GFP-Nurr1基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的建立及過表達(dá)Nurr1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的影響

陳孝祥， 宋曉斌， 王向鵬， 徐蛟天， 林 海， 王 威， 楊智勇， 鄧興力

GFP-Nurr1基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的建立及過表達(dá)Nurr1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的影響

陳孝祥， 宋曉斌， 王向鵬， 徐蛟天， 林 海， 王 威， 楊智勇， 鄧興力

目的 利用慢病毒載體建立GFP-Nurr1基因修飾的原代神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)模型并觀察Nurr1過表達(dá)后NSCs向多巴胺神經(jīng)元的分化影響。方法 利用基因重組構(gòu)建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體，用慢病毒轉(zhuǎn)染第三代NSCs，轉(zhuǎn)染72 h后熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果；設(shè)置空白對(duì)照組、空載體組及DCE-Nurr1組，分別用Western blot及PCR檢測(cè)Nurr1的表達(dá)差異；并將轉(zhuǎn)染后的NSCs分化培養(yǎng)7 d后分別用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)、Western blot及PCR檢測(cè)酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)。結(jié)果 慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs 72 h后，轉(zhuǎn)染率可達(dá)90%，與對(duì)照組相比DCE-Nurr1組高表達(dá)Nurr1。經(jīng)慢病毒載體感染后的NSCs仍具備分化潛能，分化培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)DCE-Nurr1組分化的神經(jīng)細(xì)胞中TH陽性細(xì)胞分化率90.60%，對(duì)照組為21.2%。結(jié)論 慢病毒載體可高效轉(zhuǎn)染NSCs過表達(dá)Nurr1；Nurr1基因過表達(dá)可以促進(jìn)中腦腹側(cè)來源NSCs向TH陽性多巴胺能神經(jīng)元方向分化。

Nurr1； 基因修飾； 慢病毒； 神經(jīng)干細(xì)胞

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的典型運(yùn)動(dòng)癥狀主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)徐緩，靜止性震顫及肌強(qiáng)直，主要由于中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元(dopaminergic neuron，DA neuron)的漸進(jìn)性變性丟失引起，目前尚無治療方法可延緩其疾病進(jìn)程[1]。根據(jù)近幾年的研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)具有多分化潛能，能體外培養(yǎng)誘導(dǎo)成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此通過移植神經(jīng)干細(xì)胞有望成為PD治療的新希望。目前，已在PD動(dòng)物模型上得到證實(shí)，通過移植體外培養(yǎng)的NSCs后能改善PD動(dòng)物行為學(xué)癥狀[2，3]。但單純神經(jīng)干細(xì)胞移植治療PD也面臨諸多問題，其中如何使移植后的NSCs最大程度的分化成有功能的DA神經(jīng)元是亟待解決的問題。核受體相關(guān)基因1(nuclear receptor related 1 gene，Nurr1)屬于孤束核受體家族成員之一，前期大量研究表明Nurr1 對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育、生存和功能維持起著重要的作用，并且通過敲除小鼠Nurr1基因發(fā)現(xiàn)Nurr1-/-小鼠不能產(chǎn)生中腦多巴胺能神經(jīng)元[4]。因此通過Nurr1基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞有望使移植后的NSCs最大程度分化成TH陽性的DA神經(jīng)元。雖然國內(nèi)曾有研究報(bào)道利用電穿孔法轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞使其過表達(dá)Nurr1，但轉(zhuǎn)染后NSCs分化成DA神經(jīng)元的比例并不高。因此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，利用慢病毒載體將中腦腹側(cè)來源原代培養(yǎng)的NSCs過表達(dá)Nurr1，觀察其分化情況，旨在提高NSCs過表達(dá)Nurr1后向DA神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化率，為進(jìn)一步體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SD(Sprague-Dawley)雄、雌性大鼠均購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK(滇)2011-0004)。將SD雌性大鼠與雄性大鼠合籠受孕，原代神經(jīng)干細(xì)胞取自孕12.5～14.5 d胎鼠中腦腹側(cè)組織培養(yǎng)而來。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12、DMEM/high glucose購自HyClone；L-谷氨酰胺(L-Glutamine-200 mM)、青霉素-鏈霉素雙抗及B27(B-27 Supplement Minus Vitamin A 50X)均購自Invitrogen公司；山羊血清購自索萊寶公司；堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)均購自Peprotech 公司；D-葡萄糖購自大連美侖、多聚-D-賴氨酸購自 Sigma公司；胎牛血清(feta l bovine serum，F(xiàn)BS)購自BI公司；DAPI購自碧云天公司；兔巢蛋白抗體(rabbit anti-Nestin)、兔β微管蛋白Ⅲ抗體(rabbit anti-Ⅲ β-tubulin)、兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(rabbit anti-GFAP)、兔酪氨酸羥化酶抗體(rabbit anti-TH)及Alexa Fluor594標(biāo)記羊抗兔IgG(Alexa Fluor594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG)均購自proteintech公司。RIPA裂解液購自索萊寶公司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根公司。

1.1.3 慢病毒載體及引物設(shè)計(jì) pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體攜帶GFP報(bào)告基因和Nurr1目的基因，由本課題組前期構(gòu)建。RT-PCR(reverse transcription-PCR)所用Nurr1及TH引物由primer5軟件設(shè)計(jì)，引物購自Invitrogen公司。Nurr1(forward：5’-AAGCCACCTTGCTTGTACCAAA-3’，reverse：5’-CTTGTAGTAAACCGACCCGCTG-3’)；TH(forward：5’-CAGGGCTGCTGTCTTCCTAC-3’，reverse，5’-GGGCTGTCCAGTACGTCAAT-3’)；DAT(forward：5’-TTGCAGCTGGCACATCTATC-3’，reverse：5’-ATGCTGACCACGACCACATA-3’)；GAPDH(forward：5’-TGCCTCCTGCACCACCAACT-3’，reverse：5’-CCCGTTCAGCTCAGGGATGA-3’)。

2.3 NSCs過表達(dá)Nurr1后的分化培養(yǎng)結(jié)果 將空白對(duì)照組及DCE-Nurr1組分別分化培養(yǎng)7 d后，經(jīng)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，DCE-Nurr1組TH+的DA神經(jīng)元明顯增多(90.60%，而對(duì)照組為21.2%)，且胞體大，突起長(P<0.001)(見圖3A-C)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在DCE-Nurr1組分化后的細(xì)胞仍表達(dá)GFP，但大部分表達(dá)GFP的細(xì)胞并非TH+細(xì)胞(見圖3D)，提示過表達(dá)的Nurr1在NSCs分化后有可能更多的位于膠質(zhì)細(xì)胞。因此，我們進(jìn)一步通過熒光共定位進(jìn)行了確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)來自慢病毒載體的GFP大多表達(dá)于GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞上(見圖4)。另外，為進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)Nurr1處理后分化得到的DA神經(jīng)元是否具有成熟DA神經(jīng)元特點(diǎn)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了這兩組間TH和DAT(dopamine transporter，DAT)在mRNA和蛋白水平上是否有表達(dá)差異。通過Western blot及RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比DCE-Nurr1組分化得的DA神經(jīng)元TH和DAT均上調(diào)(見圖5)，說明經(jīng)Nurr1過表達(dá)修飾后能促進(jìn)NSCs向DA神經(jīng)元分化，且具備成熟DA神經(jīng)元功能。

1.2.1 中腦腹側(cè)NSCs的培養(yǎng)及鑒定 7%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉孕12.5～14.5 d的SD大鼠，無菌條件下取出胎鼠后用DMEM/high glucos溶液漂洗兩次，解剖顯微鏡下分離胎鼠取中腦腹側(cè)組織；將組織剪碎后加入NSCs完全培養(yǎng)液(含20 ng/ml的EGF、20 ng/ml的bFGF、2%的B27、1%的L-谷氨酰胺)，1 ml移液器槍頭吹打后，經(jīng)70 μm濾網(wǎng)過濾，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞后加入完全培養(yǎng)基重懸，按2×105個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，隔天半量換液1次。原代培養(yǎng)7 d后機(jī)械分離神經(jīng)球進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第三代(P3)神經(jīng)球用巢蛋白(Nestin)鑒定，并用10%FBS分化培養(yǎng)液(撤去EGF和bFGF)分化培養(yǎng)后鑒定其多向分化能力。

2.1 中腦腹側(cè)NSCs的生長特點(diǎn)及鑒定 原代NSCs從中腦腹側(cè)分離后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)1～2 d，大部分細(xì)胞均貼壁并漸死亡，2～3 d后，倒置顯微鏡下可觀察到少許神經(jīng)干細(xì)胞開始聚集成簇，培養(yǎng)5～7 d后可形成直徑150 μm～200 μm大小的神經(jīng)球，經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(Nestin)鑒定呈陽性。將培養(yǎng)至7 d的神經(jīng)球進(jìn)一步分化培養(yǎng)，在分化培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)作用下，神經(jīng)球漸分化，球體周圍生出長突起，分化培養(yǎng)7 d后大部分神經(jīng)球均分化，經(jīng)免疫熒光鑒定分別呈微管蛋白(Tuj1)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性(見圖1)，說明中腦腹側(cè)來源腦組織可經(jīng)體外培養(yǎng)成神經(jīng)干細(xì)胞，且有多向分化能力。原代培養(yǎng)神經(jīng)球5～7 d后，可見球體中間細(xì)胞漸發(fā)暗，為營養(yǎng)供應(yīng)不足引起，應(yīng)及時(shí)傳代處理。

1.2.4 Western Blot及PCR驗(yàn)證 仍分別設(shè)置空白對(duì)照組及DCE-Nurr1組，將P3代神經(jīng)球接種于6孔板中。DCE-Nurr1組神經(jīng)球轉(zhuǎn)染Nurr1培養(yǎng)72 h后用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)；空白對(duì)照組不予慢病毒處理，直接用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)(與DCE-Nurr1組同一時(shí)間開始分化培養(yǎng))。兩組分化培養(yǎng)7 d后分別提取蛋白及總RNA，用western blot及PCR檢測(cè)兩組間TH表達(dá)情況。

1.2.3 NSCs過表達(dá)Nurr1后的分化培養(yǎng)及免疫熒光鑒定 設(shè)置空白對(duì)照組及DCE-Nurr1組，將P3代神經(jīng)球接種于鋪有細(xì)胞爬片(爬片經(jīng)多聚賴氨酸處理)的24孔板中。DCE-Nurr1組神經(jīng)球轉(zhuǎn)染Nurr1培養(yǎng)72 h后用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)；空白對(duì)照組不予慢病毒處理，直接用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)(與DCE-Nurr1組同一時(shí)間開始分化培養(yǎng))。將兩組分別分化培養(yǎng)7 d后取出爬片，用PBS洗滌5 min×3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.3%的Triton處理15 min，PBS洗滌5 min×3次，10%山羊血清封閉1 h后，滴加一抗兔抗TH多克隆抗體(1∶200)后4 ℃過夜；次日早上再PBS洗滌3次，滴加二抗(山羊抗兔Alexa Fluor594，1∶500)后室溫孵育2 h；PBS洗滌3次后DAPI染核(DAPI為碧云天產(chǎn)品，使用濃度為5 μg/ml)；熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。

1.2.2 NSCs過表達(dá)Nurr1模型的建立及鑒定 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒由本課題組前期構(gòu)建保存，攜帶GFP報(bào)告基因和Nurr1目的基因。在轉(zhuǎn)染前，首先收集P3代NSCs至離心管并1000 r/min×5 min離心，用完全培養(yǎng)基重懸，機(jī)械吹打盡量分散神經(jīng)球，按2×105個(gè)/ml接種于六孔板，感染復(fù)數(shù)(MOI)按預(yù)實(shí)驗(yàn)取200，計(jì)算出病毒數(shù)后加入NSCs培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。分別設(shè)置空白對(duì)照組、空載體組及DCE-Nurr1組?？瞻讓?duì)照組不用慢病毒感染，空載體組用攜帶GFP(綠色熒光蛋白)但不含目的基因Nurr1的慢病毒轉(zhuǎn)染，DCE-Nurr1組用含GFP-Nurr1的慢病毒處理，將3組分化培養(yǎng)72 h后分別提蛋白及總RNA，進(jìn)一步用Western blot及PCR檢測(cè)3組Nurr1表達(dá)情況。

其二，從研究熱點(diǎn)主題來看，近十年來研究熱點(diǎn)主題一直在不斷演變與擴(kuò)展。根據(jù)關(guān)鍵詞共現(xiàn)與聚類分析可知，武術(shù)文化研究主要圍繞著非物質(zhì)文化遺產(chǎn)視域下的武術(shù)文化保護(hù)與發(fā)展；中國傳統(tǒng)武術(shù)自身的現(xiàn)狀、困境與發(fā)展路徑；中國武術(shù)文化的國際化傳播與推廣；武術(shù)文化的文化精神；學(xué)校武術(shù)教育中的文化反思；地域武術(shù)文化與民間武術(shù)文化的發(fā)展等幾個(gè)方面的探索。

職業(yè)導(dǎo)游能力，是指職業(yè)導(dǎo)游所具備的基本的和必要的職業(yè)能力和素養(yǎng)，換言之，職業(yè)導(dǎo)游能夠成功地輕松地從事導(dǎo)游服務(wù)工作所具備的所有能力的特征和職業(yè)素養(yǎng)的總和。社會(huì)實(shí)踐中，職業(yè)導(dǎo)游，應(yīng)該能夠做好向?qū)Ш椭v解工作，能夠做好游客的安全，做好旅游資源的推薦，做好游客出游活動(dòng)的建議，有良好的品質(zhì)和技能，語言表達(dá)、行為判斷、組織協(xié)調(diào)能力，同時(shí)也要有專業(yè)的廣博的知識(shí)內(nèi)涵。

2 結(jié) 果

Third is viability,since Zhuang drama emerge in the folk,most of its contents were transmitted from generation to generation through folk artists’oral teaching and demonstration.

2.2 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒對(duì)NSCs的轉(zhuǎn)染 在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在P3代培養(yǎng)至5～7 d的神經(jīng)球中加入DCE-Nurr1慢病毒感染24 h后即可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染72 h后大部分神經(jīng)球均表達(dá)綠光，有些神經(jīng)球可漸貼壁分化(見圖2A、2B)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)7 d大部分神經(jīng)球均分化。分別用Western bolt及PCR比較空白對(duì)照組、空載體組及DCE-Nurr1組，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組與空載體組比較Nurr1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而DCE-Nurr1組較其余兩組相比均高表達(dá)Nurr1，統(tǒng)計(jì)分析存在顯著性差異(P<0.001)(見圖2C、2D)。結(jié)果說明以慢病毒為載體可使NSCs高效過表達(dá)Nurr1。

1.2 方 法

加里克 · 阿瓦內(nèi)齊安,捷克人。1959年生于巴庫,出版商。1988年至1992年居住在哈薩克斯坦,1992年至1994年在莫斯科工作,1995年以來居住在布拉格,2012年獲MFIAP榮譽(yù),在世界30多個(gè)國家參加國際攝影沙龍和展覽會(huì)300余次。

圖1 NSCs鑒定及分化培養(yǎng)后鑒定。原代神經(jīng)球培養(yǎng)7 d(A)，經(jīng)過巢蛋白(Nestin)鑒定陽性(B)；將P3神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)后并鑒定，分別呈GFAP及Tuj1陽性(C-D)。標(biāo)尺(A-D)=20 μm

圖2 pLenO-DCE-Nurr1慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs。P3代神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)pLenO-DCE-Nurr1慢病毒轉(zhuǎn)染后72 h可見明顯綠色熒光(A-B)，并經(jīng)western blot及PCR進(jìn)一步得到驗(yàn)證(C-D)：經(jīng)pLenO-DCE-Nurr1慢病毒系統(tǒng)可成功構(gòu)建NSC過表達(dá)Nurr1模型。標(biāo)尺(A-B)=100 μm

圖3 過表達(dá)Nurr1促進(jìn)NSCs向DA神經(jīng)元分化。與對(duì)照組相比，DCE-Nurr1組TH+細(xì)胞明顯增多(見圖A～C，***P<0.001)；DCE-Nurr1組分化后的細(xì)胞仍表達(dá)GFP，但大部分未共定位于TH+細(xì)胞。標(biāo)尺(A，B及D)=20 μm

圖4 熒光共定位檢測(cè)GFP分布。通過熒光共定位發(fā)現(xiàn)，慢病毒攜帶的GFP在NSCs分化后，大部分共定位與GFAP+細(xì)胞。標(biāo)尺(A-D)=20 μm

圖5 與對(duì)照組相比DCE-Nurr1組分化得的DA神經(jīng)元TH和DAT均上調(diào)。(**P<0.01，****P<0.0001)

3 討 論

近年來因?yàn)槔淆g化諸多等原因，一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病逐年增加，特別是帕金森病(PD)，有Meta研究分析指出截止到2014年，年齡大于40歲的女性PD患病率達(dá)到了37.55/10萬，而年齡大于40歲的男性則達(dá)到了61.21/10萬[5]。雖然PD的患病率正逐年增加，但現(xiàn)有的PD治療均仍只能暫時(shí)緩解其臨床癥狀，并不能延緩疾病進(jìn)展，大部分患者最終仍因疾病導(dǎo)致生活能力喪失，甚至精神障礙。自1992年Reynolds和Weiss首次成功體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞后[6]，對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的研究一直不斷，并漸將其用于PD治療的研究。但在細(xì)胞移植治療PD過程中如何把握NSCs的分化命運(yùn)，將其引導(dǎo)分化成具有成熟功能的DA神經(jīng)元的報(bào)道則較少。

核受體相關(guān)基因1，也稱核受體第4A亞家族第2成員(nuclear receptor subfamily 4，group A，member 2，NR4A2)，屬于孤束核受體。早期的研究發(fā)現(xiàn)，鼠來源Nurr1在胚胎10.5 d即在中腦腹側(cè)表達(dá)，并且持續(xù)表達(dá)于成年腦組織的中腦腹側(cè)和黑質(zhì)區(qū)[7]。此后，多項(xiàng)研究通過基因敲除證實(shí)，Nurr1基因的表達(dá)與DA神經(jīng)元的發(fā)育合成、成熟及維持均密切相關(guān)[8]。這些研究表明，在多巴胺神經(jīng)元前體細(xì)胞(如神經(jīng)干細(xì)胞)向DA神經(jīng)元方向分化的過程中，Nurr1基因的調(diào)控占重要作用[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，為了研究過表達(dá)Nurr1基因?qū)SCs向多巴胺神經(jīng)元的分化影響，本課題組構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體，通過轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞的GFP熒光表達(dá)來初步確定轉(zhuǎn)染效果，然后將NSCs進(jìn)一步分化培養(yǎng)后通過Western blot、RT-PCR及免疫熒光來分析TH+多巴胺神經(jīng)元的分化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過表達(dá)Nurr1基因的NSCs分化培養(yǎng)后TH+細(xì)胞率明顯升高，可達(dá)90.60%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，這些經(jīng)Nurr1轉(zhuǎn)染后分化獲得的細(xì)胞高表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(Dopamine Transporter，DAT)及酪氨酸羥化酶(TH)等標(biāo)志DA神經(jīng)元成熟的基因。說明過表達(dá)Nurr1能促進(jìn)NSCs向成熟DA神經(jīng)元分化。另外，在本研究中，還發(fā)現(xiàn)慢病毒載體可使NSCs穩(wěn)定持續(xù)過表達(dá)Nurr1，甚至在分化培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞上仍能檢測(cè)到較強(qiáng)的GFP熒光，進(jìn)一步通過熒光共定位發(fā)現(xiàn)，這些通過慢病毒轉(zhuǎn)染的GFP大多表達(dá)于GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞上。Saijo等研究提出[10]Nurr1可以通過作用于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞來減少炎癥因子的分泌從而起保護(hù)多巴胺神經(jīng)元的作用。結(jié)合Saijo等研究，可以認(rèn)為經(jīng)Nurr1修飾后的NSCs用于移植治療PD動(dòng)物模型，不但能夠促進(jìn)NSCs定向分化為成熟的DA神經(jīng)元，而且Nurr1還極有可能作用于分化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞來和局部移植區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞來減少炎癥因子的分泌，從而保護(hù)經(jīng)移植分化而來的DA神經(jīng)元和宿主腦內(nèi)殘留的DA神經(jīng)元的存活。但具體Nurr1通過什么機(jī)制及信號(hào)通路來發(fā)揮以上作用，還需體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

目前對(duì)于NSCs的基因轉(zhuǎn)染，有病毒轉(zhuǎn)染法和非病毒轉(zhuǎn)染法，其中病毒轉(zhuǎn)染法主要有慢病毒轉(zhuǎn)染法和腺病毒及腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染法。Stephanie M等研究表明腺病毒及腺相關(guān)病毒對(duì)于神經(jīng)前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不高[11]。故在本研究中，我們構(gòu)建了pLenO-DCE-Nurr1慢病毒載體，除了目的基因Nurr1外，還攜帶綠色熒光蛋白(GFP)，可在轉(zhuǎn)染后直接通過熒光顯微鏡觀察GFP的熒光表達(dá)情況來判斷轉(zhuǎn)染效果。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI小于150，轉(zhuǎn)染72 h后大部分神經(jīng)球均只有球體周圍表達(dá)綠色熒光，而將MOI提高至200時(shí)，大部分神經(jīng)球均能在轉(zhuǎn)染72 h后穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，并能成功分化培養(yǎng)。經(jīng)過Western blot及RT-PCR分析驗(yàn)證，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染(MOI=200)，可使NSCs轉(zhuǎn)染效率大于90%，高于國內(nèi)譚雪峰等利用電穿孔法轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(35%)[12]。雖然本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，經(jīng)慢病毒載體可高效轉(zhuǎn)染NSCs過表達(dá)Nurr1基因，并促進(jìn)NSCs向多巴胺神經(jīng)元分化，但較之電穿孔等非病毒轉(zhuǎn)染法，慢病毒轉(zhuǎn)染后的NSCs移植于體內(nèi)后是否會(huì)增加致瘤性仍有待進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考證。

對(duì)于B和C類型乘客，無法直觀確定其下車站點(diǎn)，可以采用概率的方法求得在各個(gè)站點(diǎn)下車的概率，選取概率最高者為其下車站點(diǎn)，B類型乘客存在歷史相似出行記錄，因此其概率是站點(diǎn)上車次數(shù)與線路乘坐次數(shù)的比值；C類型乘客，出行鏈較為殘缺，沒有歷史出行記錄，因此其概率算法為類型乘客在站點(diǎn)i上車，則在該線路下行站點(diǎn)j…n下車的概率為乘客乘坐該線路在各站點(diǎn)的上車次數(shù). C類型乘客在站點(diǎn)i上車，則在該線路下行站點(diǎn)j…n，下車的概率該站點(diǎn)上車人數(shù)，為該站點(diǎn)所有下游站點(diǎn)的上車總?cè)藬?shù).

總之，通過本實(shí)驗(yàn)可以明確，慢病毒可使NSCs高效過表達(dá)Nurr1基因，且過表達(dá)Nurr1基因后能促進(jìn)NSCs向成熟多巴胺神經(jīng)元轉(zhuǎn)化。通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的慢病毒攜帶的綠色熒光大部分分布于膠質(zhì)細(xì)胞，這是否說明轉(zhuǎn)染后Nurr1還可作用并調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞則需進(jìn)一步研究。另外，Chung S等[13，14]研究指出Nurr1是在Shh-FoxA2 和 Wnt1-Lmx1a兩條信號(hào)通路共同調(diào)控下參與DA神經(jīng)元的發(fā)育合成的。但通過慢病毒體外轉(zhuǎn)染NSCs，促進(jìn)轉(zhuǎn)染后的NSCs向DA神經(jīng)元轉(zhuǎn)化是否通過作用于以上兩條通路來發(fā)揮作用尚不清楚，需進(jìn)一步研究探討。

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Establish the GFP-Nurr1 modified NSCs and the impact on the differentiation of neural stem cells by Nurr1 Overexpression

CHENXiaoxiang，SONGXiaobing，WANGXiangpeng，etal.

(DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China)

Objective To establish the GFP-Nurr1 modified NSCs model via Lentiviral vectors and observe the impact on the differentiation of neural stem cells by Overexpression of Nurr1.Methods pLenO DCE-Nurr1 lentiviral vectors was constructed by genetic recombination technology. P3 NSCs were infected with lentiviral vectors and the effect of transfection was measured by fluorescence expression after 72 hours. The expression of Nurr1 between three groups，which includes control group，empty vector group and DCE-Nurr1 group，was analyzed by Western blot/PCR respectively. The expression of TH among three groups was analyzed via immunofluorescence，Western blot and PCR after 7-days differentiation culture of the transfected NSCs. Results Approximately 90% of NSCs can be transfected by pLenO-DCE-Nurr1 after 72 hours. Nurr1 expression was upregulated in DCE-Nurr1 group，compared to control group. NSCs remains the capacity to differential after transfected by lentiviral vectors，and the TH positive cells was 90.60%，while only 21.2% in the control group. The expression of TH and DAT was also upregulated in DCE-Nurr1 group. Conclusion NSCs overexpression of Nurr1 can be mediated by lentiviral vectors with high efficiency. NSCs derived from embryonic mesencephalic can be induced to TH positive dopaminergic neurons via overexpression of Nurr1.

Nurr1； Gene modification； Lentiviral vectors； Neural stem cells

2017-03-15；

2017-04-18

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 81360197)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 81241126)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(No. 2013C227)；云南省干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No. 201401UH00160) 作者單位：(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650032)

鄧興力，E-mail：dxlkmmu@163.com

1003-2754(2017)05-0388-05

R651

A