甲基磺酸乙酯誘變瓠瓜種子的條件篩選

康保珊，李俊香，劉麗鋒，古勤生

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所鄭州450009）

甲基磺酸乙酯誘變瓠瓜種子的條件篩選

康保珊，李俊香，劉麗鋒，古勤生

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所鄭州450009）

為構(gòu)建瓠瓜突變體庫，以瓠瓜材料‘安生葫蘆’種子為試材，探索甲基磺酸乙酯（EMS）誘變的最佳條件。設(shè)置種子開殼和不開殼2種處理，0.8%、1%、1.5%、2%、3%和4.5%共6個不同EMS濃度，2、4、8、12 h共4個不同誘變時間，分析24個不同濃度和時間處理組合對開殼種子相對發(fā)芽率的影響。結(jié)果表明，種子開殼處理后對EMS誘變濃度的敏感性顯著提高。在相同EMS濃度下，誘變時間越長瓠瓜種子相對發(fā)芽率越低，8 h為最佳誘變時間；在相同EMS誘變時間下，EMS濃度越大相對發(fā)芽率越低；隨著EMS誘變時間的增加，不同EMS濃度間種子發(fā)芽率的差異顯著性降低，半致死濃度為1%～2%。綜合分析，確定EMS誘變最佳條件為：瓠瓜種子開殼后溫水浸種4 h，然后用1.5%EMS誘變處理8 h。

瓠瓜；種子；甲基磺酸乙酯；誘變

葫蘆科葫蘆屬的瓠瓜（Lagenaria sicerariavar. hispida）又名瓠子，廣泛用作西瓜甜瓜砧木以防枯萎病。然而近年來，黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的發(fā)生日趨嚴(yán)重，該病毒可侵染葫蘆科作物并使其種子帶毒傳播［1-3］，給我國西瓜甜瓜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。已有研究表明，自然條件下西瓜種子很少帶毒，甚至不帶毒［4］，而該病毒主要通過砧木種子帶毒傳播，西瓜大量采用嫁接栽培的生產(chǎn)方式時很容易被侵染。瓠瓜砧木是CGMMV的易感作物，種子攜帶CGMMV非常普遍［5-7］，導(dǎo)致生產(chǎn)上大量采用南瓜代替瓠瓜作為西瓜砧木，但以瓠瓜作為砧木所生產(chǎn)的西瓜甜度和口感等品質(zhì)更好，有著南瓜砧木不可替代的優(yōu)點［8-12］，因此，培育抗病瓠瓜砧木對于西瓜甜瓜的生產(chǎn)有重要意義。目前，由于抗病種質(zhì)資源缺乏，利用誘變技術(shù)創(chuàng)制新的育種材料是快速有效的方法。

甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）是一種常用的化學(xué)誘變劑，能誘發(fā)產(chǎn)生高密度的系列等位基因點突變。甜瓜是最早利用EMS誘變成功構(gòu)建突變體庫的葫蘆科作物［13-14］，近年黃瓜和西瓜的EMS突變體庫也有研究報道［15-17］。瓠瓜是西瓜甜瓜主要的砧木資源，采用EMS突變技術(shù)創(chuàng)造瓠瓜優(yōu)異基因資源對于西瓜甜瓜的生產(chǎn)具有極其重要的意義。筆者通過對EMS處理濃度、時間等因素設(shè)計處理組合，篩選出誘變瓠瓜種子的最佳處理條件，為構(gòu)建高質(zhì)量瓠瓜突變體庫、創(chuàng)制抗病毒病瓠瓜資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料

供試瓠瓜材料‘安生葫蘆’由安徽省安生種業(yè)有限公司提供?；瘜W(xué)誘變劑為EMS，用pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液配制。

1.2方法

設(shè)計2種誘變前種子處理方式：開殼后溫水浸種4 h和不開殼浸種20 h，用1%的EMS誘變12 h，同時將磷酸鹽緩沖液浸種設(shè)為對照，3個重復(fù)，統(tǒng)計發(fā)芽率。種子開殼方法：利用工具（如指甲刀）輕壓種殼，使其裂縫即可。

選擇最佳種子處理方式，采用2因素完全隨機區(qū)組設(shè)計；因素1為EMS濃度，設(shè)6個EMS濃度水平，即0.8%、1%、1.5%、2%、3%、4.5%；因素2為誘變時間，設(shè)4個誘變時間水平，即2、4、8、12 h。共24個處理，3次重復(fù)，每個處理50粒種子。誘變結(jié)束，溶液中加入濃度0.1 mol·L-1的Na2S2O3中止反應(yīng)，再用清水洗4～5次，瀝干水，用濕潤的紗布包好置于28℃恒溫箱中催芽，為免長菌，期間需每天用清水沖洗種子表面，10 d后調(diào)查發(fā)芽率。

為排除其他因素對種子發(fā)芽率的影響，同時設(shè)pH 7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖處理作為對照（CK），按照下面公式計算發(fā)芽率：相對發(fā)芽率/%=處理的實際發(fā)芽率/對應(yīng)CK實際發(fā)芽率×100。

2 結(jié)果與分析

2.1不同種子處理方式對瓠瓜種子發(fā)芽率的影響

種子采用2種方式處理：開殼和不開殼，開殼種子在EMS誘變前先用溫水浸泡4 h，不開殼種子浸泡20 h。結(jié)果顯示，不開殼種子在1%EMS下誘變12 h，相對發(fā)芽率為99.2%，與對照相比，沒有顯著差異，在此條件下開殼后的種子相對發(fā)芽率降低到46%左右（圖1），與對照差異顯著，表明開殼后種子對EMS誘變濃度的敏感性增加。在保證半致死率的情況下，開殼處理可以降低EMS用量，減輕環(huán)境污染，因此本試驗采用開殼后溫水浸泡4 h的種子處理方式。

圖1種子處理方式對相對發(fā)芽率的影響

2.2開殼處理后誘變時間和EMS濃度對瓠瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2.1誘變時間對瓠瓜種子發(fā)芽率的影響本研究中對照（CK）的實際發(fā)芽率隨處理時間的增加表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢（表1），在8 h時達(dá)到發(fā)芽率最高，為90.67%，說明種子的發(fā)芽率受浸種時間的影響較大。因此，為排除類似因素的干擾，真實地反映EMS的影響，本試驗采用50%的相對發(fā)芽率作為半致死劑量的評價指標(biāo)。

表1同一濃度下不同誘變時間對瓠瓜種子發(fā)芽率的影響

當(dāng)濃度小于1.5%時，誘導(dǎo)2 h和4 h的相對發(fā)芽率與對照差異不明顯；濃度為2%時，誘導(dǎo)4 h、8 h 和12 h的相對發(fā)芽率與對照差異明顯；EMS濃度≥3%時，4個誘導(dǎo)時間的相對發(fā)芽率與對照都有明顯差異，表明濃度和時間都會影響種子的相對發(fā)芽率，濃度一定，誘變時間增加，種子的相對發(fā)芽率降低。本試驗中，在所有EMS濃度下，4 h和8 h處理間差異顯著，而8 h和12 h間差異不顯著，表明濃度不變，誘變時間增加到8 h后，種子相對發(fā)芽率趨于穩(wěn)定。本研究中，相對發(fā)芽率為40%～50%的誘變時間幾乎都是8 h和12 h，為提高實際發(fā)芽率，選擇8 h作為最佳誘變時間。

2.2.2EMS濃度對瓠瓜種子發(fā)芽率的影響圖1表明，誘變時間為2 h，0.8%、1%和1.5%濃度的EMS處理后種子相對發(fā)芽率分別為117.46%、115.99%、106.67%，明顯高于對照，表明低濃度EMS短時間誘變后可適當(dāng)提高種子發(fā)芽率；隨著EMS濃度的增加，種子相對發(fā)芽率逐漸降低，EMS濃度達(dá)到4.5%誘變12 h時，相對發(fā)芽率仍可達(dá)到15.65%，說明本試驗所用瓠瓜種子對EMS有較高的耐受性。誘變時間為4 h，2%、3%、4.5%濃度的EMS處理后種子相對發(fā)芽率與對照差異顯著，相對發(fā)芽率分別為79.44%、54.27%、34.35%；誘變時間為8 h，所有濃度處理都與對照差異顯著，但1%～3%濃度的EMS處理間的差異不顯著，相對發(fā)芽率在45%左右；誘變時間為12 h，所有濃度處理都與對照差異顯著，濃度在0.8%～3%各處理之間的差異不顯著，相對發(fā)芽率在45%左右。上述結(jié)果顯示，在同一EMS誘變濃度處理下，誘變時間增加，種子發(fā)芽率顯著降低，但隨著誘變時間的增加，瓠瓜種子對EMS濃度變化敏感度下降，因此在致死率基本穩(wěn)定的情況下，可以適當(dāng)增加EMS濃度以提高后代的變異率。

2.2.3篩選種子半致死劑量的最佳處理組合本研究中開殼的24個濃度/時間處理組合中，有8個處理組合的相對發(fā)芽率都在44%～54%，分別為：0.8%-12 h，1%-12 h，1.5%-12 h，2%-12 h，1%-8 h，1.5%-8 h，2%-8 h，3%-4 h。表明1%～2%濃度的EMS為瓠瓜誘變的適宜濃度，在此濃度范圍內(nèi)，誘變8～12 h可達(dá)到半致死劑量，提高濃度需要相應(yīng)縮短誘變時間。綜合分析認(rèn)為，8 h為最佳誘變時間。因此，為保證后代的變異率和存活率，本研究選擇種子開殼后溫水浸種4 h后，采用濃度為1.5% 的EMS誘變處理8 h為最佳誘變條件。

圖1相同時間不同EMS濃度對瓠瓜種子發(fā)芽率的影響

3 討論

確定適宜的EMS濃度和誘變時間是化學(xué)誘變中獲得最佳突變頻率、提高變異率、得到理想突變體的關(guān)鍵。通常情況以半致死濃度作為標(biāo)準(zhǔn)，一般以50%的種子發(fā)芽率作為半致死濃度的指標(biāo)。處理濃度和時間是影響種子發(fā)芽率的主要因素，為避免其他因素干擾，本試驗將相對發(fā)芽率作為確定半致死濃度的依據(jù)。EMS最佳濃度與材料自身的性質(zhì)直接相關(guān)，小麥、水稻、番茄等作物成功構(gòu)建突變體庫的誘變濃度都在1%左右［18-21］，擬南芥這種株型小、種子小的植物誘變濃度較低，構(gòu)建擬南芥突變體庫的適宜濃度是0.25%～0.5%［22-23］。水稻和小麥都有較硬的外殼，且水分滲透需要較長的時間，所以需要的誘變濃度相對較高，而擬南芥種皮較薄，幾乎不能阻止水分的滲透，所以需要的濃度相對較低。瓠瓜種子大，種殼厚，浸種20 h后，1%的EMS誘變12 h相對發(fā)芽率與對照沒有顯著差異，而開殼后再進(jìn)行誘變處理，1%的EMS誘變12 h相對發(fā)芽率已經(jīng)降到46%左右。王學(xué)征等［16］在誘變西瓜時也采用了種子開殼的方式，確定EMS處理濃度1.0%、誘變時間9 h為最佳誘變條件。本研究發(fā)現(xiàn)，EMS處理濃度在一定范圍內(nèi)變化時，相對發(fā)芽率差異不顯著，表明瓠瓜種子對EMS誘變的敏感度較低，在此濃度范圍內(nèi)選擇較高濃度處理會增加突變頻率和變異率。葫蘆科作物中，甜瓜種子同樣表現(xiàn)出對EMS的低敏感性，在1%～3%的EMS處理濃度范圍內(nèi)發(fā)芽率都在97%以上［24］。黃瓜對EMS的敏感性可能存在品種差異，如黃瓜‘Poinsett76’在2.5%的濃度下，發(fā)芽率保持在85%左右［15］，而‘Be?it Alpha’在0.75%的濃度下，發(fā)芽率已經(jīng)降低到40%［25］。王軍偉等［26］研究證實不同品種烤煙對EMS的誘變敏感性不同?？梢?，基因差異也可影響突變效率和突變頻率。

通常瓠瓜開殼后浸種催芽種子發(fā)芽率會降低，多數(shù)研究結(jié)果顯示，EMS處理會影響種子的萌發(fā)，但本研究中低濃度、短時間的誘變可以適當(dāng)增加開殼瓠瓜種子的發(fā)芽率。早在1989年，李學(xué)寶和楊學(xué)榮［27］就報道低濃度的EMS對水稻種子的發(fā)芽勢及幼苗的生長發(fā)育有促進(jìn)作用，進(jìn)一步研究證實，低劑量的EMS可以刺激呼吸，提高細(xì)胞色素氧化酶和α-淀粉酶活性，從而促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長［28-29］?；粞跑暗龋?0］對箭筈豌豆的研究中也證實短時間的EMS處理可以促進(jìn)幼苗的生長。相反，高劑量的EMS會對細(xì)胞造成嚴(yán)重的生理損傷,且這種損傷在短期內(nèi)不能完全修復(fù)，植株后期的生長發(fā)育會受到抑制。因此，在半致死劑量范圍內(nèi)選擇低濃度、短時間EMS處理可以提高植株存活率，保證有更多的突變遺傳給后代。

突變體庫的建立可以為瓠瓜的新品種選育提供豐富的突變資源，推進(jìn)瓠瓜重要性狀基因的研究。EMS誘變條件的確定是構(gòu)建突變體庫的第一步，目前EMS對瓠瓜后代的誘變效應(yīng)以及突變體的篩選還處于探索研究階段，以50%的發(fā)芽率為指標(biāo)確定誘變濃度能否獲得滿意的變異率還有待進(jìn)一步的試驗證明。

4 結(jié)論

開殼處理可以顯著提高瓠瓜種子對EMS的敏感性，相對發(fā)芽率由不開殼的99%降低到46%；低濃度EMS短時間處理開殼后的種子可明顯提高種子發(fā)芽率；隨著EMS處理濃度和時間的增加，相對發(fā)芽率降低，同一濃度，誘變時間達(dá)到8 h后，繼續(xù)誘變導(dǎo)致相對發(fā)芽率變化趨緩；隨著誘變時間的增加，不同濃度間差異顯著性降低。綜合分析，筆者認(rèn)為瓠瓜種子最佳EMS誘變條件為：開殼后溫水浸種4 h進(jìn)行EMS誘變，半致死濃度為1%～2%，處理時間為8 h。

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·書訊·

《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所主持編寫，并得到了全國甜瓜科研、教學(xué)和生產(chǎn)單位的大力支持。甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的制定是國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺建設(shè)的重要內(nèi)容，共分三大部分，其中甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范規(guī)定了甜瓜種質(zhì)資源的描述符及其分級標(biāo)準(zhǔn)，以便對甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整理和數(shù)字化表達(dá)。甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甜瓜種質(zhì)資源各描述符的字段名稱、類型、長度、小數(shù)位、代碼等，以便建立統(tǒng)一的、規(guī)范的甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫。甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范規(guī)定了甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)采集全過程中的質(zhì)量控制內(nèi)容和質(zhì)量控制方法，以保證數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性、可比性和可靠性。

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Screening optimal condition of mutagenesis with EMS for bottle gourd (Lagenaria siceraria)seed

KANG Baoshan,LI Junxiang,LIU Lifeng,GU Qinsheng
(Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,Henan,China)

The mutagenesis study was carried out with the bottle gourd seeds of‘Ansheng’in order to construct gourd mutant population.To screen the optimal condition of ethyl methanesulfonate(EMS),we analyzed the effect of the method of treatment for seed coat,the concentration and treatment time of EMS on seed germination rate.It was found the sensitivity to EMS was improved significantly when seed coat was opened.Therefore,under the condition of opening coat,we set up six different concentrations of EMS(0.8%,1%,1.5%,2%,3%and 4.5%)and four different induced times(2,4,8 and 12 h)to analyze the seed relative germination in 24 different combinations of concentration and time.The results showed that the relative germination rate was reduced when the inducing time increased at the same concentration.But exceeding over 8 h, the effect was significant.In the same time,the relative germination rate was reduced with increasing EMS concentration.In this study,the optimum treatment with EMS mutagenesis was that the coat opened gourd seeds are soaked in warm water for 4 h,then treated with 1.5%of EMS for 8 h,the median lethal concentration was 1%-2%.

Lagenaria siceraria var.hispida;Seed;EMS;Mutagenesis

2016-09-14；

：2016-12-20

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目（152300410232）；國家現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病毒病害防控崗位(CARS-26-13)；中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610192017704）

康保珊，女，副研究員，主要研究方向為植物抗病性遺傳學(xué)。E-mail:kangbaoshan@caas.cn

古勤生，男，研究員，主要研究方向為植物病理學(xué)。E-mail:guqinsheng@caas.cn