超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定不同飼料中30種真菌毒素

范志辰, 韓 錚, 郭文博, 趙志輝*

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 上海 201403)

研究論文

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定不同飼料中30種真菌毒素

范志辰1, 韓 錚2, 郭文博2, 趙志輝2*

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院, 上海 201306; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 上海 201403)

采用QuEChERS前處理技術(shù),建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)檢測不同飼料樣品(預(yù)混料、濃縮料和配合料)中30種真菌毒素含量的分析方法。飼料樣品經(jīng)5 mL水和5 mL含1%(v/v)甲酸的乙腈溶液提取后,取上清液氮吹至近干,殘渣經(jīng)1 mL 5 mmol/L醋酸銨水溶液-乙腈(80∶20, v/v)復(fù)溶后,上機(jī)測定。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。在低、中、高3個添加水平下,30種真菌毒素的平均加標(biāo)回收率為72.0%～118.4%(n=5), 30種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)≥0.99,檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分別為0.7～20 μg/L和2～50 μg/L。該法簡單、快速、實(shí)用性強(qiáng),適用于預(yù)混料、濃縮料和配合料中30種真菌毒素的定量分析。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;QuEChERS;真菌毒素;飼料

真菌毒素(mycotoxins)是特定真菌在一定條件下產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物[1],廣泛存在于不同的飼料中,從而造成糧食污染,導(dǎo)致巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時也嚴(yán)重危害了動物甚至人體的健康[2]。目前已發(fā)現(xiàn)近400種真菌毒素,其中約30種對人類危害較大,包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、A型單端孢霉烯族類毒素、B型單端孢霉烯族類毒素、伏馬毒素、騰毒素等[3]。部分真菌毒素如黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A等超過一定攝入量后會引起人的肝腎功能下降、癌變或誘發(fā)免疫抑制性疾病[4]。世界衛(wèi)生組織已將真菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)測對象[5],我國也規(guī)定了飼料中黃曲霉毒素B1等重要真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)[6-8]。

目前,飼料中真菌毒素檢測方法主要分為快速篩選法和確證法兩大類。快速篩選法主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[9],此法可以在較短的時間內(nèi)完成大批量樣品的分析,具有簡便、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn),但存在檢出結(jié)果伴有假陽性、不能準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)。真菌毒素的確證方法包括薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)等[10-12]。目前這些方法只適用于一種或一類真菌毒素的定性和定量分析,但實(shí)際上一般都是多種真菌毒素的聯(lián)合污染[13]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)結(jié)合了色譜分離度好和質(zhì)譜靈敏度高的特點(diǎn),近年來被廣泛應(yīng)用于不同樣品中真菌毒素的定性、定量分析[14],如應(yīng)永飛等[15]建立了多功能凈化柱結(jié)合LC-MS/MS檢測飼料中14種真菌毒素的方法。然而,由于不同種類真菌毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)、色譜行為、光學(xué)特性的相似性,一般的分離方法無法在短時間內(nèi)將多種真菌毒素同時分離,目前報道的檢測方法仍然無法同時涵蓋飼料中所有常見的真菌毒素。超高效液相色譜法(UHPLC)因具有更高的分析速度和靈敏度[16],越來越多地應(yīng)用于多種真菌毒素的殘留分析,為目標(biāo)化合物的快速定性與定量提供了技術(shù)保障。

本文利用QuEChERS前處理技術(shù)[17,18],建立了UHPLC-MS/MS同時測定預(yù)混合飼料、濃縮飼料、配合飼料中常見的30種真菌毒素的分析方法,并采用同位素內(nèi)標(biāo)法[19]對其進(jìn)行定量。本方法簡單快速，準(zhǔn)確度高,可同時檢測不同飼料中的真菌毒素,大大縮短了分析時間,減少了不必要的資源成本。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters/XEVO TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司); XYC-12A型氮吹儀(上海析友分析儀器有限公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); Multifuge 1 L-R離心機(jī)(德國Thermo公司); AL104分析天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司); SK8210LHC超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、醋酸銨(色譜純,德國Merck公司);無水硫酸鎂、氯化鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L)和5種同位素內(nèi)標(biāo)(13C17-黃曲霉毒素B1(50 μg/L)、13C24-T-2毒素(1 mg/L)、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(1 mg/L)、13C20-赭曲霉毒素A(1 mg/L)和13C18-玉米赤霉酮(1 mg/L)純度均大于98%(美國Sigma公司);實(shí)驗(yàn)用38份不同飼料樣品包括預(yù)混料(14份)、濃縮料(11份)和配合料(13份)，均取自上海市生物科技有限公司和飼料生產(chǎn)公司的委托樣品(如申嘉生物科技有限公司、上海谷歌豐飼料有限公司、金朝生物科技有限公司等)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取30種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg/L),用乙腈配制質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃保存。

移取適量5種同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈將13C17-黃曲霉毒素B1、13C24-T-2毒素、13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、13C20-赭曲霉毒素A和13C18-玉米赤霉酮配制成質(zhì)量濃度分別為10、50、100、200和100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃保存。

1.3 樣品前處理

試樣:抽取500 g飼料樣品,用四分法縮減取樣200 g,粉碎后過0.45 mm樣品篩,混勻,裝入密閉容器中,常溫避光保存,備用。

精密稱取2 g(精確到0.01 g)試樣于50 mL離心管中,加入200 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于室溫下靜置1 h后,加入5 mL水,浸泡5 min后,超聲提取40 min,然后加入5 mL含1%(v/v)甲酸的乙腈溶液,渦旋混勻30 s后,超聲提取40 min,加入2.0 g無水硫酸鎂和0.5 g氯化鈉,立即劇烈振搖30 s,超聲10 min,以8 000 r/min離心5 min,移取3 mL上清液,于40 ℃下氮?dú)獯蹈?用1 mL 5 mmol/L醋酸銨水溶液-乙腈(80∶20, v/v)溶解殘渣,渦旋30 s,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,上機(jī)測定。

1.4 分析條件

色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.4mL/min;進(jìn)樣量:3 μL;流動相:A為甲醇,B為5 mmol/L醋酸銨水溶液；梯度洗脫條件:0～0.5 min, 10%A; 0.5～6.0 min, 10%A～90%A; 6.0～6.5 min, 90%A; 6.5～6.7 min, 90%A～10%A; 6.7～8.0 min, 10%A。

離子源:電噴霧離子(ESI)源;正離子、負(fù)離子模式同時掃描;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑溫度:500 ℃(高純氮?dú)?;脫溶劑氣流:1 000 L/h;錐孔氣流:7.0 L/h(高純氮?dú)?;碰撞氣:高純氬氣;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;數(shù)據(jù)分析:MassLynxv 4.1和Targetlynx軟件。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 30種真菌毒素及5種同位素內(nèi)標(biāo)的保留時間(tR)、母離子、子離子和碰撞能量(CE)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

QuEChERS技術(shù)和N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑常被應(yīng)用于多種化學(xué)性質(zhì)不同的真菌毒素的凈化處理中。但PSA吸附劑會通過離子交換作用吸附FB1和FB2,導(dǎo)致其回收率低于20%。因此本實(shí)驗(yàn)選擇QuEChERS技術(shù)作為樣品的前處理方法,并進(jìn)一步優(yōu)化了提取時間、提取溶劑等條件。

2.2 流動相的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了①甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、②甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液和③甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液3種流動相的洗脫效果。結(jié)果表明,當(dāng)選擇流動相①和②時,真菌毒素在ESI+模式下的色譜峰對稱、尖銳,但在ESI-模式下,B型單端孢霉烯族類毒素(如3-ADON和D3G等)的色譜峰形較差,響應(yīng)強(qiáng)度較低；當(dāng)選擇流動相③時,在正、負(fù)離子模式下,30種真菌毒素的色譜峰形和響應(yīng)強(qiáng)度均較好,且保留時間穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液作為流動相。30種真菌毒素(200 μg/L)和5種同位素內(nèi)標(biāo)在基質(zhì)溶液中的總離子流色譜圖見圖1。

圖 2 3-ADON和15-ADON標(biāo)準(zhǔn)品(50 μg/L)在各自離子通道下的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of the 3-ADON and 15-ADON standard sample (50 μg/L) under the corresponding ion channels

圖 1 30種真菌毒素(200 μg/L)和5種同位素內(nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 30 mycotoxins (200 μg/L) and five internal standards13C17-AFB1: 2 μg/L; 13C24-T-2: 10 μg/L; 13C15-DON: 20 μg/L; 13C20-OTA: 40 μg/L; 13C18-ZEN: 20 μg/L.

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過對每種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析,分別在ESI+及ESI-模式下通過全掃描確定每種真菌毒素的母離子,并通過優(yōu)化碰撞能量,選擇相對豐度最高的離子作為定量離子,相對豐度次之的離子作為定性離子。在ESI+條件下,真菌毒素的母離子主要為[M+H]+和[M+NH4]+,在ESI-條件下,真菌毒素的母離子主要為[M-H]-和[M+CH3COO]-。由于3-ADON和15-ADON具有相同的分子式和相對分子質(zhì)量,所以正離子模式下兩種化合物有著相同的母離子和子離子,意味著在此情形下二者不能準(zhǔn)確定量。通過比較正、負(fù)離子模式下不同的母離子、子離子及碰撞電壓等質(zhì)譜條件,最終確定15-ADON采用ESI+掃描模式,3-ADON采用ESI-掃描模式。為進(jìn)一步確認(rèn)兩種化合物的離子通道不會相互干擾而影響定量,分別對兩種化合物的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器分析,結(jié)果顯示,3-ADON和15-ADON在各自的離子通道下幾乎不存在相互干擾(見圖2)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評估及內(nèi)標(biāo)物的確定

本文分別對預(yù)混料、濃縮料和配合料樣品中的30種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評價,結(jié)果顯示,預(yù)混料、濃縮料和配合料基質(zhì)中,真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)分別為1.1%～72.2%、1.2%～80.8%和0.1%～81.5%(見表S1,詳見http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1702010-SI.pdf)。30種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)較大,為基質(zhì)抑制效應(yīng),可導(dǎo)致檢測方法的回收率偏低,降低了方法的準(zhǔn)確度,因此必須通過基質(zhì)加標(biāo)的方法進(jìn)行校正。然而基質(zhì)加標(biāo)后,采用外標(biāo)法計算得到的回收率(41.3%～127.9%)仍具有較大差別(具體結(jié)果見表S2,詳見http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1702010-SI.pdf),并不能滿足檢測需求,因此必須采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。將5種同位素內(nèi)標(biāo)的回收率與表S2中30種真菌毒素的絕對回收率進(jìn)行比較,其回收率值相近的作為相應(yīng)真菌毒素的內(nèi)標(biāo),如13C17-AFB1的回收率與AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC的絕對回收率接近,用以校正該組目標(biāo)物前處理過程的損失及基質(zhì)效應(yīng),具體分組情況見表1。

表 2 不同飼料中30種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of the compound to the internal standard;x: mass concentration, μg/L.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

以目標(biāo)真菌毒素含量少的樣品作為空白樣品,將適量的30種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和120 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液混合,配制不同線性范圍的系列空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為①2～200 μg/L的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、SMC、OTA和DAS溶液;②10～500 μg/L的D3G和PAT溶液;③10～500 μg/L的DA、TEN、ZEN、ZAN、α-ZAL、α-ZOL、β-ZAL和β-ZOL溶液;④50～1 000 μg/L的15-ADON、3-ADON、CIT、DON、FB1、FB2、Fus X、HT2、MPA、NEO和T-2溶液)，建立了30種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表2。30種真菌毒素在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)均≥0.99。以定性通道的3倍信噪比(S/N)確定化合物的檢出限(LOD)、定量通道的10倍信噪比確定化合物的定量限(LOQ),檢出限和定量限分別為0.7～20 μg/L和2～50 μg/L,滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求[6-8]。

2.5.2 回收率和精密度

取空白飼料樣品,將30種真菌毒素按低、中、高3個水平進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),結(jié)果見表3。30種真菌毒素在低、中、高添加水平下的回收率為72.0%～118.4%(n=5)。分別在一天內(nèi)和連續(xù)的5天進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),30種真菌毒素的日內(nèi)和日間精密度見表S3(詳見http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1702010-SI.pdf)。結(jié)果表明,30種真菌毒素的日內(nèi)和日間精密度為2.0%～11.9%和5.0%～17.8%(n=5)。

2.6 實(shí)際樣品分析

采用建立的UHPLC-MS/MS方法對38份飼料樣品進(jìn)行分析,其中一份陽性樣品的MRM色譜見圖3。38份飼料中均含有真菌毒素,含量為60.3～2 989.6 μg/kg(見表S4,詳見http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/1702010-SI.pdf)。其中,有31份飼料被DON污染,含量為59.3～576.8 μg/kg;有21份飼料被15-ADON污染,含量為62.3～984.3 μg/kg;有7份飼料被D3G污染,含量為27.8～127.1 μg/kg;另外,在不同的飼料中還發(fā)現(xiàn)了FB1、FB2、ZEN、β-ZOL、PAT和AFB1等真菌毒素。

表 3 不同飼料中30種真菌毒素的加標(biāo)回收率(n=5)

Low, medium and high levels: AFB1, AFG2, AFM1, AFM2, DAS, OTA and SMC were 2, 5 and 50 μg/kg, respectively; D3G, DA, PAT, TEN, ZEN, ZAN,α-ZOL,β-ZOL,α-ZAL andβ-ZAL were 10, 50 and 100 μg/kg, respectively; 3-ADON, 15-ADON, CIT, DON, FB1, FB2, Fus X, HT2, MPA, NEO and T-2 were 50, 200 and 500 μg/kg, respectively.

圖 3 (a)5種真菌毒素在標(biāo)準(zhǔn)品溶液(50 μg/L)和(b)典型陽性飼料樣品中的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of the five mycotoxins in (a) a standard solution (50 μg/L) and (b) a typical positive feed sample

3 結(jié)論

本研究基于QuEChERS前處理技術(shù),建立了UHPLC-MS/MS同時檢測不同飼料樣品中30種真菌毒素的方法。本方法具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),分析結(jié)果滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的要求,適用于預(yù)混料、濃縮料和配合料中30種真菌毒素的定量分析,也可為其他基質(zhì)中多種真菌毒素含量的同時檢測提供技術(shù)支持。

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Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program of China (No. G20140302).

Simultaneous determination of 30 mycotoxins in different feed products by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

FAN Zhichen1, HAN Zheng2, GUO Wenbo2, ZHAO Zhihui2*

(1.CollegeofFoodScience&Technology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China; 2.InstituteforAgro-FoodStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China)

A method for the simultaneous determination of 30 mycotoxins in different feed products was developed using a QuEChERS pretreatment procedure coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The samples were extracted with 5 mL water and 5 mL acetonitrile containing 1% (v/v) formic acid. An aliquot of the supernatant was dried by nitrogen gas, re-dissolved by 1mL water containing 5 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile (80∶20, v/v), and analyzed by UHPLC-MS/MS. Matrix-matched calibration curves and internal standards were used for accurate quantification. Satisfactory recoveries at low, medium and high spiked levels were ranged from 72.0% to 118.4% (n=5). Good linear relationships were obtained, the correlation coefficients (r2) were greater than 0.99. The limits of detection (LODs,S/N=3) and the limits of quantification (LOQs,S/N=10) ranged from 0.7 μg/L to 20 μg/L and from 2 μg/L to 50 μg/L, respectively. The proposed method is simple, rapid and valuable, which can be a powerful tool for quantitative analysis of the 30 mycotoxins in premixed feed, concentrated feed and formula feed products.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS); QuEChERS; mycotoxins; feed

10.3724/SP.J.1123.2017.02010

2017-02-12

滬農(nóng)科攻字(2014)第3-2號(G20140302).

O658

A

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