學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：141-163.

［3］王麗俠，程須珍，王素華.綠豆種質(zhì)資源、育種及遺傳研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1519-1527.

［4］王斌，李金國，邱芳，等.綠豆空間誘變育種及其分子生物學(xué)分析[J].空間科學(xué)學(xué)報，1996，16（Z）：121-124.

［5］SINGH G，SAREEN P K，SAHARAN R P.Mutation studies in mungbean（Vigna radiata（L.）Wilczek）[J].Journal of Nuclear A-gricultrual and Biology，1997，26：227-231.

［6］ARUMUGANATHAN K，EARLE E D.Nuclear DNA content of some important plant species[J].Plant Mol Bio Reporter，1991，9：208-218.

［7］沈建華.高等植物基因組結(jié)構(gòu)[J].遺傳，1982，4（6）：38-40.

［8］趙丹.綠豆遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及其分析利用[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

［9］PRAKIT S，PEERASAK S.Genome research in mungbean（Vignaradiata（L.）Wilczek）and blackgram（V.mungo（L.）Hepper）[J]. Science Asia，2007，33（S1）：69-74.

［10］MENANCIO-HAUTEA D，F(xiàn)ATOKUN C A，KUMAR L，et al. Comparative genome analysis of mungbean（Vignaradiata（L.）Wilczek）and cowpea（V.unguiculata（L.）Walpers）using RFLP mappingdata[J].Theor Appl Genet，1993，86：797-810.

［11］ISEMURA T，KAGA A，KONISHI S，et al.Genome dissection of traits related to domestication in azukibean（Vigna angularis）and comparison with other warm-season Legumes[J].Ann Bot，2007，100：1053-1071.

［12］BOUTIN S R，YOUNG N D，OLSEN T C，et al.Genome conservation among three legume genera detected with DNA markers[J]. Genome，1995，38：928-937.

［13］趙丹，程須珍，王麗俠，等.綠豆基因組研究進展[J].植物遺傳資源學(xué)報，2010，11（5）：583-588.

［14］劉旭明，金達生，程須珍，等.綠豆種質(zhì)資源抗豆象鑒定研究初報[J].作物品種資源，1998（2）：35-37.

［15］母連勝，何勇，羅岸，等.質(zhì)體基因工程在植物育種中的應(yīng)用研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，46（6）：1-12.

［16］KITAMURA K，ISHMOTO M，SAWA M.Inheritance of resistance to in-festation with azukibeanweevil in Vigna sublobata and successful in corporation to V.radiata[J].Japan J Breed，1988，38：459-464.

［17］YOUNGN D，KUMAR L，MENANCIO-HAUTEA D，et al.RFLP map-ping of amajorbruchid resistance gene inmungbean（Vigna ra-diate L.wilczek）[J].Theoretical and Applied Genetics，1992，84：839-844.

［18］程須珍，王素華，金達生，等.中國綠豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展與科技應(yīng)用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002：112-115.

［19］KAGA A，ISHIMOTO M.Genetic localization of a bruchid resistancegene and its relationship to insecticidal cyclopeptide alkaloids，the vignatic acids，in mungbean（Vigna radiata L.wilczek）[J].Springer-Verlag，1998，258：378-384.

［20］王蘭芬，武晶，景蕊蓮，等.綠豆種質(zhì)資源芽期抗旱性鑒定[J].植物遺傳資源學(xué)報，2014，15（3）：498-503.

［21］包秀霞，包秀平，廉勇.干旱脅迫對內(nèi)蒙古草原多根蔥生理生化指標(biāo)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2017，32（1）：233-238.

［22］路鐵剛，丁毅.分子遺傳學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2008：409-415.

［23］宛煜嵩，王珍，肖英華，等.一張含有227個SSR標(biāo)記的大豆遺傳連鎖圖[J].分子植物育種，2005，3（1）：15-20.

［24］周元昌，陳啟鋒.作物QTL定位研究進展[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，29（2）：138-144.

［25］譚艷，彭盡暉.植物抗旱機理及抗旱性鑒定方法研究進展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（5）：423-426.

Research Progress on the Construction of Genetic Map of Mung Bean

LIUChendan1，ZHANGZeyan2，ZHANGYaowen2
（1.College ofBio-engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Mungbean（Vigna radiata L.）is our countrytraditional export commodities,it has important medical and edible value. Compared with other crops,such as maize and wheat,the genetic research of mung bean is slow in molecular marker and genetic map construction.Its variety improvement and utilization of germplasm resources are limited to conventional breeding methods.This paper reviewed the mung bean breeding,molecular genetic study,mung bean genetic linkage map of mungbean weevil resistance research and research on the drought resistance,which will help promote domestic genetic research and breedingprocess ofmungbean.

mungbean;genetic map;research progress

S522

：A

：1002-2481（2017）06-1040-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.43

2017-04-18

國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-09-G11）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種工程項目（17yzgc088）

劉晨旦（1992-），女，山西呂梁人，在讀碩士，研究方向：作物遺傳育種。張耀文為通信作者。