苦豆子遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及SaLDC啟動(dòng)子缺失分析

陸姍姍+孟祥善+李娟+楊毅+劉萍+劉妍

[摘要] 藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立對(duì)其功能基因研究具有重要意義，該研究在已有苦豆子再生體系的基礎(chǔ)上，對(duì)農(nóng)桿菌菌液濃度、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、農(nóng)桿菌與苦豆子愈傷組織的共培養(yǎng)時(shí)間、愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮添加方式和乙酰丁香酮濃度6個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在預(yù)培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷組織中農(nóng)桿菌菌液濃度A600為0.9、侵染時(shí)間15 min、農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)48 h、并在侵染液中添加AS 200 μmol·L^-1時(shí)，GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)83.33%。以苦豆子基因組DNA為模板克隆獲得SaLDC上游1 260 bp的啟動(dòng)子序列（GenBank登錄號(hào)KY038928），將不同長(zhǎng)度（310，594，765，924，1 260 bp）的啟動(dòng)子缺失片段分別與GUS報(bào)告基因融合，構(gòu)建的植物表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化苦豆子愈傷組織，GUS瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，5個(gè)不同長(zhǎng)度的SaLDC啟動(dòng)子片段均可驅(qū)動(dòng)GUS在苦豆子愈傷組織中的表達(dá)，表明克隆所得的SaLDC啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性，以310 bp的片段啟動(dòng)活性最強(qiáng)，為進(jìn)一步分析該啟動(dòng)子功能奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 苦豆子； 賴(lài)氨酸脫羧酶（LDC）； 啟動(dòng)子基因； GUS瞬時(shí)表達(dá)； 功能分析

[Abstract] Establishing the genetic transformation system of medicinal plant is important to study their functional genes. Based on the established regeneration system of Sophra alopecuroides， 6 factors of genetic transformation were optimized， that was the concentration of Agrobacterium tumefaciens， the infection time， the co-cultivation time of agrobacterium tumefaciensand S.alopecuroides callus， the preculture time of S.alopecuroides callus， the adding method ofacetosyringone （AS） and the concentration of AS， respectively. The results showed that a maximum genetic transformation efficiency of 83.33% was achieved with 15d-precultured of S.alopecuroides callus， which was infected by A600=0.9 A. tumefaciens for 15 minutes and then co-cultivated for 48 hours with 200 μmol·L^-1AS. The promoter sequence （1 260 bp） of upstream SaLDC was cloned from S.alopecuroides genomic DNA （gene bank accession number： KY038928）. The deletion fragment of SaLDC promoter with different length （310，594，765，924，1 260 bp） were ligated with the GUS reporter gene to form five plant expression vectors named P310，P594，P765，P924，P1260， which were then transferred into S.alopecuroides callus. The GUS transient expression showed that all 5 different deletion fragment of SaLDC promoter can drive the GUS gene expression in S. alopecuroides callus. The SaLDC promoter we cloned has high promoter activity， and they may facilitate its function analysis in the future.

[Key words] Sophra alopecuroides； lysine decarboxylase （LDC）； promoter gene； GUS transient expression； function analysis

苦豆子Sophra alopecuroides L.別名苦豆根、苦甘草和歐苦參等，是豆科槐屬多年生草本植物，廣泛分布于寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、甘肅、西藏等荒漠、半荒漠和草原邊緣地帶[1]?？喽棺拥叵赂看謮亚叶鄠?cè)根，加之其較強(qiáng)的耐旱性、耐鹽堿和抗風(fēng)沙等性能，在西北地區(qū)的生態(tài)環(huán)境中有著重要的保護(hù)作用[2]?？喽棺右彩俏覈?guó)西北地區(qū)重要的藥用植物，具有抗腫瘤、抗菌消炎、止痛殺蟲(chóng)、通經(jīng)活血等功效[3-4]，其中氧化苦參堿（oxymatrine，OMA）（又稱(chēng)苦參素）在治療慢性乙型病毒性肝炎、苦參堿（matrine，MA）在治療婦科炎癥中均有很好的療效[5]，此外，苦參堿生物農(nóng)藥由于具有對(duì)人畜毒性低等特點(diǎn)，在我國(guó)也有廣泛的應(yīng)用[6]。

OMA和MA屬于喹諾里西啶類(lèi)生物堿（quinolizidine Alkaloids，QAs）[7]，QAs是賴(lài)氨酸在賴(lài)氨酸脫羧酶作用下脫羧產(chǎn)生的戊二胺（尸胺）經(jīng)過(guò)一系列的生化代謝而成[8]。賴(lài)氨酸脫羧酶（lysine decarboxylase，LDC）作為QAs生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶[9]，在OMA和MA生物合成過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用。楊毅等[10]克隆獲得了苦豆子SaLDC基因，并發(fā)現(xiàn)苦豆子SaLDC的表達(dá)和OMA的積累均受干旱脅迫的影響，且基因的表達(dá)量與OMA的積累呈正相關(guān)關(guān)系。逯明輝等[11]利用cDNA-AFLP技術(shù)從耐冷性強(qiáng)的黃瓜中獲得了132 bp長(zhǎng)的LDC部分片段，推測(cè)該基因可能在提高種子低溫發(fā)芽力方面起重要作用。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，GUS瞬時(shí)表達(dá)常被用于快速確定和優(yōu)化各種影響轉(zhuǎn)化效率的因素，繼而建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系[12]。啟動(dòng)子在基因轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄頻率的調(diào)控中有決定性作用，可以控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)起始時(shí)間和表達(dá)程度的強(qiáng)弱[13]，啟動(dòng)子缺失分析是研究啟動(dòng)子及其調(diào)控元件功能的一種重要且有效的方法[14]。邵克強(qiáng)等[15]通過(guò)5′端缺失系統(tǒng)研究了水稻Pib啟動(dòng)子中分子元件YTCANTYY的拷貝數(shù)與啟動(dòng)子啟動(dòng)活性和暗誘導(dǎo)性的關(guān)系。Ren等[16]通過(guò)對(duì)水稻OsMT2b啟動(dòng)子的缺失分析明確該啟動(dòng)子從-21～-212是最短的活性區(qū)域。本研究在已有苦豆子再生體系的基礎(chǔ)上，研究影響其遺傳轉(zhuǎn)化效率的各種因素，構(gòu)建SaLDC不同啟動(dòng)子缺失片段與報(bào)告基因GUS的重組表達(dá)載體，探討不同啟動(dòng)子缺失片段在苦豆子愈傷組織中的瞬時(shí)表達(dá)水平，以期對(duì)苦豆子SaLDC啟動(dòng)子的功能進(jìn)行系統(tǒng)研究，為啟動(dòng)子的順式作用元件與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的互作研究提供依據(jù)，也為今后詳細(xì)研究SaLDC在OMA生物合成途徑中的地位奠定基礎(chǔ)。

1 材料

苦豆子植株由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院李曉偉副教授鑒定為S. alopecuroides，種子采于寧夏永寧縣楊和鄉(xiāng)（106.14°E，38.14°N），憑證標(biāo)本號(hào)為103，室溫風(fēng)干后脫粒并精選。

根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens EHA 105和pBI121質(zhì)粒載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa生物工程有限公司；克隆載體pGEM-T1simple、DNA膠回收試劑盒和GUS組織化學(xué)染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide，X-Gluc）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；T4DNA連接酶和限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ，BamHⅠ均購(gòu)自NEW ENGLAND生物工程有限公司；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 苦豆子子葉節(jié)愈傷組織的獲得

挑選潔凈、飽滿(mǎn)、大小一致的苦豆子種子去硬實(shí)，無(wú)菌處理后接種于MS基本培養(yǎng)基上使其發(fā)芽。6 d后選取生長(zhǎng)健壯、未展開(kāi)子葉的無(wú)菌苗切取子葉節(jié)（離上胚軸基部和下胚軸各約3 mm），沿子葉下胚軸垂直剖開(kāi)，刮去已長(zhǎng)出的腋芽，縱切面朝下接種于MS+0.5 mg·L^-12，4-D+0.5 mg·L^-1 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度（28±1）℃，16 h/8 h光/暗體系，光照1 200～1 600 lx。

2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦豆子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系建立

分別對(duì)苦豆子愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌（含pBI121質(zhì)粒）侵染時(shí)間、侵染濃度、愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間、乙酰丁香酮（AS）添加方式及濃度6個(gè)因素進(jìn)行研究。所有因子均按單一因素進(jìn)行優(yōu)化，以報(bào)告基因GUS瞬時(shí)表達(dá)率的高低反映各因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響（GUS瞬時(shí)表達(dá)率以50%以上有靛藍(lán)色反應(yīng)的外植體數(shù)占被檢測(cè)外植體總數(shù)的百分?jǐn)?shù)計(jì)），每處理20個(gè)外植體，3次重復(fù)，得到最佳農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦豆子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系。

2.3 不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段獲得及植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)SaLDC啟動(dòng)子5個(gè)不同長(zhǎng)度片段的上游引物（P1，P2，P3，P4，P5）和1個(gè)共用下游引物（R）（表1），以苦豆子基因組DNA為模板擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：DNA模板2.0 μL，10×Buffer2.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L^-1）3.2 μL，上下游引物（10.0 μmol·L^-1）各1 μL，Taq DNA polymerase （5.0 U·μL^-1）0.2 μL，dd H2O 10.4 μL；PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃2 min；36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

目標(biāo)片段經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收純化后分別連接至pGEM-T1 simple載體，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，藍(lán)白斑、氨芐青霉素抗性平板篩選出陽(yáng)性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

分別提取含苦豆子不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段的質(zhì)粒DNA，用HindⅢ，BamHⅠ進(jìn)行雙酶切并回收目的片段，同時(shí)雙酶切pBI121質(zhì)粒，用目的片段代替其中35S啟動(dòng)子，T4 DNA連接酶連接后得到具有不同長(zhǎng)度SaLDC啟動(dòng)子片段的重組表達(dá)載體，依次命名為P310，P594，P765，P924，P1260（圖1）。表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌TOP10，利用pBI121中卡那霉素抗性基因nptⅡ進(jìn)行重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆篩選，選取陽(yáng)性菌株提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化苦豆子愈傷組織

構(gòu)建好的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105，Kan篩選，陽(yáng)性單克隆于含Kan（50 mg·L^-1）的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)至A600 = 0.8～1.5，菌體用侵染液（1/2MS+5%蔗糖+200 μmol·L^-1 AS）懸浮至A600 =0.9，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化已培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷15 min，無(wú)菌濾紙吸掉愈傷表面多余的菌液后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，26 ℃黑暗共培養(yǎng)48 h經(jīng)無(wú)菌水清洗、吸干水分，一部分用于GUS組織化學(xué)染色，另一部分用500 mg·L^-1頭孢霉素（Cef）水溶液清洗后，轉(zhuǎn)MS+0.1 mg·L^-1NAA+1.25 mg·L^-1 6-BA+500 mg·L^-1Cef分化培養(yǎng)基上繼續(xù)脫菌分化培養(yǎng)。每處理10塊外植體，重復(fù)3次，以非轉(zhuǎn)基因苦豆子愈傷為陰性對(duì)照（CK-），CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的pBI121轉(zhuǎn)化苦豆子愈傷作為陽(yáng)性對(duì)照（CK+）。

2.5 苦豆子外植體GUS組織化學(xué)染色

經(jīng)農(nóng)桿菌侵染或未侵染的苦豆子外植體或愈傷用GUS組織化學(xué)染色液進(jìn)行染色，37 ℃過(guò)夜，75%乙醇脫色，期間更換數(shù)次直至洗脫液無(wú)色為止，仔細(xì)觀察、統(tǒng)計(jì)染色情況并拍照。染色液組成：50 mmol·L^-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），50 mmol·L^-1鐵氰化鉀，50 mmol·L^-1亞鐵氰化鉀，0.1 mol·L^-1 Na2EDTA，1 g·L^-1X-Gluc。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用DPS 6.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦豆子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu)化

3.1.1 農(nóng)桿菌菌液濃度對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的影響 將預(yù)培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷，分別在菌液濃度A600為0.3，0.6，0.9，1.2的農(nóng)桿菌菌液中侵染15 min，黑暗共培養(yǎng)48 h，結(jié)果表明菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率具有顯著影響（P<0.05）。在A600為0.3～0.9時(shí)，菌液濃度越大瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率越高，菌液濃度A600=0.3，GUS瞬時(shí)表達(dá)率僅為23.33%，A600 =0.6～0.9時(shí)，瞬時(shí)表達(dá)率都在60.00%以上（表2），但當(dāng)菌液濃度A600 =1.2時(shí)，愈傷組織經(jīng)過(guò)48 h共培養(yǎng)后基本被農(nóng)桿菌覆蓋，整體褐化嚴(yán)重、軟化并且喪失活性，轉(zhuǎn)化效率降低，GUS瞬時(shí)表達(dá)率只有30.00%（圖2A）。

3.1.2 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的影響 用A600 =0.9的農(nóng)桿菌菌液對(duì)預(yù)培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷組織分別侵染5，10，15，20 min，黑暗共培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示，在5～15 min隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率極顯著增加（P<0.01），侵染15 min時(shí)，愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好，且表達(dá)率達(dá)66.67%，極顯著高于其他侵染時(shí)間（表2），侵染20 min共培養(yǎng)48 h后，發(fā)現(xiàn)有大量愈傷組織出現(xiàn)軟腐癥狀，后續(xù)培養(yǎng)變黑死亡（圖2B）。

3.1.3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的影響 農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)過(guò)程是外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期，將預(yù)培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷經(jīng)A600 =0.9的農(nóng)桿菌侵染15 min，分別進(jìn)行24，48，72 h的共培養(yǎng)后做除菌處理。共培養(yǎng)24 h，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)量較低，愈傷表面肉眼不可見(jiàn)農(nóng)桿菌菌落，對(duì)愈傷未造成大面積的侵染，GUS瞬時(shí)表達(dá)率僅為36.67%；共培養(yǎng)48 h，愈傷表面可見(jiàn)到農(nóng)桿菌菌落，愈傷開(kāi)始褐化，但此時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率較高，GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)66.67%；共培養(yǎng)72 h，愈傷褐化嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)超過(guò)48 h后，由于農(nóng)桿菌的過(guò)渡繁殖，阻斷了愈傷組織細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，從而抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，使得愈傷褐變、枯萎，死亡率升高，導(dǎo)致瞬時(shí)表達(dá)率下降為18.33%（圖2C，表2）。

3.1.4 子葉節(jié)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的影響 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室苦豆子愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果可知，苦豆子子葉節(jié)經(jīng)2～3 d的培養(yǎng)后膨脹，4～10 d開(kāi)始形成愈傷，但長(zhǎng)勢(shì)緩慢，10～15 d愈傷因快速生長(zhǎng)而膨大，20 d后愈傷停止生長(zhǎng)，23 d后愈傷褐化。本研究將子葉節(jié)分別進(jìn)行0，2，10，15，20，23 d的預(yù)培養(yǎng)，用A600 =0.9的含pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105侵染15 min，黑暗共培養(yǎng)48 h。研究表明，苦豆子子葉節(jié)的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間顯著影響轉(zhuǎn)化效率，預(yù)培養(yǎng)0～2 d，子葉節(jié)才開(kāi)始產(chǎn)生愈傷，農(nóng)桿菌的侵染效率低；預(yù)培養(yǎng)10～15 d由于子葉節(jié)正處于愈傷增生期，愈傷組織細(xì)胞分裂速度快，結(jié)構(gòu)疏松，細(xì)胞壁薄，有利于外源基因的導(dǎo)入，統(tǒng)計(jì)顯示，GUS瞬時(shí)表達(dá)率可達(dá)到60.00%以上（表2），與其他4個(gè)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間有極顯著差異（P<0.01）；隨著預(yù)培養(yǎng)天數(shù)的增加子葉節(jié)愈傷褐化嚴(yán)重，轉(zhuǎn)化效率急劇下降（圖2D）。

3.1.5 AS對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的影響 農(nóng)桿菌對(duì)植物酚類(lèi)化合物具有趨化性，它可以使農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的Vir活化和表達(dá)[17]。本研究分別向共培養(yǎng)基和侵染液中添加濃度梯度為100，200，300 μmol·L^-1的AS，以不添加AS為對(duì)照。結(jié)果表明在共培養(yǎng)基內(nèi)添加不同濃度AS對(duì)苦豆子愈傷轉(zhuǎn)化效率沒(méi)有影響（圖2E），各濃度梯度間無(wú)顯著性差異（表2）；但在侵染液中添加一定濃度的AS可以有效提高農(nóng)桿菌對(duì)愈傷的轉(zhuǎn)化效率，其中AS濃度為200 μmol·L^-1時(shí)GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高為83.33%，顯著高于其他各濃度的表達(dá)效率（表2），且染色覆蓋率都較高，單塊愈傷染色覆蓋率可達(dá)90%以上（圖2F），但當(dāng)AS濃度為300 μmol·L^-1時(shí)，轉(zhuǎn)化效率極顯著下降（P<0.01）。

3.2 不同長(zhǎng)度的SaLDC啟動(dòng)子缺失片段分析

3.2.1 不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子片段的獲得及植物表達(dá)載體構(gòu)建 以苦豆子基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的5條上游引物和1條下游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得310，594，765，924，1 260 bp 5條長(zhǎng)度不同的啟動(dòng)子片段，依次定向替換pBI121載體上的CaMV35S啟動(dòng)子，連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10，菌液PCR檢測(cè)后雙酶切驗(yàn)證，已成功獲得5個(gè)啟動(dòng)子片段的植物表達(dá)載體（P310，P594，P765，P924，P1260，圖3）。

3.2.2 不同長(zhǎng)度SaLDC啟動(dòng)子片段在苦豆子愈傷中的瞬時(shí)表達(dá) 將構(gòu)建好的5個(gè)植物表達(dá)載體（P310，P594，P765，P924，P1260）以及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化苦豆子愈傷組織。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，5個(gè)不同長(zhǎng)度的SaLDC啟動(dòng)子序列都能驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)，說(shuō)明這5個(gè)啟動(dòng)子序列均具有啟動(dòng)必備的作用元件活性，能驅(qū)使下游基因表達(dá)，但觀察發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平有明顯差異，以310，594 bp的啟動(dòng)子片段GUS瞬時(shí)表達(dá)強(qiáng)度最高，隨著SaLDC啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降，924，1 260 bp的啟動(dòng)子片段瞬時(shí)表達(dá)強(qiáng)度都明顯減弱，非轉(zhuǎn)化愈傷組織中無(wú)GUS表達(dá)（圖4），5個(gè)啟動(dòng)子片段的GUS瞬時(shí)表達(dá)率分別為73.33%，66.67%，60.00%，43.33%，40.00%。P310，P594的GUS瞬時(shí)表達(dá)率均極顯著高于P924，P1260（P<0.01）。

4 討論

遺傳轉(zhuǎn)化是細(xì)菌與植物相互作用的過(guò)程，對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，嚴(yán)格控制農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)時(shí)間，選擇合適的農(nóng)桿菌濃度以及添加乙酰丁香酮等酚類(lèi)物質(zhì)均可有效提高遺傳轉(zhuǎn)化的效率[18-19]。宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)和發(fā)育過(guò)程對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果有明顯影響，只有當(dāng)其處在對(duì)農(nóng)桿菌良好的感受態(tài)時(shí)，才能有效接受外源DNA，啟動(dòng)遺傳轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)15 d的苦豆子愈傷生長(zhǎng)旺盛，處于增生期，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高，這與Collado[20]等研究菜豆處于增生期愈傷更有利于遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果一致。農(nóng)桿菌侵染時(shí)間和菌液濃度也是影響植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素，本研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌液濃度A600控制在0.6～0.9，侵染時(shí)間為15 min可獲得高的瞬時(shí)表達(dá)率。農(nóng)桿菌附著后并不能立刻轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，只有在創(chuàng)傷部位生存16 h以上的菌株才有此功能[21]，但是共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植物細(xì)胞易受毒害而死亡，并且導(dǎo)致后續(xù)操作中脫菌困難，本研究對(duì)苦豆子愈傷和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)48 h既可以得到最高的轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)又不致使愈傷組織細(xì)胞過(guò)度受害。

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)基因?qū)-DNA轉(zhuǎn)移起介導(dǎo)作用，它靠植物受傷細(xì)胞產(chǎn)生的酚類(lèi)化合物激活，AS誘導(dǎo)己知所有Vir調(diào)節(jié)子[22]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在共培養(yǎng)基內(nèi)添加AS可有效提高GUS瞬時(shí)表達(dá)率[23-25]，但也有研究認(rèn)為由于不同植物對(duì)AS反應(yīng)的敏感程度不同，共培養(yǎng)基內(nèi)添加AS對(duì)有些植物的遺傳轉(zhuǎn)化并不是必不可少的[26]。本研究就AS不同添加方式和添加濃度做了一系列探索，研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)基內(nèi)添加AS，GUS瞬時(shí)表達(dá)率與對(duì)照無(wú)顯著性差異，但在侵染液中添加AS可有效提高瞬時(shí)表達(dá)率，這可能是在共培養(yǎng)基中添加AS，愈傷組織只能與共培養(yǎng)基接觸面的活化農(nóng)桿菌相接觸，而在侵染液中添加AS，侵染過(guò)程中農(nóng)桿菌全方位包裹并附著于愈傷組織，在共培養(yǎng)過(guò)程中更有利于表達(dá)載體導(dǎo)入愈傷組織，從而使得轉(zhuǎn)化效率顯著增加，相似的結(jié)論在他人的研究中也有報(bào)道[27]。然而添加AS的濃度并不是越高越好，在侵染液中添加300 μmol·L^-1的AS，愈傷褐化嚴(yán)重，GUS瞬時(shí)表達(dá)率降低至56.67%，與添加100～200 μmol·L^-1AS的瞬時(shí)表達(dá)率差異極顯著。一方面可能由于高濃度的酚類(lèi)物質(zhì)本身使外植體毒害致死，另一方面由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌菌株與植物細(xì)胞之間相互作用的結(jié)果，過(guò)高濃度的AS將過(guò)度誘導(dǎo)Vir的表達(dá)，增強(qiáng)了農(nóng)桿菌侵染活力，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞受農(nóng)桿菌毒害而死亡。

在已報(bào)道的植物啟動(dòng)子中，大多數(shù)均富含A/T序列，這是基因啟動(dòng)子的一個(gè)基本特征[28]，本研究SaLDC啟動(dòng)子序列中A/T量高達(dá)90%，G/C量?jī)H占10%，說(shuō)明該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA解旋所需消耗的能量更小[29]，GUS瞬時(shí)表達(dá)顯示SaLDC啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明高含量的A/T使得DNA雙鏈結(jié)構(gòu)更易解螺旋從而提高基因的轉(zhuǎn)錄效率。

真核基因表達(dá)是非常復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，研究基因的啟動(dòng)子調(diào)控元件及啟動(dòng)子活性對(duì)分析轉(zhuǎn)錄起始水平上基因調(diào)控具有重要意義，在本研究中，序列分析表明在SaLDC啟動(dòng)子-1～-594區(qū)段集中存在大量增強(qiáng)子元件GATA（-489，-287，-235，-119），增強(qiáng)效果疊加，對(duì)啟動(dòng)子的活性具有顯著增強(qiáng)作用，對(duì)SaLDC啟動(dòng)子缺失片段驅(qū)動(dòng)的苦豆子愈傷組織的GUS瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，P310，P594驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)強(qiáng)度較高，也說(shuō)明此段區(qū)域是啟動(dòng)子調(diào)控的關(guān)鍵序列部分，預(yù)測(cè)結(jié)果與瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果一致；在-806處存在1個(gè)抑制子WRKY710S[30]，由于該抑制子的存在，減弱了啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致P924，P1260的愈傷組織GUS瞬時(shí)表達(dá)明顯減弱；此外，隨著SaLDC啟動(dòng)子自身序列長(zhǎng)度的增加，啟動(dòng)子序列中存在的大量順式作用元件，影響了下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平。由于GUS瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果只是短暫的高水平的表達(dá)，表達(dá)水平不長(zhǎng)久也不穩(wěn)定，因此對(duì)于SaLDC啟動(dòng)子功能與特性的進(jìn)一步研究，例如其大量順式作用元件功能的驗(yàn)證，還需獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志.第40卷[M].北京：科學(xué)出版社，1994：80.

[2] 秦學(xué)功，元英進(jìn).苦豆子生物堿的研究與苦豆子的綜合利用[J].中國(guó)野生植物資源，2011，19（4）：30.

[3] 劉芬，劉潔，陳霞.氧化苦參堿的抗炎作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，6（31）：728.

[4] 楊巧麗，顧政一，黃華.中藥苦豆子的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2011，26（3）：232.

[5] 張清云，張國(guó)榮，尹長(zhǎng)安，等.寧夏苦豆子藥用植物資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8（1）：104.

[6] 高曉原，貝盞臨，雷茜，等.寧夏苦豆子資源基本情況及綜合開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀[J].中國(guó)野生植物資源，2009，28（2）：17.

[7] Bunsupa S，Yamazaki M，Saito K. Quinolizidine alkaloid biosynthesis： recent advances and future prospects[J].Front Plant Sci，2012，3（239）： 1.

[8] Tsuda K， Saeki S， Imura S， et al. Studies on the synthesis of matrine. Ⅰ. The total synthesis of nordehydro-α-matrinidine and dehydro-α-matrinidine[J]. J Org Chem，1956，21（12）：1481.

[9] Bunsupa S， Katayama K， Ikeura E， et al. Lysine decarboxylase catalyzes the first step of quinolizidine alkaloid biosynthesis and coevolved with alkaloid prAuction in Leguminosae[J]. Plant Cell，2012，24 （3）：1202.

[10] 楊毅，陸姍姍，劉萍，等.苦豆子賴(lài)氨酸脫羧酶基因克隆與表達(dá)分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（8）：128.

[11] 逯明輝，李曉明，陳勁楓，等.黃瓜發(fā)芽期耐冷性與賴(lài)氨酸脫羧酶基因表達(dá)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（12）：2492.

[12] Gubba S， Xie Y H， Das A. Regulation of Agrobacterium tumefaciens virulence gene expression：isolation of a mutation that restores WrGD52E function[J]. Mol Plant Microbe In，1995，8（5）：788.

[13] 盧榮江，劉迪秋，葛鋒，等.三七鯊烯環(huán)氧酶基因（SE）啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報(bào)，2015，51（4）：495.

[14] Iwamoto M， Higo H， Higo K. Strong expression of the rice catalase gene CatB promoter in protoplasts and roots of both a monocot and dicots[J].Plant Physiol Bioch， 2004，42：241.

[15] 邵克強(qiáng)，楊世湖，余麗，等.Pib基因啟動(dòng)子內(nèi)YTCANTYY暗誘導(dǎo)分子元件功能的轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證[J].作物學(xué)報(bào)， 2008， 34（9）： 1667.

[16] Ren Y J， Zhao J. Functional analysis of the rice metallothionein gene OsMT2b promoter in transgenic Arabidopsis plants and rice germinated embryos[J]. Plant Sci， 2009，176：528.

[17] 儲(chǔ)俊，許娜，張強(qiáng)，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)藥用百合鱗片遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（6）：164.

[18] Deo P C， Tyagi A P， Taylor M， et al.Factors affecting somatic embryogenesis and transformation in mAern plant breeding[J]. South Pac J Nat App Sci， 2010，28（10）：27.

[19] Kayani W K， Fattahi M， Palazon J， et al. Comprehensive screening of influential factors in the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of the himalayan elixir： Ajuga bracteosa Wall. ex. Benth[J].J App Res Med Aromatic Plants，2016， 3（4）： 151.

[20] Collado R， Caraballoso B， Garcia L R， et al. Agrobacterium-mediated transformation of Phaseolus vulgaris L. using indirect organogenesis[J].Sci Hortic， 2015，195：89.

[21] 王關(guān)林， 方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科學(xué)出版社， 2002：388.

[22] Cho H， Winans S C. VirA and VirG activate the Ti plasmid repABC operon， elevating plasmid copy number in response to wound-released chemical signals[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005，102（41）：14843.

[23] Zhang J J，Shi L， Chen H， et al. An efficient Agrobacterium-mediated transformation methA for the edible mushroom Hypsizygus marmoreus[J]. Microbiol Res， 2014， 169： 741.

[24] 楊茹，袁慶華，曹致中，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2010，32（1）：26.

[25] Khan S， Fahim N， Singh P，et al. Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of Ocimum gratissimum： a medicinally important crop[J].Ind Crop Prod，2015，71：138.

[26] 黃天帶，李哲，孫愛(ài)花，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠樹(shù)花藥愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].作物學(xué)報(bào)，2010， 36（10）： 1691.

[27] 姚慶榮，郭運(yùn)玲，孔華，等.影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木薯遺傳轉(zhuǎn)化因素分析[J].植物研究，2012，32（2）：227.

[28] 杜皓，丁林云，何曼林，等.受多逆境誘導(dǎo)表達(dá)的Gh WRKY64基因啟動(dòng)子克隆與功能分析[J].作物學(xué)報(bào)，2015，41（4）：593.

[29] Lam E， Kano-Murakami Y， Gilmartin P， et al. A metal-dependent DNA-binding protein interacts with a constitutive element of a light-responsive promoter[J]. Plant Cell， 1990， 2（9）： 857.

[30] 崔同霞，白江平，魏桂民，等.馬鈴薯SGT3基因表達(dá)及其啟動(dòng)子功能分析[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23（2）：196.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]