大麻THCA合成酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

姜穎，潘冬梅，李秋芝，王曉楠，韓承偉，曹錕，韓喜財(cái)

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

大麻THCA合成酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析

姜穎，潘冬梅，李秋芝，王曉楠，韓承偉，曹錕，韓喜財(cái)

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

[目的]為了得到不能產(chǎn)生任何有活性的THC基因型大麻株系，本試驗(yàn)對四氫大麻酸(THCA)合成酶基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，這為深入研究CsTHCA的功能提供理論基礎(chǔ)。[方法]以大麻品種“火麻一號”為材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆THCA合成酶基因(CsTHCA)并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]該基因開放閱讀框全長1 638 bp，編碼545個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸序列在309～760 bp處與野生種花生和蔓花生序列一致性達(dá)74%。理化特性分析發(fā)現(xiàn)此蛋白為疏水蛋白且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析預(yù)測該蛋白質(zhì)序列中有跨膜區(qū)域，大部分組成為疏水性氨基酸。[結(jié)論]本文從大麻中克隆了THCA基因并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，可為后續(xù)分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

大麻；CsTHCA； 基因克??； 生物信息學(xué)

大麻渾身是寶，可從農(nóng)業(yè)種植延伸到紡織、服裝、造紙、軍需、化工、新型建材、生物能源、食品保健、醫(yī)藥、飼料等十幾個(gè)產(chǎn)業(yè)鏈，大麻產(chǎn)品在許多國家得到廣泛應(yīng)用。近年來，隨著人們回歸自然，更加重視環(huán)保和健康等理念，對大麻的產(chǎn)品特性有了深入的了解，世界各國對大麻資源的利用與開發(fā)越來越重視[1～7]。然而，由于大麻中含有一種致幻成癮的活性成分—四氫大麻酚(THC)，易被不法分子用來非法生產(chǎn)毒品，造成社會(huì)危害，許多國家把工業(yè)大麻也一并列為禁種作物。受生長環(huán)境和栽培條件的影響，大麻THC含量在個(gè)體之間存在差異。在不同的種植模式、播種時(shí)期、肥料、光照因素的影響下, 不同大麻材料的THC含量會(huì)有所不同[8～10]。早在1995年就發(fā)現(xiàn)了THC生物合成關(guān)鍵酶四氫大麻酸(THCA)合成酶，為單體脫氫酶，可催化由戊基間苯二酚酸到四氫大麻酸A的氧化環(huán)化反應(yīng)[11]。目前，有關(guān)THCA合成酶基因的克隆及其生物信息學(xué)分析的報(bào)道較少。本研究對大麻THCA合成酶基因進(jìn)行了基因克隆及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大麻品種“火麻一號”由黑龍江省科學(xué)院大慶分院所提供。取自花期的葉片、雄花、雌花，將其混合，保存于-80 ℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA鏈的合成

參照TRizol總RNA提取試劑盒(ProbeGene公司)提取總RNA，利用第一鏈cDNA Synthesis Kit (ProbeGene公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 RT-PCR獲得THCA mRNA編碼序列

根據(jù)GenBank上已知大麻THCA序列(GenBank: AB057805.1)，使用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工公司完成。PCR擴(kuò)增的50 μL反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：模板4 μL，引物Cs-THCA ApaF 1 μL，引物Cs-THCA SacR 1 μL，2×Taq Master Mix(ProbeGene公司) 25 μL，ddH2O 19 μL。94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min 20 s)35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.3 THCA 片段膠回收

利用上海生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收目標(biāo)基因片段并送由測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用DANMAN、EditSeq、ProtParam、SMART和TMHMM軟件分別進(jìn)行基因序列、蛋白理化性質(zhì)、蛋白同源性和蛋白結(jié)構(gòu)功能域分析。

Cs-THCA開放閱讀框擴(kuò)增引物(上海生工合成)為：Cs-THCA ApaF: GGGCCC ATGAATTGCTCAGCATTTTC 和 Cs-THCA SacR: GAGCTCTTAATGATGATGCGGTGG AAG

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取與檢測

用TRizol總RNA提取試劑盒提取的大麻混合組織總RNA，可看見清晰的28 s和18 s RNA，亮度寬度適宜(圖1)。

圖1 大麻RNA提取Fig.1 RNA extraction of hemp

2.2 THCA cDNA基因的獲得

以大麻cDNA為模板，利用引物Cs-THCA ApaF和Cs-THCA SacR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到預(yù)期大小的片段(圖2)。

圖2 CSTHCA全長cDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of CsTHCA full length cDNA 注：M：分子量標(biāo)準(zhǔn)D2000；1-2：PCR產(chǎn)物Note：M: D2000 DNA ladder; 1-2: PCR products

2.3 大麻THCA cDNA基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 CsTHCA基因的序列分析

經(jīng)過PCR擴(kuò)增和測序獲得了CsTHCA的cDNA序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。DNAMAN軟件分析顯示該基因開放閱讀框全長1 638 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖3)，EditSeq軟件分析發(fā)現(xiàn)其堿基組成為：A 32.60%、G 19.72%、T 30.46%、C 17.22%，共編碼545個(gè)氨基酸序列。

2.3.2 CsTHCA蛋白的理化性質(zhì)分析

ProtParam軟件分析發(fā)現(xiàn)，CsTHCA編碼545個(gè)氨基酸，分子式為C5090H8544N1638O2138S282，分子量為13.59 KD，理論等電點(diǎn)pI=5.02，不穩(wěn)定系數(shù)為39.44。脂肪系數(shù)為32.60，總平均親水性值為0.725。

2.3.3 CsTHCA蛋白同源性分析

蛋白同源序列比對顯示，推導(dǎo)的氨基酸序列在309 bp～760 bp處與野生種花生(XM_016102005)和蔓花生(XM_016337459)的一致性均為74% (圖4)。

圖4 CsTHCA蛋白同源序列比對Fig.4 The sequence homology analysis of CsTHCA protein

2.3.4 CsTHCA蛋白的結(jié)構(gòu)功能域分析

用SMART和TMHMM軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析表明：在一個(gè)含有545aa的蛋白質(zhì)序列中，在5～27位之間是跨膜區(qū)域；在180～191位之間為SEG結(jié)構(gòu)域，檢測是含有低復(fù)雜性成分序列的區(qū)域(圖5) (圖6)。

圖5 CsTHCA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測Fig.5 Structure domain of CsTHCA protein

圖6 CsTHCA蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域Fig.6 Transmembrane region of CsTHCA protein

3 討論與結(jié)論

逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)是一種獲得目的基因比較簡單而且實(shí)用的方法，它可以不用構(gòu)建cDNA文庫，但需要知道該目的基因的cDNA或mRNA的序列信息，通過已知的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可獲得，因此該方法主要適合于對已經(jīng)知道的DNA序列的克隆或不同物種的高度保守基因的克隆[12]。本研究已知大麻THCA序列(GenBank: AB057805.1)，以“火麻一號”為材料，通過RT-PCR 方法分離了THCA四氫大麻酚合成酶基因(CsTHCA)。。生物信息學(xué)(Bioinformatics)，它是將實(shí)驗(yàn)技術(shù)與電腦信息相結(jié)合，以分析核苷酸序列的各種形式和存在的功能以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等，進(jìn)而為后續(xù)研究工作提供便利[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)該基因開放閱讀框全長為1 638 bp，共編碼545個(gè)氨基酸序列。推導(dǎo)的氨基酸序列在309 bp～760 bp這段序列與野生種花生和蔓花生具有74%的相似性，其表明可能在某些性狀及功能上與花生相似，這為大麻的研究提供了更為廣闊的方向。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)用來判定該蛋白性質(zhì)穩(wěn)定與否，<40表示蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，>40表示蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定[15]。CsTHCA蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為39.44，表明此蛋白性質(zhì)穩(wěn)定?？偲骄H水性值為0.725，表明其為疏水性蛋白。平均疏水性為氨基酸序列中所有氨基酸螺旋段親水值的總和與氨基酸數(shù)量的比值，負(fù)值越小表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)[16]。蛋白質(zhì)序列中跨越細(xì)胞膜的區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)域，通常為α-螺旋結(jié)構(gòu)，約20～25個(gè)氨基酸殘基，構(gòu)成其蛋白質(zhì)的氨基酸大部分是疏水性氨基酸[17]。CsTHCA蛋白跨膜區(qū)域?yàn)?3個(gè)氨基酸殘基，是疏水性氨基酸，這與之前的理化性質(zhì)分析相符。本研究進(jìn)行的CsTHCA基因克隆和生物信息學(xué)分析可為深入研究其功能奠定基礎(chǔ)。

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(編輯：馬榮博)

Cloning and bioinformatics analysis of THCA synthase gene in hemp (CannabissativaL.)

Jiang Ying, Pan Dongmei, Li Qiuzhi, Wang Xiaonan, Han Chengwei, Cao Kun, Han Xicai

(DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,Daqing163319，China)

[Objective] The test was to obtain hemp strain which do not contain any THC. Cloning and bioinformatics analysis of THCA synthase gene could be helpful to facilitate the functions understanding of hemp THCA synthase.[Methods] The full-length THCA synthase cDNA sequence was cloned using RT-PCR from hemp variety “Huoma 1” andCsTHCAcoding protein was analyzed by bioinformatics software.[Results] The open reading frame ofCsTHCAwas 1638bp in length and encoded 545 animo acids. The sequence homology analysis showed that CsTHCA protein had 74% similarity with that of wildArachisipaensisandArachisduranensisat the location of amino acids 309 bp to 760 bp. Physical and chemical properties analyzing revealed that this protein was hydrophobic protein with stable character. The analysis of protein structure and function domain indicated that this protein had transmembrane region, and most amino acids were hydrophobic. [Conclusion] TheCsTHCAwas cloned from hemp and was analyzed by bioinformatics. That could provide a theoretical basis for the study of the molecular mechanism.

CannabissativaL.，CsTHCA， Gene clone， Bioinformatics analysis

2016-11-09

2017-01-20

姜穎(1986-)，女(漢)，吉林通化人，助理研究員，碩士，研究方向：大麻遺傳育種

黑龍江省青年科學(xué)基金(QC2016037)

S336

A

1671-8151(2017)05-0326-04