MCPIP1和IL-17c在尋常型銀屑病皮損中的表達

姚婉玉 唐秀生

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·論著·

MCPIP1和IL-17c在尋常型銀屑病皮損中的表達

姚婉玉 唐秀生

目的： 檢測MCPIP1和IL-17c在尋常型銀屑病患者皮損中的表達。方法： Real-time PCR及免疫熒光檢測45例尋常型銀屑病患者皮損及19例正常皮膚中MCPIP1和IL-17c mRNA及蛋白表達水平，皮爾遜相關系數(shù)分析MCPIP1和IL-17c的相關性。結果： 銀屑病組MCPIP1、 IL-17c mRNA相對表達量分別為0.8497±0.0661和0.4027±0.04158，對照組中分別為0.2921±0.06135和0.2374±0.02525， 差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MCPIP1和IL-17c mRNA水平具有明顯相關性(P<0.05)?；颊呓M皮損中MCPIP1和IL-17c的蛋白表達水平高于正常對照組。結論： MCPIP1和IL-17c可能共同影響尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展。

尋常型銀屑病； MCPIP1； IL-17c

銀屑病是一種多基因遺傳背景下的慢性炎癥介導的皮膚病。白介素-17(Interleukin-17，IL-17)家族在銀屑病中的作用備受矚目，諸多研究表明T輔助細胞17(T help cell 17，Th17)細胞及相關細胞因子IL-17在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]?？笽L-17a的抗體在治療斑塊狀銀屑病、銀屑病型關節(jié)炎中效果明顯[2]。IL-17c主要由上皮細胞分泌并介導一系列抗炎、抗凋亡的基因行使發(fā)揮功能。文獻報道在銀屑病患者皮損中IL-17c的蛋白濃度比IL-17a的濃度高125倍左右[3]。另外，小鼠角質形成細胞特異性的高表達IL-17c能夠引起一自發(fā)的銀屑病皮損表型[3]。這些都提示我們IL-17c在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中有著舉足輕重的作用。

單核細胞趨化蛋白-1誘導蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 induced protein-1, MCPIP1)由ZC3H12A基因編碼，又稱regnase-1，是MCPIP家族中的一員，該家族成員的標志性特征是都含有一個CCCH鋅指結構[4]。MCPIP1是重要的負相調控炎癥因子的蛋白，這種調控主要通過識別如IL-6等炎癥因子的mRNA 3’-UTR莖環(huán)結構實現(xiàn)[5]，研究證實：MCPIP1也可負相調控T細胞關鍵因子IL-2，從而參與T細胞介導的適應性免疫應答[6]。Monin等[7]提出在皮膚炎癥反應中，MCPIP1能負性調控IL-17c信號轉達。因此，我們采用實時定量RT-PCR及免疫熒光法，對45例尋常型銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17c的蛋白與mRNA的表達水平進行研究，對MCPIP1及細胞因子IL-17c的表達及兩者間的相關性與其在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用進行初步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 45例患者均來自2015年4月至2016年10月我院收治的尋常型銀屑病患者，符合尋常型銀屑病診斷標準[8]，且無腫瘤、自身免疫病、重度感染、嚴重肝腎功能障礙等合并癥。其中男29例，女16例，年齡14～69歲，平均34.52歲；發(fā)病年齡11天～35年，平均7.3年；有家族史6例，無家族史39例；45例中28例為首發(fā)患者，未曾接受過任何治療，有9例患者近3個月內(nèi)未接受糖皮質激素、免疫抑制劑及外用藥治療。采用通用的銀屑病皮損面積和嚴重程度評分法(PASI)對所收集的尋常型銀屑病患者進行病情嚴重程度評分。為保證PASI評分的一致性和客觀性，所有患者的PASI評分均由同一實驗者來完成。45例入組患者的評分3.5～26.8，平均11.00。正常對照組19例來自本院整形及皮膚外科手術切除的正常皮膚，均無免疫系統(tǒng)疾病及相關家族史。其中男8例，女11例，年齡20～59歲，平均29.73歲，銀屑病患者組及正常對照組在年齡、性別上差異無顯著統(tǒng)計學意義。實驗經(jīng)我院倫理委員會審核批準，入選患者均已簽署知情同意書。取材后，將標本分為2份，一份立即置于液氮中冷凍保存，另一份置于10%福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 試劑 Trizol購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)(日本Takara公司)，MCPIP1和IL-17C的引物均購自生工，MCPIP1抗體(Abcam公司)，IL-17c抗體(Abcam公司)，驢抗兔IgG二抗，Alexa Fluor?594 conjugate(Life公司)，羊抗鼠IgG二抗，Alexa Fluor?488 conjugate(Life公司)。

1.3 實時定量PCR檢測患者與對照組皮損組織中MCPIP1和IL-17c mRNA表達

1.3.1 總RNA的抽提 將儲存在液氮的一部分皮膚組織(100 mg)分別加入1 mL Trizol，嚴格在無酶條件下手工抽提總RNA。樣本于-80℃冰箱凍存。紫外分光光度法檢測RNA濃度(U/μL )，計算A260/A280比值，檢測RNA濃度。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

1.3.2 逆轉錄反應將RNA從-80℃冰箱取出，按照試劑盒說明書分別完成以下兩步：第一去除基因組DNA，第二逆轉錄反應：加入第一步反應所得體系10 μL，5X PrimeScript Buffer2 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，加無酶水至20 μL，混勻后瞬時離心，37℃反應15 mins，85℃ 5 sec終止反應，得到的cDNA-20℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M行PCR擴增。

1.3.3 Real-time PCR(實時熒光定量PCR) 依照SYBR? Premix Ex TaqTM(日本Takara公司)試劑說明書進行實驗操作。使用Light Cycler96熒光定量PCR儀，檢測MCPIP1和IL-17c mRNA的表達，目的及內(nèi)參GAPDH Real-time PCR上下游引物(表1)。

1.3.4 免疫熒光檢測患者與對照組皮損組織中MCPIP1和IL-17c的表達 將所得標本常規(guī)進行石蠟包埋并切制成厚度為0.4 μm的連續(xù)切片。檢測前進行脫蠟、梯度酒精脫水，檸檬酸高壓熱修復，5% BSA室溫封閉1 h，按照產(chǎn)品說明書分別滴加1% BSA配置MCPIP1和IL-17c的一抗，4℃孵育過夜，第二天取出PBS清洗后，分別使用相對應的二抗室溫孵育1 h，PBS再次洗滌三次，每次5 min，DAPI核染后，顯微鏡下觀察熒光成像。

表1 Real-time PCR引物

1.3.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS18.0 for windows統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為組間差異有統(tǒng)計學意義。采用皮爾遜相關系數(shù)(Pearson correlation coefficient)分析其相關性，P<0.05認為具有相關性。

2 結果

2.1 皮損中MCPIP1和IL-17c的轉錄水平及相關性分析 銀屑病患者組皮損中MCPIP1 mRNA的相對表達值0.8497±0.0661，正常對照組為0.2921±0.06135，P<0.005(圖1a)；銀屑病患者組皮損中IL-17c mRNA相對表達量為0.4027±0.04158，正常對照組為0.2374±0.02525，P<0.005(圖1b)。銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17A mRNA的表達值均明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義。其中，通過相關性分析可知MCPIP1和IL-17A的表達密切相關，r=-0.7744，P<0.0001，有統(tǒng)計學意義(圖2)。

2.2 皮損中MCPIP1和IL-17c蛋白的表達情況 正常對照組皮損中見少量散在分布的IL-17c熒光染色的細胞(圖3a)；銀屑病組皮損中的IL-17c呈熒光染色的細胞較正常對照組明顯增多(圖3b)。同時，銀屑病患者組MCPIP1表達也較正常對照組明顯增多(圖4a，圖4b，圖5a，圖5b)。

圖1 MCPIP1(1a)和IL-17c(1b)在銀屑病和正常對照皮損中的mRNA的表達情況。銀屑病患者：N正常對照=30：19(**P<0.01) 圖2 MCPIP1和IL-17c表達的相關性分析

圖3 IL-17c在銀屑病(3a)和正常對照(3b)皮損中的表達情況，其中綠色顯示為IL-17c，藍色為DAPI(×400)

圖4 MCPIP1在銀屑病(4a)和正常對照(4b)皮損中的表達情況，其中紅色顯示為MCPIP1，藍色為DAPI(×400)

圖5 IL-17c(5a)和MCPIP1(5b)在銀屑病和正常對照皮損中的表達情況(**P<0.01)

3 討論

本研究通過實時定量反轉錄PCR和免疫熒光的方法對尋常型銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17c的mRNA和蛋白表達水平進行檢測與定量分析，與對照組相比，銀屑病皮損中MCPIP1和IL-17c的表達水平明顯增強。

IL-17c在銀屑病的炎癥浸潤中發(fā)揮著重要的作用。有研究證明：銀屑病小鼠模型揭示IL-17家族細胞因子參與調節(jié)銀屑病的發(fā)展。同樣，給咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠皮下注射IL-17c會引起皮膚內(nèi)淋巴細胞募集增多[9]；在同樣予以咪喹莫特處理的小鼠中，IL-17c敲除小鼠較對照鼠而言，所誘導的銀屑病癥狀明顯減輕[9]。此外，在角質形成細胞中過表達IL-17c會自發(fā)產(chǎn)生類似人類銀屑病樣皮損[3]。另有研究報道，IL-17a和IL-17c在人類銀屑病皮損的表達明顯增高[7]，這與本研究中實時熒光定量PCR和免疫熒光的結果一致。

全基因組關聯(lián)分析確定了一系列和銀屑病相關的免疫相關通路上的調節(jié)因子，據(jù)報道ZC3H12A基因上有11個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，但是并沒有發(fā)現(xiàn)這些位點和人類疾病之間的關聯(lián)[10]。雖然MCPIP1在銀屑病患者的皮損中表達升高已經(jīng)得到證實，且與我們的結果相同，但ZC3H12A是不是IL-17的靶基因仍有待研究驗證，據(jù)Monin等[7]報道皮膚炎癥反應中，MCPIP1能抑制IL-17c信號傳導，這也間接證明了我們的結論。

本文通過對尋常型銀屑病患者皮損中MCPIP1和IL-17c的檢測,發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病皮損中MCPIP1和IL-17c的表達明顯升高，提示MCPIP1和IL-17c的水平與銀屑病的病程變化和發(fā)展有關, 可以用來協(xié)助銀屑病的診斷和治療。本研究對MCPIP1和IL-17c在銀屑病患者皮損中的表達及相關性進行了初步探討, 其對銀屑病發(fā)病的影響及與其他趨化因子和細胞因子相互作用的機制,尚有待于更深入的研究。

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(收稿：2016-12-28 修回：2017-02-18)

·病例報告·

Expression of MCPIP1 and IL-17c in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris

YAOWanyu,TANGXiusheng.

DepartmentofDermotology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,Guangxi,China

TANGXiusheng,E-mail:tangxsh6199@126.com

Objective: To detect the expression of MCPIP1 and IL-17c in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris. Methods: The expression levels of MCPIP1 and IL-17c mRNA and protein in the lesions of the patients with psoriasis vulgaris and the normal skin samples in 19 controls were detected by Real-time PCR and immunofluorescence technique. The association between the levels of MCPIP1 and IL-17c in the patients were assessed by Pearson correlation coefficient. Results: The level of MCPIP1 and IL-17c in the lesions was 0.8497±0.0661 and 0.4027±0.04158, which was higher than those in controls (0.2921±0.06135 and 0.2374±0.02525) with significant differences (P<0.05). There was obvious correlation between the level of MCPIP1 and IL-17c mRNA. The protein level of MCPIP1 and IL-17c in the lesions was higher than that in normal controls. Conclusion: MCPIP1 can interact with IL-17c, which influences the development of psoriasis.

psoriasis vulgaris; MCPIP1; IL-17c

右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西百色，533000

唐秀生，E-mail: tangxsh6199@126.com