蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能和非特異性免疫力的影響

張海濤，高峰，李云龍，顧開朗

（徐州生物工程職業(yè)技術學院動物工程系，江蘇徐州221006）

資源開發(fā)利用

蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能和非特異性免疫力的影響

張海濤，高峰*，李云龍，顧開朗

（徐州生物工程職業(yè)技術學院動物工程系，江蘇徐州221006）

在含有蠅蛆粉的基礎飼料中添加0%、0.025%、0.050%、0.100%、0.200%和0.400%的甲殼素酶，制成6種等氮等能的飼料（分別記為E1、E2、E3、E4、E5、E6組），飼養(yǎng)泥鰍50 d，通過比較各飼料組泥鰍的生長性能和形體指標，研究蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能和非特異性免疫力的影響。試驗結果表明：飼料中添加0.025%～0.100%甲殼素酶可提高泥鰍的增重率（WGR）和特定生長率（SGR）（P＜0.05），降低飼料系數(shù)（FCR）（P＜0.05），其中0.100%組WGR和SGR最高，F(xiàn)CR最低。飼料中添加甲殼素酶對泥鰍的成活率（SR）、內(nèi)臟指數(shù)（VSI）、肥滿度（CF）和空殼率（DOR）無顯著影響（P＞0.05）。飼料中添加0.050%～0.100%甲殼素酶可顯著提高泥鰍肝臟和血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性（P＜0.05）；飼料中添加0.025%～0.100%甲殼素酶可顯著降低泥鰍肝臟和血清中丙二醛（MDA）含量。綜上所述，在本試驗條件下，考慮生長性能、形態(tài)學指標和非特異性免疫指標，在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中甲殼素酶的適宜添加量為0.100%。

甲殼素酶；蠅蛆粉；泥鰍；生長；非特異性免疫力

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），隸屬鯉形目、鰍科、花鰍亞科、泥鰍屬，俗稱鋼鰍、鰍魚、真泥鰍等（劉蟬馨等，1987）。因為泥鰍肉質蛋白含量高、脂肪含量低、營養(yǎng)豐富、味道鮮美，深受廣大消費者青睞（林啟訓等，2001；Amant等，1969）。近年來，由于環(huán)境污染、過度捕撈等原因，泥鰍野生資源呈下降趨勢，為了滿足市場的巨大需求，泥鰍人工養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大（羅艷萍等，2009）。但是泥鰍配合飼料的研究嚴重滯后，成為制約泥鰍養(yǎng)殖業(yè)健康快速可持續(xù)性發(fā)展的因素之一，急需加強對泥鰍配合飼料的研究力度（武迪，2016）。

魚粉是一種廣泛應用與水產(chǎn)飼料中的優(yōu)質蛋白質源，但因其產(chǎn)量低、需求量大，魚粉的價格一直維持在較高水平，加大了養(yǎng)殖企業(yè)的飼養(yǎng)成本，限制了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，為了降低飼料成本，提高養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟效益（周歧存等，2005），尋求一種優(yōu)質、價格低廉和供應量大的動植物蛋白質源對魚粉進行部分或全部替代，逐漸成為水產(chǎn)飼料的重要研究方向之一（張伯文等，2011；Nguyenthingoc等，2009）。

蠅蛆粉因其蛋白質含量高、營養(yǎng)全面、價格低廉，已有研究報告其可以部分替代飼料中的魚粉（鄧田方等，2012；鄭偉等，2010；Ogunji等，2007）。李賢等（2012）發(fā)現(xiàn)，蠅蛆粉可以替代泥鰍飼料中魚粉的25%~50%，但隨著替代量的提高，泥鰍的生長性能逐漸下降，其認為是蠅蛆粉中含有較多的甲殼素，具有較高的抗營養(yǎng)作用，這與研究凡納濱對蝦（鄧田方等，2012）、鯽魚（朱家勇等，2013）、尼羅羅非魚（Ogunji等，2007）的結果一致。

甲殼素酶為第三代飼料酶制劑，可以隨機切斷甲殼素中的β-1，4糖苷鍵，將其降解為水溶性的低聚糖（甲殼素聚糖），進而消除其抗營養(yǎng)作用（Muzzarelli等，1996）。目前，已有研究者將其應用于甲殼素含量較高的水產(chǎn)飼料中，以提高養(yǎng)殖動物對飼料的利用效率。朱家勇等（2013）利用具有甲殼素酶降解活性的酵母菌添加于含有蠅蛆粉的鯽魚飼料中發(fā)現(xiàn)，甲殼素的抗營養(yǎng)作用降低，鯽魚的生長性能和非特異性免疫能力提高。Zhang等（2012）在斜帶石斑魚的飼料中添加甲殼素酶和蝦粉（富含甲殼素）后發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚的生長性能和免疫能力得到顯著提高。目前，甲殼素酶在泥鰍飼料中的應用研究還鮮見報道。

本試驗通過在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中添加甲殼素酶，研究其對泥鰍生長性能和非特異性免疫能力的影響，分析并確定甲殼素酶在泥鰍飼料中的適宜添加量，旨在為配制優(yōu)質價廉的泥鰍配合飼料提供基礎資料和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料甲殼素酶為飼料級粉狀酶制劑，購自上海陸廣生物科技有限公司，活性為20000 U/g。

試驗用蠅蛆粉購于江蘇長江飼料有限公司，粗蛋白質含量為53.00%；粗脂肪含量為：13.5%；水分含量為8.2%；粗灰分含量為10.80%；鈣含量為1.00%；總磷含量為1.12%；能量為20.9 MJ/kg。蠅蛆粉粉碎研磨后過80目網(wǎng)篩，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗采用單因素試驗設計，在基礎飼料的基礎上，以0、0.025%、0.050%、0.100%、0.200%和0.400%的甲殼素酶替代等量的基礎飼料，制成6種等氮等能試驗飼料，分別用E1（對照組）、E2、E3、E4、E5和E6組表示。所有飼料原料均粉碎并過60目篩，再制成直徑為2.00 mm的顆粒飼料，自然冷卻后裝入密封袋，置于陰涼干燥處保存?zhèn)溆?。飼料中粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分含量的測定參照AOAC（1995）的方法（張海濤等，2013）。飼料中總能采用氧彈量熱儀（TRHW-6000C）進行測定?；A飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平

1.2 試驗用魚與飼養(yǎng)管理試驗用泥鰍幼魚，從徐州市七里溝農(nóng)貿(mào)市場購得。試驗在徐州生物工程職業(yè)技術學院水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室的水族箱（120 cm×60 cm×40 cm）中進行，開始飼喂鯉魚開口料，2周后隨機分為6組，每組3個重復，每個重復放養(yǎng)45尾魚，初始體重約（2.32±0.01）g。試驗開始停喂24 h后，于每天8∶00和17∶00各投喂1次，投喂量為泥鰍體重的3%左右，以泥鰍1 h內(nèi)攝食完為宜，根據(jù)實際情況適當調(diào)整投喂量。試驗用水為瀑氣后的自來水，水深15 cm左右，水箱無土，每隔4 d換水一次，以保證水質清潔，加熱棒加熱控制水溫在25~27℃。試驗期為50 d。

1.3 樣品采集與分析試驗結束后停喂24 h，分別稱量各組泥鰍的終末體重，統(tǒng)計泥鰍的尾數(shù)，計算平均終末體重、增重率、特定生長率、飼料系數(shù)、成活率、肥滿度等指標，參照李愛杰（1996）和劉永堅（2002）的方法測定。取泥鰍血，經(jīng)離心后，吸出血清待測；取血后再取出泥鰍的內(nèi)臟，分離出肝臟，并準確稱取內(nèi)臟、肝臟重量，計算空殼率和內(nèi)臟指數(shù)等指標。將肝臟和血清放人-80℃超低溫冰箱中，待測超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。

增重率/%=（終末體重-初始體重）/初體重× 100；

特定生長率/（%/d）=（ln終末體重-ln初始體重）/試驗天數(shù)×100；

飼料系數(shù)=投飼總量/（終末體重+死亡體重-初始體重）；

存活率/%=終末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100；

空殼率/%=（體重-內(nèi)臟重）/體重×100；

肥滿度/（g/cm）=體重/體長3×100；

內(nèi)臟指數(shù)/%=內(nèi)臟重/體重×100。

肝臟和全腸道中SOD活性和MDA含量測定均采用南京建成生物有限公司生產(chǎn)的試劑盒，操作步驟按試劑盒中的說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，采用SPSS 17.0 for Windows對所有數(shù)據(jù)進行單因子方差分析（ANOVA），若差異顯著，則進行Tukey多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 試驗結果與分析

2.1 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能的影響由表2可知，各試驗組終末體重隨著甲殼素酶添加量的增加先上升后下降，其中E4組最高，為4.39 g，顯著高于其他各組（P＜0.05）；E2和E3組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于對照組、E5和E6組（P＜0.05）；對照組、E5和E6組差異不顯著（P＞0.05）。E4組泥鰍的WGR最高，為78.00%，隨后依次是E3、E2、E6、E5、E1組，E1組最低，為40.33%；E4組顯著高于E1、E2、E5、E6組（P＜0.05），與E3組差異不顯著（P＞0.05）；E1、E5和E6組之間無顯著差異（P＞0.05）。各組泥鰍SGR的順序為E4＞E3＞E2＞E6＞E5＞E1組，E4組顯著高于其他各組（P＜0.05）；E2、E3和E4組與E1組差異顯著（P＜0.05），而E5、E6組與E1組差異不顯著（P＞0.05）。各組飼料FC在1.40~1.51，其中E4組最低，為1.40，顯著高于E1、E2、E5、E6組（P＜0.05），與E3組差異不顯著（P＞0.05）；E2、E5、E6組與E1組無顯著差異（P＞0.05）。飼料中添加不同劑量的甲殼素酶對泥鰍的存活率無顯著影響（P＞0.05），但E4組泥鰍的SR最高，為95.56%。

表2 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍生長性能的影響

2.2 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍形體指標的影響由表3可知，泥鰍的內(nèi)臟指數(shù)、肥滿度、空殼率各組之間無顯著性差異（P＞0.05），但隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加，內(nèi)臟指數(shù)有先降低后上升的趨勢，E4組最低，肥滿度和空殼率有先上升后下降的趨勢，E4組最高。

表3 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍形體指標的影響%

2.3 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍各組織中SOD活性和MDA含量的影響由表4可見，肝臟和血清中SOD活性均隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加先上升后降低，均在E4組最高，分別為153.96、113.63 U/mL，且均顯著高于其他各組（P＜0.05）。E2、E4和E5組泥鰍肝臟中SOD活性無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于E1組（P＜0.05）；E6和E1組之間無顯著差異（P＞0.05）。E3和E5組泥鰍血清中SOD活性差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于E1組（P＜0.05）；E2、E6和E1組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表4 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍各組織中SOD活性的影響U/mL

由表5可見，肝臟和血清中MDA含量均隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加先降低后上升，均在E4組最低，分別為10.67、10.90 nmol/mL。E2、E3和E4組肝臟MDA含量無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于E1和E6組（P＜0.05）；E5和E6組與E1組差異不顯著（P＞0.05）。E2、E3、E4和E5組泥鰍血清MDA含量無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于E1組（P＜0.05）；E1和E6組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 蠅蛆粉替代魚粉飼料中添加甲殼素酶對泥鰍各組織中MDA含量的影響nmol/mL

3 討論

蠅蛆粉是一種生物蛋白飼料原料，蛋白質含量與魚粉相差無幾，同時含有多種生物活性物質，如抗菌肽、甲殼素等。由于不具有內(nèi)源性甲殼素酶，動物很難降解蠅蛆粉中的甲殼素，某些情況下可能會對養(yǎng)殖動物的生長造成負面影響（Ogunji等，2008；K?prücü等，2005）。Chatzifotis等（2009）和Khempaka等（2011）在研究蝦粉中甲殼素對鯛魚和肉雞生長性能的影響時，也有類似發(fā)現(xiàn)。

飼料中添加外源性甲殼素酶，能有效降低甲殼素對動物消化和吸收的負面影響，消除其抗營養(yǎng)作用。甲殼素聚糖為甲殼素酶降解甲殼素的產(chǎn)物，有研究表明，相較于水不溶性的甲殼素，其具有抗氧化作用，能激活動物的免疫機能，具有較強的生物學活性（Park等，2010；Ngo等，2009、2008）。

本研究中，在飼料中添加0.025%～0.100%的甲殼素酶能提高泥鰍的增重率和特定生長率，降低飼料系數(shù)。因此在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中添加甲殼素酶，能有效促進泥鰍的生長，提高飼料利用率，其中，以添加量為0.100%效果最顯著。這與Zhang等（2012）在石斑魚上的研究結果類似，該研究發(fā)現(xiàn)添加甲殼素酶到含有2%蝦粉的斜帶石斑魚飼料中，能顯著提高斜帶石斑魚的生長性能。本試驗結果表明，當甲殼素酶添加量為0.200%和0.400%時，泥鰍的增重率、特定生長率和飼料系數(shù)與對照組無顯著差異，原因可能是外源性酶過多的添加會抑制內(nèi)源性酶的分泌，出現(xiàn)的酶活性飽和現(xiàn)象，進而影響泥鰍的生長性能。

本研究中，各添加甲殼素酶組的泥鰍內(nèi)臟指數(shù)、肥滿度和空殼率與對照組之間無統(tǒng)計學差異，這說明添加甲殼素酶對泥鰍的形體指標無不良影響。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中甲殼素酶添加量的增加，內(nèi)臟指數(shù)有先降低后上升的趨勢，E4組最低，肥滿度和空殼率有先上升后下降的趨勢，E4組最高。原因可能與飼料中的脂類含量和氧化程度以及碳水化合物的含量有關，YE等（2011）、Lee等（2002）、Rueda-Jasso等（2004）發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)動物的肝體比與飼料中脂肪和碳水化合物含量有關。曹俊明等（2012）在研究凡納濱對蝦時發(fā)現(xiàn)，蠅蛆粉高比例替代魚粉會顯著提高肝胰指數(shù)，這可能與蠅蛆粉脂質被氧化程度有關。

抗氧化系統(tǒng)在動物體免疫防御機制中起著重要作用，是一種防御過氧化反應傷害的主動防御系統(tǒng)（唐雪蓮等，2012）；SOD活性是衡量機體抗氧化能力和非特異性免疫能力的重要指標；MDA是脂質在自由基作用下發(fā)生過氧化反應的產(chǎn)物，通過測定其含量，能間接評價機體抗氧化的能力（Slater等，1979）。本試驗中發(fā)現(xiàn)添加甲殼素酶對泥鰍的SOD活性有顯著增強作用；MDA含量顯著降低。說明在含有蠅蛆粉的飼料中添加甲殼素酶可在一定程度上有效增強泥鰍的抗氧化能力。數(shù)據(jù)分析表明，甲殼素酶添加量為0.100%效果最佳。這與斜帶石斑魚的研究結果相似。Zhang等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，添加甲殼素酶到含有2%蝦粉的斜帶石斑魚飼料中，能顯著提高石斑魚SOD的mRNA表達，其認為甲殼素酶能有效提高斜帶石斑魚的抗氧化能力和非特異性免疫機能。

4 結論

在本試驗條件下，甲殼素酶添加于含有蠅蛆粉的飼料中，可降低蠅蛆中甲殼素對泥鰍的抗營養(yǎng)作用，提高泥鰍生長性能和對飼料的消化吸收率，增強其抗氧化力和非特異性免疫力，提高了蠅蛆粉在泥鰍飼料中的應用價值。基于本試驗的研究結果和分析，考慮生長性能、形態(tài)學指標和非特異性免疫指標，在含有蠅蛆粉的泥鰍飼料中甲殼素酶的適宜添加量為0.100%。

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This experiment was conducted to investigate the effect of dietary chitinase addition in fish meal reduction diet on growth performance and non-specific immunity of loach（Misgurnus anguillicaudatus）.Loach were fed with 6 isonitrogenous and isoenergetic experimental diets supplemented with 0%，0.025%，0.050%，0.100%，0.200%and 0.400% chitinase for 50 days，which were named groups E1，E2，E3，E4，E5 and E6，respectively.The results showed as follows：Supplementation of 0.025%to 0.100%chitinase could significantly enhance the weight gain rate（WGR）and the specific growth rate（SGR）（P＜0.05），and significantly reduce the feed conversion ratio（FCR）（P＜0.05）.The highest WGR，SGR and lowest FCR of loach were both found in 0.100%group.No significant difference was observed between physical indexes among all groups（P＞0.05）.Supplementation of 0.050%to 0.100%chitimase could significantly enhance the activities of superoxide dismutase（SOD）in liver and serum of loach（P＜0.05）.Meanwhile，supplementation of 0.025%to 0.100% chitimase could significantly reduce malonaldehyde（MDA）contents in liver and serum of loach（P＜0.05）.So，considering the growth and non-specific immune indexes in the condition of this experiment，the optimal supplemental level of chitimase in fish meal reduction diet of loach is 0.100%.

chitinase；maggot meal；loach；growth；non-specific immunity

S963

A

1004-3314（2017）11-0039-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171109

徐州生物工程職業(yè)技術學院院級課題（2014B07）

*通訊作者