檳榔內(nèi)生真菌的分離與初步鑒定

宋薇薇,牛曉慶,余鳳玉,朱 輝,唐慶華,覃偉權(quán)

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 椰子研究所,海南 文昌 571339)

檳榔內(nèi)生真菌的分離與初步鑒定

宋薇薇,牛曉慶,余鳳玉,朱 輝,唐慶華,覃偉權(quán)*

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 椰子研究所,海南 文昌 571339)

為了解檳榔內(nèi)生真菌的多樣性,采用組織塊培養(yǎng)法從檳榔根、葉、花中分離純化得到47株內(nèi)生真菌,同時(shí)對(duì)這些菌株進(jìn)行了rDNA-ITS序列擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明:所得內(nèi)生真菌分屬于8個(gè)屬,包括青霉屬(Penicillium)、鐮孢屬(Fusarium)、葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)、彎孢霉屬(Curvularia)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum)。其中,青霉屬(Penicillium)和鐮孢屬(Fusarium)為優(yōu)勢(shì)菌屬,這2個(gè)屬的內(nèi)生菌株數(shù)分別占分離菌株總數(shù)的31.91%和27.66%。

檳榔;內(nèi)生真菌;分離；鑒定; rDNA-ITS序列;系統(tǒng)發(fā)育分析

檳榔(ArecacatechuL.)為棕櫚科(Palmaceae)檳榔屬(Areca)常綠喬木,原產(chǎn)于東南亞,主產(chǎn)于印度、巴基斯坦、馬來(lái)西亞、印度尼西亞、泰國(guó)和中國(guó)等國(guó)家。在我國(guó),檳榔產(chǎn)區(qū)主要集中在海南省,產(chǎn)量約占總產(chǎn)量的95%以上(未計(jì)中國(guó)臺(tái)灣省)。除作為熱帶園林綠化樹種外,檳榔還具有重要的藥用價(jià)值,位居中國(guó)四大南藥(檳榔、砂仁、益智、巴戟)之首,其果實(shí)、種子、皮、花均可入藥。目前,檳榔產(chǎn)業(yè)已成為海南省僅次于橡膠的第二大支柱產(chǎn)業(yè),是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中主要的栽培作物之一,發(fā)展前景十分廣闊[1-2]。經(jīng)國(guó)家批準(zhǔn),檳榔在海南省被列入生態(tài)經(jīng)濟(jì)林樹種,主要分布于海南省東部、中部和南部山區(qū)。

植物內(nèi)生菌是一類生活于植物組織、器官內(nèi)部的微生物,其生活史的一定階段或全部階段在健康植物的各種組織、器官的活細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙完成,屬于植物組織內(nèi)的正常菌群。被內(nèi)生菌感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥,可通過組織學(xué)方法從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來(lái)證明其內(nèi)生[3]。內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中,并與寄主協(xié)同進(jìn)化,在演化過程中形成了互利共生關(guān)系。研究表明,感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長(zhǎng)快速、抗逆境、抗病害、抗動(dòng)物危害等優(yōu)勢(shì),比未感染植株更具有生存競(jìng)爭(zhēng)力[4]?，F(xiàn)已在多種灌木、草本植物、栽培作物、果樹、苔蘚和蕨類植物中發(fā)現(xiàn)并分離了大量?jī)?nèi)生菌。目前,關(guān)于檳榔的研究主要集中在其自身化學(xué)有效成分等方面,而有關(guān)檳榔內(nèi)生菌分離鑒定的研究報(bào)道很少。Liu A R等[5]在研究海南內(nèi)生擬盤多毛孢屬真菌時(shí),從檳榔樹中分離到1株P(guān)estalotiopsisphotiniae(石楠擬盤多毛孢)。謝穎等[6]在篩選香蕉枯萎病拮抗內(nèi)生菌時(shí),從檳榔組織中分離到8株內(nèi)生菌,其中真菌6株、細(xì)菌2株,但未做菌株鑒定。為了發(fā)掘更多的內(nèi)生菌資源,我們對(duì)檳榔的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定,初步探討了其多樣性,以期為檳榔內(nèi)生菌在植物病害防治中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檳榔材料 自萬(wàn)寧市三更羅鎮(zhèn)檳榔園采集健康、無(wú)病蟲的檳榔根、葉、花組織,用于內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 主要試劑和儀器 真菌基因組DNA提取試劑盒、PCR MasterMix購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(Solarbio);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。PCR儀為Takara PCR Cycler Dice TP650;核酸電泳儀為北京六一儀器制造廠產(chǎn)品;離心機(jī)為Eppendorf公司生產(chǎn)的Sentrifage5810;凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Gene公司的產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL, pH自然；于121 ℃下滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離和純化 取健康檳榔的根、葉、花樣品，用自來(lái)水沖洗干凈,晾干備用。采用組織塊分離法,分離時(shí)將各組織剪成2 cm左右的小段,然后按常規(guī)無(wú)菌操作進(jìn)行表面消毒:用75%酒精浸泡1～2 min,用0.1%升汞消毒3～5 min,用無(wú)菌水沖洗4～5次,用滅菌濾紙吸干多余水分,最后用無(wú)菌解剖刀將材料切成約0.5 cm× 0.5 cm的小塊。將上述組織塊置于PDA平板培養(yǎng)基上,在25 ℃下恒溫培養(yǎng)。將最后一次沖洗組織塊后的無(wú)菌水作為對(duì)照,以驗(yàn)證消毒效果[7-8]。

待組織塊邊緣長(zhǎng)出菌絲后,挑取邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA培養(yǎng)基上,待菌落長(zhǎng)成后,再挑取邊緣菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接；如此反復(fù)純化4～5次后,轉(zhuǎn)接到PDA斜面上,在4 ℃下保藏備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌DNA的提取和rDNA-ITS序列的擴(kuò)增 采用真菌基因組DNA提取試劑盒,提取菌株的總DNA。以提取的總DNA為模板,采用真菌rDNA-ITS區(qū)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和ITS2(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR反應(yīng)體系(50 μL):2×MasterMix 25 μL、ITS1(10 μmol/L) 2.5 μL、ITS2(10 μmol/L) 2.5 μL、DNA模板2.5 μL,用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,10 ℃ 5 min。

1.2.3 內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將檢測(cè)到目的條帶的樣品送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序。

將所得各菌株的rDNA-ITS序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,尋找相似性較高的序列,進(jìn)行菌株鑒定。進(jìn)一步選取分離所得的不同屬的內(nèi)生真菌,下載其在GenBank中最相近的同源序列。將菌株的rDNA-ITS序列用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并匹配排序；應(yīng)用MEGA 5.1軟件,采用鄰接法(Neighbour-Joining method),以1000為重復(fù)值進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

通過分離純化,從健康檳榔組織中共獲得內(nèi)生真菌47株,其中,來(lái)源于根、葉、花的內(nèi)生真菌菌株分別為10、31、6株,見圖1。對(duì)照平板經(jīng)25 ℃培養(yǎng)5～7 d后,培養(yǎng)基上無(wú)明顯菌落長(zhǎng)出,表明試驗(yàn)材料表面已消毒徹底。

2.2 菌株rDNA-ITS序列的擴(kuò)增與測(cè)序

對(duì)分離出的檳榔內(nèi)生真菌進(jìn)行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示,擴(kuò)增序列條帶在600 bp左右,見圖2。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后,直接送往上海生工測(cè)序。47株檳榔內(nèi)生真菌均獲得了測(cè)序結(jié)果。

2.3 檳榔內(nèi)生真菌的鑒定

經(jīng)過測(cè)序,將所獲得的47株檳榔內(nèi)生真菌rDNA-ITS片段和GenBank中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì),查找與其同源性較高的菌株,最終確定檳榔內(nèi)生真菌屬于8個(gè)屬,分別為青霉屬(Penicillium)、鐮孢屬(Fusarium)、葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)、彎孢霉屬(Curvularia)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum),表明檳榔內(nèi)生真菌具有一定的生物多樣性。結(jié)果見表1。

由表1可見:在所分離的47株檳榔內(nèi)生真菌中,青霉屬(Penicillium)和鐮孢屬(Fusarium)為優(yōu)勢(shì)菌屬,分別占分離菌株總數(shù)的31.91%和27.66%;其次是葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta),占總株數(shù)的21.28%;而枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum)各只有1株,均只占總株數(shù)的2.13%。

2.4 檳榔部分內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

選取BLJ-1、BLJ-16、BLJ-29、BLJ-39、BLJ-42、BLJ-44、BLJ-46、BLJ-47共8株來(lái)源于不同屬內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列及在GenBank中與其同源性最高的序列(表2),采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。

如圖3所示,選取的菌株均與其在GenBank中的同源菌株同處系統(tǒng)發(fā)育樹的一個(gè)分支,遺傳距離很近,表明這8株內(nèi)生真菌可以歸類到Fusarium、Acremonium、Colletotrichum、Nigrospora、Curvularia、Exserohilum、Penicillium和Phyllosticta。此外,FusariumBLJ-16和AcremoniumBLJ-46，CurvulariaBLJ-39和ExserohilumBLJ-47，PenicilliumBLJ-1和PhyllostictaBLJ-29這3對(duì)不同屬的真菌序列間分別顯示了較高的一致性,可能來(lái)源于遺傳距離較近的類群。

表1 檳榔內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

注:分離比例指分離純化的菌株占全部分離菌株的百分比。

圖1 部分檳榔內(nèi)生真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

菌株編號(hào)片段長(zhǎng)度/bp同源菌株序列號(hào)一致性/%BLJ-1581Penicilliumsp.FJ008995.199BLJ-16569FusariumoxysporumKJ562373.199BLJ-29649PhyllostictaaloeicolaKR183768.198BLJ-39598Curvulariasp.JQ783059.199BLJ-42561NigrosporasphaericaKM921666.199BLJ-44586ColletotrichumgloeosporioidesKT390195.1100BLJ-46581AcremoniumsclerotigenumKT878352.199BLJ-47613Exserohilumsp.JN207305.199

3 結(jié)論與討論

近年來(lái),植物內(nèi)生菌由于能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物,在自然界中具有重要的生態(tài)學(xué)作用,不僅可以為植物提供所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還參與植物的防衛(wèi)功能,可以增強(qiáng)植物的抗逆境、抗病害能力,因此已經(jīng)成為當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)。

內(nèi)生菌普遍存在于各種水生和陸生植物中,表現(xiàn)出豐富的群落多樣性。通常,從1種植物中可分離到的內(nèi)生菌為數(shù)種至數(shù)十種,有的甚至多達(dá)數(shù)百種。Melnick等[9]從可可的葉、果莢、枝和花中分離獲得69株內(nèi)生細(xì)菌,劃分為5屬15個(gè)種群。鄭艷等[10]分離得到內(nèi)生菌129株,其中內(nèi)生真菌4屬、6種、58株,優(yōu)勢(shì)屬為鐮刀菌屬(Fusarium);內(nèi)生細(xì)菌3屬、9種、71株,芽孢桿菌屬Bacillus為優(yōu)勢(shì)屬。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生菌在植物根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等組織和器官內(nèi)均有分布,其分布情況取決于宿主植物本身以及內(nèi)生菌的種類,在宿主植物不同器官的分布存在差異[4,11]。為了揭示檳榔內(nèi)生真菌的多樣性,本研究通過分離和鑒定,從檳榔根、葉和花中共得到47株檳榔內(nèi)生真菌,其中大部分菌株來(lái)源于葉部,共31株,而從根、花中分別只獲得10株和6株；初步將分離的檳榔內(nèi)生真菌菌株歸類到8個(gè)屬,即青霉屬(Penicillium)、鐮孢屬(Fusarium)、葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)、彎孢霉屬(Curvularia)、黑孢屬(Nigrospora)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、枝頂孢屬(Acremonium)和突臍蠕孢屬(Exserohilum)。其中,青霉屬(Penicillium)和鐮孢屬(Fusarium)為優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬。以上結(jié)果表明,檳榔中內(nèi)生真菌存在著較為豐富的生物多樣性,它們可能是檳榔內(nèi)生菌的重要組成部分。本研究結(jié)果不但豐富了檳榔內(nèi)生菌資源,也為今后檳榔內(nèi)生菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論參考。

M: DL2000 Marker; 1～10:部分內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增條帶。

圖2 檳榔部分內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖3 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的部分檳榔內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

由于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)普遍存在,其種類和數(shù)量常受到地域、品種、采樣時(shí)期、采樣部位、培養(yǎng)基等因素的影響，因此本研究只采集了檳榔的根、葉和花進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離,采集樣本數(shù)量和采樣地點(diǎn)均有限,分離的內(nèi)生真菌種類可能會(huì)受到一定的限制,這也可能是本研究未分離到擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)真菌[5]的原因之一。此外,有些內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)或?qū)ε囵B(yǎng)基具有選擇特異性；本實(shí)驗(yàn)以PDA培養(yǎng)基為分離純化培養(yǎng)基,可能造成某些內(nèi)生菌株未被分離出來(lái)[6,12]。總的來(lái)說(shuō),本研究結(jié)果在一定程度上反映了檳榔內(nèi)生菌的多樣性。今后有必要增加采樣點(diǎn)、采樣部位、培養(yǎng)基種類等來(lái)獲得更多的內(nèi)生菌資源；而關(guān)于檳榔優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌的功能等方面也有待于今后進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Isolation and Preliminary Identification of Endophytic Fungi from Arecanut (Arecacatechu)

SONG Wei-wei, NIU Xiao-qing, YU Feng-yu, ZHU Hui, TANG Qing-hua, QIN Wei-quan*

(Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China)

In order to understand the diversity of endophytic fungi in arecanut (ArecacatechuL.), we used tissue block culture method to isolate and identify 47 endophytic fungal strains from the root, leaf and flower of arecanut, amplified the rDNA-ITS sequence of these strains, and constructed their phylogenetic tree. The results showed that the obtained 47 endophytic fungal strains belonged to 8 genera, includingPenicillium,Fusarium,Phyllosticta,Curvularia,Nigrospora,Colletotrichum,AcremoniumandExserohilum. Among these genera,PenicilliumandFusariumwere the dominant genera, and the endophytic fungal strains in these 2 genera accounted for 31.91% and 27.66% of total isolated strains, respectively.

Arecanut; Endophytic fungi; Isolation; Identification; rDNA-ITS sequence; Phylogenetic analysis

2017-02-22

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“內(nèi)生菌對(duì)檳榔黃化病發(fā)生危害的影響”(314144);海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“檳榔拮抗內(nèi)生菌 資源的篩選與利用”(ZDYF2016058)。

宋薇薇(1981─),女,助理研究員,博士,從事熱帶經(jīng)濟(jì)作物病害生物防治研究。*通訊作者:覃偉權(quán)。

S792.91

A

1001-8581(2017)06-0066-04