維吾爾族、漢族宮頸病變組織中HPVl6E6、E7蛋白表達研究

韓莉莉　劉曉婉　昆多孜

摘要 目的：探討維、漢族宮頸組織中HPVl6E6、E7蛋白表達差異以及引起宮頸病變中的作用機制。方法：收集宮頸組織123例，檢測HPV-DNA、E6、E7蛋白。結果：維吾爾族、漢族E6、E7蛋白在不同等級宮頸病變中表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）。維吾爾族不同等級宮頸病變組織HPV陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）。結論：維、漢族宮頸病變組織中HPVl6E6、E7蛋白陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義，維吾爾族中隨著宮頸病變級別增加，HPV陽性率增加，E6、E7蛋白檢測可預測宮頸病變進展及預后。

關鍵詞 宮頸病變；E6、E7蛋白；HPV

1992年WHO宣布人類乳頭狀瘤病毒（HPV）是引起宮頸癌變的首要因素。HPV兩個早期編碼框架E6/E7基因的表達產(chǎn)物E6/E7原癌蛋白在腫瘤發(fā)生、細胞周期調(diào)控及凋亡調(diào)節(jié)中起重要作用，是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因。但有關癌組織中E6/E7蛋白表達在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相互關系仍有爭論。本研究通過研究HPVl6E6、E7蛋白與宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生與發(fā)展以及與宮頸癌相關性，為宮頸癌早期診斷與早期防治提供新的手段。

資料與方法

2010年9月-2013年3月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科門診及住院患者手術或活檢存檔蠟塊，其中鱗癌51例，年齡26～65歲；宮頸上皮內(nèi)瘤變CIN I級22例，年齡24～56歲；CINⅡ～Ⅲ期40例，年齡35～65歲，宮頸炎30例，年齡21～56歲。采取全部患者標本后甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，確定病理學診斷、組織學類型；患者均為無宮頸手術史、未行過宮頸物理治療及干擾素治療、受試時未懷孕、無化療史及骨盆放射治療史的婦女。入選病例均經(jīng)病理診斷明確。

方法：切除部分標本經(jīng)過甲醛充分固定、取材并常規(guī)脫水、透明后，以石蠟包埋備用。全部標本均經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，4um厚，以備常規(guī)病理和免疫組化用；一抗HPV16E6、E7鼠抗人多克隆抗體購自北京博奧森，二抗試劑盒（兔抗鼠）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購自北京中山生物公司；實驗方法采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法，HPVl6E6、E7-抗?jié)舛?：100，二抗為即用型工作液，DAB顯色，伊紅染液復染。染色步驟嚴格按試劑盒說明書進行，分別用已知宮頸癌陽性切片做陽性對照，以磷酸緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

判斷標準：HPV16E6/E7蛋白以胞質、細胞核和核周緣出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。在高倍鏡下（400×）對每張切片隨機選擇了5個視野，共計1 000個腫瘤細胞，其中陽性細胞數(shù)<5%為陰性（-），陽性細胞數(shù)5%～10%為弱陽性（+），陽性細胞數(shù)11%～50%為中度陽性（++），陽性細胞數(shù)>50%為強陽性（+++）。統(tǒng)計陽性表達的例數(shù)，并進行比較分析。

統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.0進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

維吾爾族、漢族不同宮頸病變級別中E6、E7蛋白陽性率比較：漢族E6蛋白在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組陽性表達率分別為0.00%（0/0）、23.08%（3/48）、55.56%（10/48）、100%（6/48）；維吾爾族E6蛋白在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組的陽性表達率分別為5.26%（1/75）、44.44%（4/75）、72.73%（16/75）、100%（24/75）；漢族E7蛋白在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組陽性表達率分別為0.00%（0/0）、23.08%（3/48）、72.22%（13/48）、100%（6/48）；維吾爾族E7蛋白在宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組陽性表達率分別為10.53%（2/75）、33.33%（3/75）、68.18%（15/75）、100%（92/75）。維吾爾族、漢族E6、E7蛋白在不同等級宮頸病變中表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005）。見表1～4。

維吾爾族、漢族宮頸不同病變級別HPV陽性率比較：漢族患者中在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸癌組HPV陽性率分別為91.30%（10/11）、100.00%（13/13）、87.50%（14/16）、83.33%（5/6）；維吾爾族患者在宮頸炎、CIN Ⅰ、CINⅡ一Ⅲ級、宮頸癌組HPV陽性率分別為31.58%6/19）、88.89%（8/95）、81.82%（18/22）、100%（25/25）。其中維吾爾族不同等級宮頸病變組織HPV陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.005），見表5、6。

討論

宮頸癌危害著女性身體健康，女性發(fā)病率高的生殖道惡性腫瘤中宮頸癌排在第1位。目前國內(nèi)外研究者從RNA、DNA和蛋白水平等其他方面不斷研究子宮頸癌的發(fā)病機制和早期防治。HPV感染機體的宿主細胞后，在宿主細胞中HPV基因組是兩種存在狀態(tài)：游離狀態(tài)和整合狀態(tài)。在良性宮頸病變中HPVDNA大多以游離狀態(tài)存在，但在惡性病變中多數(shù)是以整合狀態(tài)存在。而且低危型HPV DNA游離狀態(tài)多，幾乎不整合到宿主細胞的基因組中去，但絕大多數(shù)高危型HPV DNA能整合到宿主細胞DNA中，會引起基因突變、缺失，許多抑癌基因和癌基因的表達被干擾，進一步加快了CIN進展為宮頸浸潤癌的可能性。一般HPV感染的早期，HPV病毒癌基因表達水平低，在病毒基因組不斷整合到宿主基因組的過程中，HPVE6/E7mRNA會出現(xiàn)持續(xù)的高水平轉錄，E6、E7癌蛋白被大量表達，促使宮頸病變繼續(xù)發(fā)展為宮頸癌。

HPVE6癌蛋白各個型別的蛋白中都存在一個鋅指結構Cys-x-x-Cys。P53和E6關聯(lián)蛋白（E6-AP）的結合可以影響細胞周期。P53是細胞周期調(diào)控、凋亡控制和基因轉錄過程中一個關鍵的蛋白。HPV陽性的細胞主要靠E6關聯(lián)蛋白介導降解，在出現(xiàn)刺激或者DNA損傷時，P53會被正常細胞激活，由于下游基因的轉錄被抑制，細胞停滯在s期，DNA經(jīng)過修復進入細胞周期；完成有絲分裂；但高危型HPVE6的細胞可以通過降解P53，使細胞略過檢驗點G1/S，這些細胞積累了損傷的DNA，繼續(xù)進入細胞周期，引起基因組的不穩(wěn)定性。

E6和E7蛋白都有單獨引起人類細胞的永生化的能力，但E6、E7同時表達時有協(xié)同作用一，它們協(xié)同后使細胞周期脫耦聯(lián)以及中心體復制，紡錘體檢測點功能被干擾，引起基因組完整性變化以及中心體數(shù)目變化，最終引起腫瘤的出現(xiàn)。研究顯示E6蛋白的轉化能力低于E7蛋白，疾病早期E7蛋白表達較多，疾病晚期E6蛋白表達較多，在惡性病變中E6蛋白中表達較多。

本研究發(fā)現(xiàn)在漢族、維吾爾族不同級別宮頸病變組織中E6、E7蛋白的陽性率差異具有統(tǒng)計學意義。隨著宮頸病變級別的增加，HPVl6E6、E7蛋白表達也增加。在維吾爾族患者中隨著宮頸病變級別的增加，HPV陽性率也增加，差異有統(tǒng)計學意義。但在漢族不同宮頸病變級別中HPV陽性率差異無統(tǒng)計學意義，可能和樣本偏少有關。建議臨床在開展HPVDNA檢測的同時，必要時做HPVl6E6、E7蛋白檢測，特別對于HPV持續(xù)感染者有較顯著的意義，為宮頸癌的早期診斷和預防提供一種新的預警手段。