不同激素濃度配比對(duì)竹葉石斛種子快繁的影響

周年英，蔣雙林，黃翠娥，王業(yè)鵬，肖 杰，李麗娜

(湖北省天門市綠色食品管理辦公室，湖北 天門 431700)

不同激素濃度配比對(duì)竹葉石斛種子快繁的影響

周年英，蔣雙林，黃翠娥，王業(yè)鵬，肖 杰，李麗娜

(湖北省天門市綠色食品管理辦公室，湖北 天門 431700)

以竹葉石斛(DendrobiumhancockiiRolfe)的成熟種子為實(shí)驗(yàn)材料，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，研究了不同濃度激素配比對(duì)竹葉石斛的原球莖增殖分化和生根壯苗培養(yǎng)的影響，以期建立竹葉石斛的種子快繁技術(shù)，結(jié)果表明：竹葉石斛成熟種子在1/2MS萌發(fā)培養(yǎng)基中，45 d即可出現(xiàn)大量原球莖，種子萌發(fā)率高達(dá)95%；在原球莖分化階段，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，50 d左右即可分化成小植株；在生根壯苗培養(yǎng)階段，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，45 d左右組培苗長(zhǎng)到3 cm以上，根的條數(shù)為2條以上，葉2片以上。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行竹葉石斛種子快速繁殖，以1/2MS為基本培養(yǎng)，從種子萌發(fā)到無菌苗生根并達(dá)到煉苗移栽要求所需的時(shí)間在150 d以內(nèi)，這大大加快了竹葉石斛種子繁殖速度，為竹葉石斛的快速生產(chǎn)提供了便利。

竹葉石斛；種子快繁；激素濃度；生根培養(yǎng)

竹葉石斛又名細(xì)葉石斛(DendrobiumhancockiiRolfe)，蘭科石斛屬，多年生附生草本，是傳統(tǒng)名貴中藥材，具有生津養(yǎng)胃、潤(rùn)肺止咳、增強(qiáng)人體免疫力等功效，故有極高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，竹葉石斛的觀賞價(jià)值極高，其花姿優(yōu)雅、玲瓏可愛、花色鮮艷、氣味芳香，被喻為“四大觀賞洋花”之一，既可作切花，也可盆栽觀賞。竹葉石斛的種子非常細(xì)小，自然繁殖率極低，而傳統(tǒng)的分株繁殖和扦插繁殖方法速度較慢，因此難以滿足市場(chǎng)需求。野生竹葉石斛被濫采濫挖，自然資源稀缺。因此，為了高效利用和保護(hù)竹葉石斛，本實(shí)驗(yàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)竹葉石斛進(jìn)行快速繁殖，探討了竹葉石斛種子無菌培養(yǎng)的方法和條件，旨在為工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得大量繁殖種苗的有效途徑，目前研究利用較多、較為系統(tǒng)的是鐵皮石斛，而關(guān)于竹葉石斛的組織培養(yǎng)技術(shù)卻未見系統(tǒng)報(bào)道。鐵皮石斛用于組培的外植體有種子[1]、莖段[2-4]、葉[5]、根[6-7]等。宋順等[8]研究了在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的激素對(duì)鐵皮石斛的誘導(dǎo)、增殖、分化以及生根的影響，并篩選出每個(gè)階段的最佳培養(yǎng)基。但是在竹葉石斛組織培養(yǎng)方面未見相關(guān)報(bào)道。本文以竹葉石斛成熟種子為實(shí)驗(yàn)材料，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，研究不同濃度激素配比對(duì)竹葉石斛的原球莖增殖分化和生根壯苗培養(yǎng)的影響，從而建立一條快速、高效的竹葉石斛種子快繁技術(shù)，為竹葉石斛工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

竹葉石斛未開裂的成熟果莢。培養(yǎng)基均含蔗糖30 g/L、瓊脂粉7 g/L、pH值調(diào)至5.8，在121 ℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 在超凈工作臺(tái)中，先用75%酒精擦拭果莢表面，0.1%升汞處理10 min，無菌水沖洗3～5次，最后用無菌濾紙吸干果莢表面的水分，取出種子并均勻接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，撒上薄薄的一層即可。種子萌發(fā)培養(yǎng)基分別為MS和1/2MS。

培養(yǎng)條件為：25 ℃，2000 lx，12 h/d。

1.2.2 原球莖增殖、分化培養(yǎng) 取無菌的竹葉石斛的原球莖接種于添加了不同濃度的6-BA和NAA的1/2MS基本培養(yǎng)基中，具體組合1～7如下：(1)1/2MS；(2)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L；(3)1/2MS+NAA 0.2 mg/L；(4)1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；(5)1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；(6)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；(7)1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。

培養(yǎng)條件為：25 ℃，2000 lx，12 h/d。觀察不同濃度的6-BA和NAA對(duì)竹葉石斛分化培養(yǎng)的影響。

1.2.3 生根壯苗培養(yǎng) 將誘導(dǎo)分化獲得的竹葉石斛無菌苗接種于以下生根壯苗培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。生根壯苗培養(yǎng)基如下：(1)1/2MS；(2)1/2MS+NAA 0.1 mg/L；(3)1/2MS+NAA 0.5 mg/L；(4)1/2MS+NAA 0.7 mg/L。

培養(yǎng)條件為：25 ℃，2000 lx，12 h/d。觀察實(shí)驗(yàn)過程中不同培養(yǎng)基中竹葉石斛的生根情況并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 煉苗移栽 待無菌苗長(zhǎng)到3 cm以上，根數(shù)在2條以上，即可進(jìn)行煉苗移栽。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)鄧肯氏新復(fù)極差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖誘導(dǎo)

1/2MS萌發(fā)培養(yǎng)基中的竹葉石斛種子，大約第45 d從黃色轉(zhuǎn)為綠色，出現(xiàn)1～3 mm的原球莖(圖1)，并且種子的萌發(fā)率高達(dá)95%。而在MS萌發(fā)培養(yǎng)基中的萌發(fā)率為80%(圖2)。

圖1 萌發(fā)培養(yǎng)階段

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)竹葉石斛種子萌發(fā)率的影響

2.2 原球莖增殖與分化

待萌發(fā)培養(yǎng)基中的竹葉石斛出現(xiàn)1～3 mm的原球莖即可在無菌條件下轉(zhuǎn)接到原球莖分化培養(yǎng)基中，原球莖的增殖與芽分化同時(shí)進(jìn)行。由圖3可知，7種培養(yǎng)基都能分化出小植株，其中1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基的分化效果最佳，平均芽數(shù)為4.24個(gè)，同時(shí)獲得小植株的時(shí)間較其他培養(yǎng)基獲得的時(shí)間短10 d左右，原球莖在培養(yǎng)50 d左右即可分化成小植株(圖4)。

2.3 生根壯苗

將試管苗接種于生根壯苗培養(yǎng)基，結(jié)果見表1，發(fā)現(xiàn)添加一定濃度NAA培養(yǎng)基的生根率高于未添加NAA的培養(yǎng)基，分別添加0.5、0.7 mg/L NAA的1/2MS培養(yǎng)基的生根率與未添加NAA的培養(yǎng)基之間都存在顯著性差異。并且發(fā)現(xiàn)1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8～6.0培養(yǎng)基的效果最佳，生根率達(dá)到100%，大約25 d小苗的莖節(jié)上開始出現(xiàn)根的分化，50 d左右組培苗長(zhǎng)到3 cm以上，根的條數(shù)為2條以上，根系粗壯，植株葉色濃綠、生長(zhǎng)健壯(圖5)。

圖3 不同濃度激素及配比對(duì)竹葉石斛的分化能力的影響

圖4 分化培養(yǎng)階段

圖5 生根培養(yǎng)階段

基本培養(yǎng)基NAA濃度/(mg/L)接種苗數(shù)生根數(shù)生根率/%1/2MS0958690.53b0.1918694.51ab0.5929097.83a0.79797100.00a

注:同列不同小寫字母表示差異顯著達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.4 煉苗移栽

當(dāng)竹葉石斛無菌苗長(zhǎng)到3 cm以上，根數(shù)大于2～3條，根系長(zhǎng)于2 cm時(shí)，基本上是在試管苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基大約50 d的時(shí)候即可進(jìn)行室內(nèi)煉苗(圖6)。具體操作如下：首先讓無菌苗在自然光條件下煉苗7 d，然后先半打開封口膜1 d，再完全開瓶煉苗2 d后，再開始進(jìn)行移栽。移栽前，用鑷子先將苗輕輕取出，盡量不要傷到根系，用清水洗凈無菌苗根部殘留的培養(yǎng)基，再用0.1 mg/L NAA的水溶液進(jìn)行蘸根3～5 min，然后移栽至裝有基質(zhì)(草炭∶木屑=1∶2)的營(yíng)養(yǎng)缽中，澆透水后罩上塑料膜進(jìn)行保溫保濕。7 d后撤去塑料膜，并逐漸加大通風(fēng)、增強(qiáng)光照。注意通風(fēng)和溫濕度的控制，濕度控制在70%～85%，溫度為20～28 ℃。1個(gè)月后成活率高達(dá)90%(圖7)。

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過組織培養(yǎng)技術(shù)快速獲得石斛再生植株的途徑有2種：一是以成熟的種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得完整植株；二是通過莖段、莖尖、葉片等誘導(dǎo)形成叢生芽或擬原球莖來實(shí)現(xiàn)快繁[9]。影響石斛組織培養(yǎng)的因素主要有培養(yǎng)基類型、pH、激素配比和添加物、培養(yǎng)溫度等[10-11]。鐵皮石斛原球莖增殖分化可以以1/2MS、MS等作為基本培養(yǎng)基[12-13]。蔣波等對(duì)鐵皮石斛原球莖生長(zhǎng)分化及生根壯苗的研究表明：培養(yǎng)基中不同濃度激素配比是影響原球莖增殖和分化的關(guān)鍵因素，原球莖的增殖以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L或1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L這2種培養(yǎng)基為佳，其原球莖的增殖系數(shù)較大；原球莖的分化以1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L或1/2MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為佳[14]。而鄭志仁等研究表明，鐵皮石斛原球莖增殖與分化的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+10%土豆汁[15]。王一諾等研究了不同濃度激素配比對(duì)重唇石斛組織培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明：重唇石斛的最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最佳繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+KT 0.2 mg/L+AC 1.0 mg/L，最優(yōu)生根壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 1.0 mg/L，生根率達(dá)到90%以上[16]。

圖6 煉苗移栽

圖7 移栽成活

本實(shí)驗(yàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行竹葉石斛種子的快速繁殖，在1/2MS種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，45 d即可出現(xiàn)大量原球莖，種子萌發(fā)率高達(dá)95%。在原球莖分化階段，50 d左右即可分化成小植株，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，這與莫昭展等[17]的研究結(jié)果不同。原球莖增殖與分化是同步進(jìn)行的，這與王麗萍等[18]研究結(jié)果一致。在生根壯苗培養(yǎng)階段，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.7 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8～6.0，45 d左右組培苗長(zhǎng)到3 cm以上，根的條數(shù)為2條以上，葉2片以上。

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

Effects of Different Concentrations of Hormone Combinations on Seed Rapid Propagation ofDendrobiumhancockii

ZHOU Nian-ying, JIANG Shuang-lin, HUANG Cui-e, WANG Ye-peng, XIAO Jie, LI Li-na

(Green Food Management Office of Tianmen City, Hubei Province, Tianmen 431700, China)

Using the mature seeds ofDendrobiumhancockiiRolfe as experimental materials, taking 1/2MS as basic culture medium, we studied the effects of different concentrations of hormone combinations on the differentiation, propagation and rooting ofD.hancockiiprotocorms, in order to establish a rapid seed propagation technique system. The results showed that it just needed 45 days to appear a large number of protocorms when the mature seeds ofD.hancockiigerminated in 1/2MS medium, and the rate of seed germination reached 95%. In protocorm differentiation phase, the best medium was 1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+ sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L (pH 5.8), and it needed only about 50 days for protocorm to differentiate into plantlets. The best rooting medium was 1/2MS+NAA 0.7 mg/L+ sucrose 30 g/L+ agar 7 g/L (pH 5.8); after rooting culture for 45 days or so, the plantlets grew to 3 cm, the number of roots exceeded 2, and the number of leaves was more than 2. When the seeds ofD.hancockiiwere propagated under the above optimum culture medium conditions, the duration from germination of seeds to formation of healthy and strong plantlets was within 150 days, which could provide convenience for the rapid production ofD.hancockii.

Dendrobiumhancockii; Seed rapid propagation; Concentration of hormone; Rooting culture

2017-02-09

湖北省省級(jí)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(鄂財(cái)農(nóng)發(fā)[2015]44號(hào))。

周年英(1990─)，女，農(nóng)藝師，從事組織培養(yǎng)、“三品一標(biāo)”認(rèn)證開發(fā)與推廣以及蔬菜生產(chǎn)管理。

S682.31

A

1001-8581(2017)06-0044-05